COMATOGRAFIA DE ELUSION

Definición.
La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a
separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase
estacionaria o lecho estacionario) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en
una dirección definida.

El proceso cromatográfico se da como resultado de la mayor o menor capacidad

para ser retenidos los diferentes componentes de una muestra por la fase
estacionaria, es decir, se basa en los repetidos procesos de interacción durante el
movimiento de los componentes de una mezcla arrastrados por la fase móvil a lo
largo de la fase estacionaria (elución), produciéndose la separación debido a las
diferencias en las constantes de distribución de los componentes de la mezcla
entre la fase estacionaria y la móvil.

La cromatografía de elusión es un proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo

largo de la fase estacionaria transportando los componentes a separar. El proceso
de elución se puede detener mientras todos los componentes de la muestra están
aún en el lecho cromatográfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado (se
prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar", término usado en nomenclaturas
anteriores de cromatografía plana).

Análisis por elución

Procedimiento en el que la fase móvil pasa de forma continua a través o a lo largo

del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta,
como una pequeña cantidad en un tiempo breve. Esta técnica presenta la
desventaja de que los componentes con retenciones muy altas pueden no ser
observados.
Figura 2.4.- Esquema de dispositivo para realizar cromatografía con análisis por
elución.
Principio de operación.
Elución por gradiente

Las separaciones isocráticas usan la misma composición de fase móvil a través de la
separación. Las eluciones isocráticas se usan cuando la mezcla a separar no es muy
compleja o cuando los componentes de la mezcla tienen tiempos de retención muy diferentes. 

Pero para separar mezclas de proteínas, generalmente se requiere de un gradiente de elución
en el que la composición de la fase móvil cambia através del análisis como se indicó
anteriormente.  

El gradiente de elución se recomienda generalmente para:

• Muestras que tengan tiempos de retención semejantes.

• Muestras de peso molecular mayor a 1000.

• Muestras de origen biológico.

Aún cuando se piense utilizar una elución isocrática, es recomendable hacer un primer
análisis por gradiente para determinar el porcentaje del solvente más adecuado. 

En cuanto a los tipos de gradiente, los hay lineales, curvos y escalonados o segmentados. (Figura 5)
Práctica:
Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener
presente dos objetivos:

 Obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor

tiempo posible.
 Asegurar alta precisión y exactitud.

Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir cinco
pasos fundamentales:

 Determinar la composición inicial y final del solvente.

 Ajustar el tiempo del gradiente.
 Determinar la forma del gradiente (lineal, cóncava o convexa).
 Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolución.
 Regresar a las condiciones iniciales la columna.

La bomba envía el solvente a través de caños de diámetro pequeño, generalmente

de acero inoxidable, hacia la válvula inyectora. Esta consiste en una válvula de
varias vías que permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en
un aro o loop de volumen calibrado.
Luego de que se produzca la separación en la columna, los componentes de la
mezcla pasan por el detector. Este produce una señal eléctrica proporcional a la
cantidad de materia y esa señal es enviada al registrador que realiza un gráfico de
intensidad en función del tiempo (cromatograma). Idealmente, se trata de picos
gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El
integrador calcula además el àrea correspondiente a cada pico, la cual es
proporcional a la cantidad de sustancia.
Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los
productos que salen de él. De esta manera, dependiendo del tamaño del loop de
inyección, de la columna, y del tipo de bomba, es posible realizar además de
separaciones analíticas, cromatografías preparativas.
Criterios para la elección del solvente:

 Disponible comercialmente
 Precio
 Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad
de pureza cromatográfica. Bajo contenido de impurezas.
 Disolver la muestra
 Misible con otros solventes para formar mezclas útiles
 No degradar o disolver la fase estacionaria
 Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión
 Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica (cuando se
usan detectores UV)
 Filtración y Desgasificación de solventes
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