TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO: Cod: 1368

UD-5 Técnicas Básicas de Instrumentación:

Fundamentos detexto
Espectrofotometría.
Dra. María del Carmen Herrero Barbudo.
Ciclo Formativo de Grado superior.
Técnico Superior en Laboratorio Clínico y Biomédico.
Curso 2022-23.
Índice
Espectroscopía
• Características de la Luz
• Colores
• ¿Qué es longitud de Onda?
• Relación entre frecuencia, velocidad y longitud de
onda
• Absorción / Absorbitividad
• Las leyes de Lambert y Beer

Espectrofotometría
La espectroscopia es el estudio del espectro
de la luz que emiten los cuerpos,
sustancias y elementos.

De este estudio se puede conocer la

composición, temperatura, densidad,
velocidad de desplazamiento y otros
factores que les son propios y componen a
estos cuerpos, sustancias o elementos
Características de la LUZ

La luz tiene una naturaleza dual:

•Como onda
•Como una corriente de partículas o paquetes de
energía (fotones)
Albert Einstein desarrolló en 1905 la teoría de que
la luz estaba compuesta de unas partículas
denominadas fotones, cuya energía era
inversamente proporcional a la longitud de
onda de la luz.
E= C
l
 3
1

Foton

2
El efecto fotoeléctrico demuestra el comportamiento de la luz
como partícula (gránulos o corpúsculos)
Cuanto más larga la longitud de onda de la luz visible
tanto más rojo el color.
Asimismo las longitudes de onda corta están en la zona
violeta del espectro.
Así todos los elementos existentes poseen un espectro.
Hay varios tipos de espectros, los más comunes son los
espectros continuos, espectros de emisión y los espectros
de absorción.

Si es colocado frente al espectroscopio se podrá ver, un

elemento:
En situaciones en las que se le somete altas temperaturas
y presiones y no se presentan líneas obscuras se trata de un
espectro continuo.
En situaciones normales y se observan unas líneas de
colores frente a un fondo negro, se trata de un espectro
de emisión.
Y por último si sucede la primera situación y entre el elemento
afectado y el espectroscopio se coloca un elemento a
menor temperatura que el primero, se obtiene el
espectro de absorción.
La luz blanca produce al descomponerla
lo que se llama un espectro continuo, que
contiene el conjunto de colores que
corresponde a la gama de longitudes de
onda que la integran.
Todos los elementos poseen un espectro propio, que se
puede medir al someterse a temperaturas elevadas ya que
producen espectros discontinuos .

**Para ver espectros de la tabla periódica buscar en esta página

http://site.ifrance.com/okapi/quimica.htm **
¿Qué es la longitud de onda?

La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se llama

longitud de onda (λ = lambda).

λ
CARACTERÍSTICAS DE LAS ONDAS

nodo
La longitud y la frecuencia de onda son
inversamente proporcionales y se
relacionan mediante la siguiente ecuación

Velocidad de la luz

Longitud de Onda
Frecuencia
 U.V. La luz visible es sólo una
X pequeña parte del
L GAMMA espectro
electromagnético con
u longitudes de onda que
350 nm
z van aproximadamente de
350 nanómetros hasta
v unos 750 nanómetros
i
<nanómetro, nm =
s milmillonésimas de
metro>. 1nM= 1x10 m
i
-9

b
l 750 nm
e Infrarrojo
Microondas
Radio
La luz blanca está compuesta de ondas de diversas frecuencias. Cuando
un rayo de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus
componentes de acuerdo a la longitud de onda
Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se les conoce como
infrarrojas y las mas cortas que el violeta, ultravioletas.

Ultravioleta Luz visible Infrarrojo

102 -104 ~ 104 104-107

UV Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo IR→

4000 A Espectro Visible 7500 A
Relación entre frecuencia, velocidad y longitud de
onda*
Frecuencia natural
Cualquier objeto oscilante tiene una 'frecuencia
natural', (vibración en ausencia de perturbación).

Así Frecuencia, es número de veces que

la onda se repite por segundo.

La Frecuencia se mide en Hertz (Hz)

HEINRICH HERTZ (1857-1894), Investigador alemán que
construyó un dispositivo para generar y detectar en un
laboratorio ondas electromagnéticas, demostrando su
existencia así como, se reflejan estas ondas, se
refractan y se comportan como las ondas de luz

Estimó que la frecuencia n de la onda era de alrededor de 3 x

7
10 Hz. Y determinó que su longitud l era de 10 m. Con estos
valores estableció que la velocidad de la onda es

velocidad =n x l = (3 X 107 Hz) X (10 m)

8
= 3 X 10 m/s = 300 000 km/s

o sea, la velocidad de la luz.

Relación entre Medidas en valores Hertz y Metros
Las ondas electromagnéticas de
frecuencias extremadamente
elevadas, como la luz o los rayos
X, suelen describirse mediante
sus longitudes de onda, que
frecuentemente se expresan en
nanómetros.
➢Un ejemplo es: Una onda
electromagnética con una
longitud de onda de 1 nm tiene,
aproximadamente una frecuencia
de 300 millones de GHz.
 Algunas equivalencias

1m 0.001 mm 10-6 m

nm = mm 0.001m
10-9 m

1Å 0.0001m = 0.1 nm
10-10 m
Proceso de Absorción

La energía de excitación a una molécula

proveniente de un fotón durante el proceso
de absorción se representa así:

A + hn → A* → A + calor
donde:
A es el absorbente en su estado de energía
normal,
A* es el absorbente en su nuevo estado
de excitación energética
hn representan a la constante de Planck y la
frecuencia respectivamente
• La energía del fotón incidente posee
una longitud de onda (l)

• A* es inestable y rápidamente
revierte a su estado energético más
bajo, perdiendo así la energía
térmica correspondiente.

• La absorción de determinadas
longitudes de onda depende de la
estructura de la molécula absorbente
(absortividad, “a”)
Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I0 pasa a
través de una solución, parte de la luz es absorbida resultando que la
luz emergente I es menor que I0

Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)

a a = absortividad
Io
I0
I
c = concentración.
(número de partículas por cm3)
b
Longitud del medio
absorbente o ancho de la
celda
Absortividad (a)

a es una constante de
proporcionalidad que comprende las
características químicas de cada
compuesto, o molécula y su
magnitud depende de las unidades
utilizadas para b y c.
Cuando se expresa la concentración en
moles por litro y la trayectoria a través de
la celda en centímetros, la absortividad se
denomina absortividad molar y se
representa con el símbolo e .

En consecuencia cuando b se expresa en

centímetros y c en moles por litro.
A= e bc Absorbancia es igual a absortividad
molar por longitud del medio absorbente por
concentración

Donde A representa la absorbancia del

compuesto
Ley de Lambert: cuando un rayo de luz
monocromática (I0) pasa a través de un
medio absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente (I) a medida que la
longitud del medio (ancho de la celda)
absorbente aumenta.

I0 I = I0 e-ab
I0 I I I0 I

1 cm. 2 cm. 3 cm.

Ancho de la celda
Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a
través de un medio absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente a medida que la concentración (C) del medio
absorbente aumenta.

I = I0e-ac

I I
I0 I I0 I0
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley de
Beer-Lambert donde la fracción de luz incidente que es
absorbida por una solución es proporcional a la concentración de
soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La
relación entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dará una
idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la
muestra.
Ley de lambert Beer:

I= I0e-abc

Si despejamos: I/I0 = e-abc

Al cociente de las intensidades se denomina
Transmitancia

T = I/I0 = e-abc
Sacando el logaritmo neperiano en ambas expresiones:
Loge I/I0 = abc

Convirtiendo a log10:
Log10 I/I0 = 2.303 abc
Log10 I/I0 = abc

Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

2,303= Ln 10
La Transmitancia (T) es la relación entre la
intensidad de luz transmitida por una
muestra problema (I) con la intensidad de
luz incidente sobre la muestra (Io):

T = I / I0

Se expresa como % T
La absorbancia es directamente
proporcional a la longitud del recorrido
b a través de la solución y la
concentración c del color absorbente.
Estas relaciones se dan como:

A = a·b·c

• A menudo b es dada en términos de cm. y c en

gramos por litro, entonces la absortividad tiene
unidades de l·g–1·cm–1.
 ¿Qué relación guardan la transmitancia
y la absorbancia?

De acuerdo a las características de la

sustancia analizada, la luz que no se
absorbe atraviesa la solución
LUZ
A
B
S Luz transmitida
O

I0 R
B
I
I
D T = I/I0
A
 Por lo tanto la absorbancia es
reciproca de la transmitancia
Absorbancia frente a concentración (comportamiento lineal)

Absorbancia

Concentración

% Transmitancia frente a concentración (pendiente con signo

negativo y comportamiento exponencial)

% Transmitancia

Concentración
 Absorbancia
De lo anterior se desprende que la Absorbancia (A) o luz
que es absorbida por la muestra es igual al logaritmo en
base diez del recíproco de la transmitancia (T) o bien
al -log10 de la transmitancia, en el que el disolvente puro
o (“blanco”) es el material de referencia; esto es:

A = log10 1/T = log101- log10 T = 0 – log10 T = – log10 T

mg
La representación gráfica correspondiente a
absorbancia y transmitancia en un gradiente de
concentraciones es la siguiente:

Concen
tración
Obtención de TRANSMITANCIA utilizando valores de Absorbancia

Con base en la relación: T = 10-abc

y considerando que T se menciona en porcentaje (%)
%T = 10-abc x 100.
Aplicando logaritmos a la expresión anterior
log10 %T = -abc log 10 10 + log10 100
Invirtiendo términos
log %T = log10 100 -abc log 10 10 = 2 – abc * 1
log10 %T = 2 – abc
Como abc = Absorbancia = A
log10 %T = 2 – A.
log10 %T = 2 – A.
Ejemplo:
Una absorbancia de 0.6 ¿a qué equivale en
% T?

Log10 % T = 2 – 0.6 = 1.4

Log10 % T = 1.4

%T = 1 / Log1010 1.4

Aplicando antilog. a

1.4 = 15 % de transmitancia
Obtención de absorbancia a partir de un valor de
% de transmitancia
RECORDANDO:
A = log10 1/T
Ejemplo de cálculo
%T = 30
T = 0.30
Sustituyendo (1/T) 1/0.30 = 3.33
Log10 3.33 = 0.523 de absorbancia
Se le llama espectrofotometría a la
medición de la cantidad de energía
radiante que absorbe un conjunto de
elementos o un elemento en su estado
puro, en función de la longitud de onda
de la radiación lumínica y a las
mediciones a una determinada
longitud de onda.
¿Cómo se puede medir la radiación que emiten o
absorben los cuerpos?.
Un aparato capaz de obtener el espectro de una
radiación, es decir, de separar la radiación en sus
componentes, se llama un espectroscopio.
Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama un
espectrógrafo, y
Si es capaz de medirla diremos que se trata de un
espectrómetro.
Cuando es capaz de medir también la intensidad de
la radiación, se llama espectrofotómetro.
Las técnicas colorimétricas se fundamentan
en la medición de la absorción de radiación
visible por sustancias coloreadas.

Sin embargo, cuando una muestra a

determinar no posee coloración, es
necesario llevar a cabo un tratamiento de
color empleando substancias que reaccionen
de forma proporcional con el compuesto de
interés
Las diferentes sustancias se analizan mediante reacciones
coloreadas. Cuanto mayor es la concentración de la
sustancia a analizar mayor es el color de la reacción.
La diferencia entre colorimetría y
espectrofotometría consiste en el tipo de instrumental
empleado:

El colorímetro es un aparato en los que la longitud de onda se

selecciona por medio de filtros ópticos que son insertados en
este.

En el espectrofotómetro la longitud de onda es seleccionada

mediante dispositivos monocromadores los cuales están
integrados a la máquina.
Algunos de los procedimientos
colorimétricos o espectrofotométricos con
los que se cuenta para precisar la
concentración de una sustancia en solución
son los siguientes:

Referencia de color
Colorímetro Klett
Espectrofotómetro
 M.C.I/2005

FOTOCOLORÍMETRO KLETT / SUMMERSON

Fundamento de colorímetro Klett
Una solución que absorbe el rojo pero no el amarillo y
el azul con la combinación de estos dará un color
verde.

Luz incidente Luz absorbida Luz emergente

Rojo
Amarillo Verde
Azul
Amarillo
Azul }
Por lo anterior podemos aplicar un sencillo
método para precisar con cual filtro podríamos
leer una solución dependiendo el color de esta

Cuando la solución sea roja no se deberá utilizar

un filtro de color rojo porque justamente ese es el
color que no absorbe.

En relación a esto, en el manual del

fotocolorimetro Klett aparece la siguiente tabla que
se puede utilizar para determinar que filtro se
debe emplear de acuerdo al color de la solución a
estudiar:
Color del filtro Rango Soluciones
espectral coloreadas

Azul 400-465 Roja, Naranja,

Amarilla,
Verde, Turbias

Verde 500-570 Roja, Amarilla,

Violeta,
Naranja, Azul

Rojo 640-700 Azul, Verde,

Amarilla
A menudo se hace referencia a la “estrella de colores”
para facilitar el recordar la elección del color de filtro
para lectura colorimétrica. Para soluciones de color azul
verde y amarilla correspondería un filtro rojo. Para
soluciones de color rojo, naranja o amarrillo
seleccionaríamos un filtro color azul. Finalmente para
soluciones con color verde, azul o amarilla elegiríamos
un filtro rojo.
 • Manejo del
Espectrofotómetro
Un espectrofotómetro es un instrumento que
descompone un haz de luz (haz de radiación
electromagnético), separándolo en bandas de
longitudes de onda específicas, formando un
espectro atravesado por numerosas líneas oscuras
y claras, semejante a un código de barras del
objeto, con el propósito de identificar, calificar y
cuantificar su energía.
Distribución de la luz en el
espectrofotómetro
Espectrofotómetro Mecanismo Interno
 Met.Cient. I

COLOR LONGITUD DE ONDA (l)

Rojo (R) 700 nm
Verde (G) 546.1 nm
435.8 nm
Azul (B)
Es usual que al seguir un protocolo para la
determinación de la concentración de un compuesto
en particular se indica una longitud de onda (l)
específica a la que hay que leer con el colorímetro o
espectrofotómetro.

¿Por qué leer a diferentes l (longitudes de onda)

compuestos parecidos pero diferentes?

La explicación radica en el hecho de que cada

producto químico se caracteriza por zonas del
espectro visible o no visible en el cual absorbe con
mayor o menor intensidad conformando en su
conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.
Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro
de absorción característico

Absorbancia

l
Las longitudes de onda con mayor absorción (picos)
corresponderán de forma general a aquellas con las que se
leerá la muestra para determinar su concentración
Absorbancia

l
La relación entre la absorbancia por una sustancia a una l
determinada y su concentración es directamente proporcional
es decir: a mayor concentración mayor proporción de luz
absorbida.
Absorbancia
Conc.
Así, el espectro de absorción de la clorofila es:
Colorante común, la Rodamina 6G en Metanol..

Espectro de Absorción (línea contínua) y Espectro de

Transmisión (línea discontínua).
celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de

forma prismática
Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual
se vierte la solución a leer no debe desviar la
trayectoria de la luz como requisito para el
cumplimiento de la ley de Beer
Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un
comportamiento constante ante la variación de la longitud de onda es
común que las celdas del espectrofotómetro o colorímetro sean de este
material .
 Curva Patrón

El razonamiento para el proceso de

determinación de una concentración
desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de
las cuales también se sabe su
absorbancia (curva patrón), es posible
interpolar (intercalar) la concentración
del problema sabiendo su absorbancia
(línea roja en figura siguiente)
 CURVA PATRÓN

0.6

0.5

A
Absorbancia del problema
B 0.4
S
0
R 0.3

B
A
0.2
N
C
Interpolación
I
0.1
A

0
0 2 4 6 8 10 12

Concentración mg/lt
Con base en que la Absorbancia guarda una relación
lineal con la concentración, se comprende la existencia
de una relación de proporcionalidad entre la Absorbancia
y la concentración:

A1 / A2 = C1 / C2
Donde:
A1 = Absorbancia del problema.
A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida.
C1 = Concentración del problema.
C2 = Concentración del estándar.

Si despejamos C1 = Conc del problema

A1 (problema) * Conc estándar

Conc. (problema) =
A2 (estándar)
Ejemplo de curva patrón para la determinación de safranina;
donde se solubiliza este colorante únicamente en agua siendo por
tanto el agua misma el tubo blanco o de referencia para la
calibración del equipo (colorímetro o espectrofotómetro)

TUBO Stock de Safranina Agua Destilada ml

(3 x10 -4 g/ml) ml

1 0 10
2 0.05 9.95
3 0.10 9.9
4 0.20 9.8
5 0.40 9.6
6 0.80 9.2
 En este ejemplo de determinación de Glucosa, en la
preparación de los tubos para la lectura de la curva
patrón, se incluyen más elementos y por lo cual el tubo
“blanco” (0) contiene todos los componentes excepto la
glucosa con el fin de poder calibrar la absorbancia del
equipo a cero.

Compuesto 1 2 3 4 5 6 7
(blanco)

Glucosa 0,1 mg/ml

0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
(mL)
Agua destilada
1.0 0.4 0.9 0.8 0.2 0.6 0.0
(mL)
Fenol al 5% (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Acido sulfúrico
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
(mL)
 RESULTADO de la curva patrón anterior
Absorbancia en el Espectrofotómetro a 490 nm

Tubos Absorbancia Curva de calibración de glucosa

1 0
1
2 0.135 0.8

Absorbancia
3 0.253 0.6

4 0.417 0.4

0.2
5 0.658
0
6 0.574 1 2 3 4 5 6 7

7 0.768 Tubos
Un aspecto importante de la evaluación espectrofotométrica,
es que muchas moléculas orgánicas no absorben en el
intervalo del espectro visible sino en el rango de longitudes
de onda acordes al ultravioleta o al infrarrojo

Por lo que es común, actualmente, que la mayoría de los

espectrofotómetros, actuales, se encuentren provistos con
lo necesario para leer en tales intervalos

Así, los grupos carbonilo presentes en los aldehídos (RCHO),

cetonas (RCOR), ácidos carboxílicos (RCOOH), l ésteres
(RCOOR´) y amidas (RCONHR´) dan lugar a absorciones
intensas en la región del espectro de infrarrojo situada entre
1780-1640 cm-1.
Absorciones máximas (picos de absorción) de algunos compuestos
que absorben en la región ultravioleta:
Grupos funcionales cuyos picos de absorción se localizan en
la región del infrarojo
 Tipos de Espectrofotómetro
Existen en la actualidad
diversos tipos de aparatos
con los mismos principios
los hay mecánicos y
digitales; unos miden solo
la luz visible, otros son más
precisos y miden también
luz U.V. , Infrarroja, de
absorción atómica (AA),
flurescencia de rayos-X de
emisión de plasma (ICP),,
multipropósitos (para medir
directamente la solución
con suspensión, muestras
sólidas y biológicas),
acoplado a masas,etc..
 MCI MCI
Para medir Luz Visible Para medir Luz Visible y U.V.

Para medir Luz Visible y U.V.

Diferentes tipos de espectrofotómetros

Manejo de espectrofotómetro
 Manejo de espectrofotómetro (Spectronic 20)

• Encender el aparato (a)10 minutos antes de

utilizarse, se activará la luz roja de encendido (b).
• Seleccionar la longitud de onda con el botón (c).
• Ajuste (con a) a 0% de transmitancia, con la tapa
cerrada y sin muestra.
• Insertar la cubeta con el blanco en su sección (d).

d
c

a
• Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia)
• Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra
problema, e insertar en su espacio, bajar la tapa.
• La aguja (d) del lector se deslizará sobre la escala (f) , se
lee en % de transmitancia ó en unidades de absorbancia

e
 CUIDADOS
• Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse
turbias o con precipitados.
• El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser
excesivo para evitar que se desborde, en caso de que
sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel
absorbente suave, para evitar rayarla.
• La cubeta se sujeta por los lados opacos.
• La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes
de la cubeta
• No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes,
ácidos o álcalis; dentro del contenedor de la cubeta,
se puede dañar parte del mecanismo
• Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y
libre de humedad
 Bibliografía
• ciencianet.com/ espectros.html
• www.uam.es/.../ Guiones/Practica1.htm
• http://www.pnte.cfnavarra.es/publicaciones/pdf/qui_dg.pdf
• www.chemkeys.com
• Elementos de espectroscopia. Leyes de los procesos de
absorción de la radiación, João Carlos de Andrade, Rogério
Custodio, y Lauro T. Kubota , María Del Pilar Taboada
Sotomayor Creado en: ABR/1999(Universidade Estadual de
Campinas, Instituto de Química) Última actualización:
MAR/2000. revisado en marzo de 2006
• http://www.fi.uba.ar/materias/6305/download/Espectrofoto
metria.pdf
• Introducción a la Espectroscopía de Absorción Molecular
Ultravioleta, Visible e Infrarrojo Cercano Brunatti Carlos Lic.
Ana María Martín consultado marzo 2006