Manual de Laboratorio de Análisis Instrumental 2023

PRÁCTICA 1: LEY DE BEER LAMBERT I1

Espectro electromagnético y uso de Spectronic 200

OBJETIVOS

● Conocer las generalidades de la radiación electromagnética y su división en regiones

espectrales.
● Aprender los principios básicos de espectrometría y la ley de Beer-Lambert.
● Conocer el funcionamiento de los equipos espectroscópicos en general, y del
espectrofotómetro visible Spectronic 200.
● Realizar un barrido manual con ayuda de un espectrofotómetro virtual, para determinar el
máximo de absorbancia de una sustancia.
● Calcular el coeficiente de absortividad molar y utilizarlo para determinar la concentración
de una muestra.

FUNDAMENTO TEÓRICO

La radiación electromagnética, o luz, es una forma de energía. Su comportamiento puede

estudiarse tomando en cuenta sus propiedades como onda y partícula. Las propiedades ópticas de
la radiación electromagnética, tales como difracción, se explican mejor describiendo la luz como
una onda; mientras que muchas de las interacciones de la radiación electromagnética y la materia,
como la emisión y absorción, se explican mejor considerando la luz como una partícula. Este doble
punto de vista de la radiación como partícula y como onda no es mutuamente excluyente sino
complementario.

Propiedades de Onda de la Radiación Electromagnética: La radiación electromagnética consiste

en campos magnéticos y eléctricos oscilantes que se propagan a través del espacio en una
trayectoria lineal a velocidad constante. Estos campos son perpendiculares entre sí y a la dirección
de propagación. En la figura 1, se observa la radiación electromagnética polarizada en el plano,
mostrando lo descrito anteriormente.

Figura 1.
→
Radiación electromagnética polarizada en el plano, mostrando el campo eléctrico (𝐸), campo
→
magnético (𝐵), y la dirección de la propagación (c).

1
Elaborado por Nancy Ramírez (Revisado por Henley Gaitán)
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Normalmente, la radiación electromagnética se encuentra de forma no polarizada, con campos

eléctricos y magnéticos oscilantes en todos los posibles planos orientables. Su interacción con la
materia puede explicarse considerando el campo eléctrico o el campo magnético; en particular, se
considerará la componente eléctrica de la radiación, ya que el campo eléctrico es el responsable de
la mayoría de los fenómenos de interés para el curso de Análisis Instrumental, tales como la
transmisión, reflexión, refracción y absorción.

Propiedades de Partícula de la Radiación Electromagnética: Cuando una muestra absorbe

radiación electromagnética, sufre un cambio de energía. Considerando que la radiación
electromagnética está constituida por un rayo energético de partículas llamadas fotones, es más
fácil entender esta interacción, ya que cuando el fotón es absorbido por la muestra, se transforma
en energía que la muestra adquiere. Es posible saber la energía dada por el fotón (𝐸),
considerando las ecuaciones:
ℎ𝑐
𝐸 = ℎν = λ
= ℎ𝑐ν

−34
En donde ℎ es la constante de Planck (6. 626×10 𝐽⋅𝑠), ν corresponde a la frecuencia; 𝑐, la
8 −1
velocidad de la luz (3. 00×10 𝑚⋅𝑠 ); λ es la longitud de onda; y ν, el número de onda. Dicha
energía del fotón es una propiedad característica de la radiación electromagnética.

Espectro Electromagnético

La frecuencia y longitud de onda de la radiación electromagnética abarca un intervalo amplio, por

lo que se utiliza una escala logarítmica, y se divide en diferentes regiones espectrales. Esta división,
conocida como espectro electromagnético, se basa en el tipo de transición atómica o molecular
que da lugar a la absorción o emisión de fotones. Los límites del espectro electromagnético no son
rígidos, y pueden existir traslapes entre regiones espectrales, como se observa en la figura 2.

Figura 2.
Espectro electromagnético.

3x1010 3x108 3x106 3x104 3x102 3x100 3x10-2 3x10-4 ν, (cm-1)

1021 1019 1017 1015 1013 1011 109 107 ν (Hz)

Rayos X UV Infrarrojo Radio

Rayos Gamma Visible Microondas

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10-13 10-11 10-9 10-7 10-5 10-3 10-1 101 λ (m)

Espectrometría

La espectroscopía es un término general para la ciencia que estudia las distintas interacciones de la
radiación electromagnética con la materia. Los métodos espectrométricos son un amplio grupo de
métodos analíticos que se basan en las espectroscopías atómica y molecular. La espectrometría
junto a dichos métodos, hacen referencia a la medida de la intensidad de la radiación mediante un
detector fotoeléctrico u otro dispositivo electrónico.

La espectrometría se divide en dos clases muy amplias. En la primera, la radiación

electromagnética sufre un cambio en su amplitud, ángulo de fase, polarización o dirección de la
propagación, como resultado de su refracción, reflexión, difracción o dispersión por causa de la
muestra; entre estas técnicas, se encuentra la difracción de rayos X, refractometría, turbidimetría,
nefelometría, dispersión rotatoria óptica, entre otros.

La segunda clase, implica una transferencia de energía entre el fotón de radiación

electromagnética y el analito; abarca las técnicas de mayor interés para el curso, tales como
absorción atómica, fluorescencia de rayos X, espectroscopía infrarroja, espectroscopía UV/Vis de
absorción, espectroscopía Raman, espectroscopentre otras.

Para esta segunda clase de espectroscopía, es importante considerar el tipo de transferencia de

energía. La espectroscopía de emisión, conlleva la liberación de un fotón cuando el analito regresa
de un estado alto de energía a un estado de energía más bajo. Cuando luego de la emisión sigue la
absorción de un fotón, se denomina fotoluminiscencia; si le sigue una reacción química, se le llama
quimioluminiscencia.

En la espectroscopía de absorción, el fotón de radiación electromagnética lleva la energía, la cual

pasa a ser absorbida por el analito, y este último, es promovido de un estado de baja energía a uno
de alta energía, o estado excitado. Cuando los fotones atraviesan la muestra que contiene el
analito, su intensidad se ve atenuada, debido a la absorción. La medida de esta atenuación o
diferencia en la intensidad, es lo que se utiliza como una señal en las técnicas espectroscópicas de
absorción, como se profundizará en la siguiente sección.

Transmitancia y Absorbancia

La atenuación de la intensidad de la radiación electromagnética mientras atraviesa una muestra, se

puede describir empleando dos términos distintos, pero estrechamente relacionados: absorbancia
y transmitancia. Esta última se define como la razón entre la potencia (o intensidad) de la
radiación electromagnética que sale de la muestra (𝑃𝑇), y la radiación que incide sobre la muestra
desde la fuente (𝑃0):

𝑃𝑇
𝑇= 𝑃0
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Normalmente se expresa en forma de porcentaje, lo cual se obtiene, multiplicando por 100 el

resultado anterior. Un 100% de transmitancia, implica 0% de absorción; y 0% de transmitancia,
indica una absorción completa. Todos los métodos de detección, miden la transmitancia de la
radiación electromagnética.

Por su parte, la absorbancia es un método alternativo para expresar la atenuación de la radiación.

Es una unidad más común, ya que como se estaré viendo posteriormente, es una función lineal de
la concentración del analito. Está definida como:

𝐴 =− 𝑙𝑜𝑔⁡(𝑇)

Ley de Beer-Lambert

Cuando la radiación electromagnética pasa por una capa infinitesimalmente delgada de la muestra,
de espesor 𝑑𝑥, experimenta un decremento en la potencia 𝑑𝑃, ya que la potencia del haz que
entra en la capa delgada de la muestra es proporcional al número de fotones por centímetro
cuadrado Esta disminución fraccional de la potencia es proporcional al grosor de la muestra y la
concentración del analito:
𝑑𝑃
− 𝑃
= α𝐶𝑑𝑥

En donde 𝑃 es la potencia incidente sobre la capa delgada de muestra, y α es una constante de

proporcionalidad. Integrando sobre 𝑃 del lado izquierdo de la ecuación anterior, desde 𝑃0, hasta
𝑃𝑇; y del lado derecho, sobre 𝑥, desde 0 hasta 𝑏, en donde b es el grosor total de la muestra. Al
resolver esto (Anexo 1), se tiene:

𝐴 = 𝑎𝑏𝐶

En donde 𝑎 corresponde a una constante de proporcionalidad, que para fines prácticos, se conoce
−1 −1
como absortividad, con unidades de 𝑐𝑚 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 . Si la concentración está expresada
en términos de molaridad en particular, se denomina absortividad molar, y se utiliza la letra griega
épsilon (ε) para representarla:

𝐴 = ε𝑏𝐶

Las últimas dos ecuaciones presentadas, corresponden a formulaciones de la ley de Beer-Lambert.

Estas indican que la absorbancia es determinada para un analito es proporcional a la concentración
del mismo.

Espectrometría Ultravioleta/Visible (UV/Vis)

Es una técnica de espectroscopía de absorción de radiación electromagnética de longitud de onda

entre 160 y 780 nm. Se considera que los métodos de absorción molecular UV/Vis es de los más
utilizados entre todas las técnicas de análisis cualitativo en los laboratorios químicos y clínicos a lo
largo del mundo. Tienen aplicación en la identificación y determinación de especies orgánicas e
inorgánicas.

Como todo equipo de espectroscopía, la instrumentación consiste en una fuente de energía, un

medio para seleccionar una longitud de onda en particular, un recipiente para contener la muestra,
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un detector para medir la señal, y un procesador de señales para mostrar los resultados de forma
conveniente para el analista.

Spectronic 200

El Spectronic 200 (figura 3), se denomina un espectrofotómetro visible, ya que su fuente de luz es
de tungsteno-halógeno, por lo que únicamente puede emitir radiación electromagnética en el
rango de 340 nm a 1000 nm. Cuenta con un dispositivo de carga acoplada de 2048 pixeles como
detector, en donde cada uno de los pixeles responde a la longitud de onda de la luz incidente.

Este equipo, permite analizar la absorbancia de las muestras en una longitud de onda específica;
realizar barridos en un intervalo de longitudes de onda seleccionado, y encontrar máximos de
absorbancia; construir curvas de calibración para hacer análisis cuantitativos; y realizar métodos
analíticos previamente guardados, que también permiten hacer análisis cuantitativos.

Figura 3
Espectrofotómetro visible Spectronic 200.
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1. Regulador de longitud de onda: Permite seleccionar la longitud de onda deseada para un

análisis. Además, luego de hacer un barrido, funciona como cursor para examinar las diferentes
longitudes de onda en la gráfica.
2. Imprimir: Este botón permite la impresión directa de los resultados, si el equipo está
conectado una impresora en el puerto USB. Si se conecta una memoria flash USB, los resultados
se guardarán en la misma.
3. Función Auto-Cero: Este botón establece en el indicador una transmitancia de 100%, para todas
las longitudes de onda. Se utiliza al hacer lectura de un blanco.
4. Menú: Este botón permite accesar al menú principal, en donde se selecciona el método o
configuración particular del análisis.
5. Controles: El control central permite aceptar las opciones que aparecen en la pantalla. Con los
controles de arriba, abajo, derecha e izquierda, es posible navegar en el menú y opciones para
hacer la selección deseada. Además, los controles de derecha e izquierda, permiten cambiar la
longitud de onda a seleccionar para un análisis.
6. Pantalla: En ella aparece toda la información de una forma fácil de visualizar e interpretar.

ACTIVIDAD

Parte 1: Video complementario

Video: https://www.youtube.com/watch?v=rZUamUXeecg

● Este video NO se asignará a través de Edpuzzle, pero es recomendable verlo para

complementar la descripción del equipo presentada.
● Contiene una descripción gráfica del equipo Spectronic 200, y sus funciones de trabajo.

Parte 2: Uso de simulador virtual para realizar un barrido

Registro en plataforma de la Universidad de Amrita

Si ya tiene una cuenta en la plataforma que se va a utilizar, dirigirse a la siguiente sección.

1. Ingresar a: https://vlab.amrita.edu/index.php?pg=bindex&bsub=guest_registration_form
2. Se presentan dos opciones para registrarse. En la primera opción, del lado izquierdo (Enter
your details), les solicitan de manera obligatoria una dirección de correo y contraseña, por
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favor ingresar también su nombre y apellido. Al terminar de ingresar los datos hacer clic en
Register para completar su registro.
3. La segunda opción, del lado derecho (please use your existing account), les permite
registrarse con una cuenta existente en Google o Yahoo. Al seleccionar una de estas
opciones, se les pedirá ingresar con su dirección de correo y contraseña de dicha cuenta.
4. Luego de haber realizado alguna de las dos opciones para registrarse, está listo para usar el
simulador virtual.

Barrido para determinar la longitud de onda de máxima absorbancia

1. Ingresar al simulador virtual a través del siguiente enlace:

https://vlab.amrita.edu/index.php?sub=2&brch=190&sim=338&cnt=4
2. Es necesario iniciar sesión para acceder al simulador. En pantalla aparecerá el simulador de
un espectrofotómetro. Para trabajar de forma más cómoda, puede hacer clic en el botón
de pantalla completa (cuadro de color rojo).

3. En el modo pantalla completa, aparece del lado izquierdo el menú para seleccionar el
reactivo a analizar y una concentración en particular. Debe consultar el documento adjunto
“Asignación de Reactivos y Concentración.pdf”, para ver el reactivo y la concentración con
la que deberá trabajar.

Una vez seleccionado el reactivo de trabajo y la concentración, se comienza con el análisis.

En la gradilla de la parte superior se observan 3 cubetas con distinto contenido (cuadro de
color rojo).
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La primera, es una muestra de concentración conocida, es decir la concentración que se

colocó en el paso anterior; la segunda es una muestra de concentración desconocida; y la
tercera cubeta, es el blanco.

● Lectura de Blanco

4. El primer paso es hacer la lectura del blanco. Se debe abrir el compartimiento para
muestras, haciendo clic donde dice “Click here to open”.
5. Luego, se hace clic en la cubeta que contiene el blanco. Al hacer clic, debe observar la
cubeta moviéndose hacia el compartimiento para muestras.
6. Una vez colocado el blanco, se debe dejar cerrado el compartimiento para muestras,
haciendo clic en “Click here to close”.
7. La absorbancia se mide sola, se observa el resultado en la pantalla. Cuando se hace la
lectura del blanco, se debe presionar el botón “0 ABS, 100% T” (cuadro color rojo), para
que el instrumento lea una absorbancia de 0.00000, para todas las longitudes de onda.

8. Luego de haber leído el blanco, se vuelve a abrir el compartimiento para muestras, y se

hace clic en la cubeta, para devolverla a la gradilla.

● Barrido de la muestra
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9. Con el compartimiento para muestras aún abierto, hacer clic en la cubeta con la solución
de concentración conocida, para que se desplace hacia su posición en el equipo, y cerrar el
compartimiento, haciendo clic en “Click here to close”. Recuerde que debió seleccionar la
concentración al inicio de la experimentación.
10. Medir la absorbancia entre las longitudes de onda de 350 a 700 nm. La longitud de onda se
puede ir cambiando de 5 en 5, haciendo clic en las flechas sobre el espectrofotómetro
(cuadro rojo). La flecha hacia arriba producirá un aumento en 5 unidades de la longitud de
onda, mientras que la flecha hacia abajo genera un descenso de 5 unidades de la longitud
de onda. [Puede reportar la absorbancia en intervalos de 10].

11. Realizar una gráfica, colocando en el eje X la longitud de onda, y en el eje Y la absorbancia
e identificar la longitud de onda con el máximo de absorbancia.
12. Calcular el valor de absortividad molar (o coeficiente de absortividad molar), utilizando el
valor de absorbancia máxima encontrado, y considerando que la longitud de la cubeta es
de 1 cm, como indican en el simulador.

● Determinación de la concentración desconocida

13. De nuevo en el simulador, seleccionar la longitud de onda en la cual se encontró el máximo

de absorbancia.
14. Colocar la cubeta con la muestra de concentración desconocida en el compartimiento para
muestras.
15. Cerrar el compartimiento para muestras, haciendo clic en “Click here to close”, y leer el
valor de absorbancia que aparece en el espectrofotómetro.
16. Calcular la concentración de la muestra, utilizando el coeficiente de absortividad molar
determinado en la sección anterior.

REFERENCIAS

Harvey, D. (2000). Modern Analyitical Chreymistry (1ra ed.). Greencastle: McGraw-Hill.

Skoog, D. A., James Holler, F., & Nieman, T. A. (2001). Principios de análisis instrumental (5ta ed.).
Madrid: McGraw-Hill.
Thermo Fisher Scientific. (2020). Thermo Scientific SPECTRONIC 200 Visible Spectrophotometer.
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Recuperado de:
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-281700#/840-281700

ANEXOS

Anexo 1.
Deducción matemática de la Ley de Beer-Lambert

En el diagrama que se observa a la izquierda, se pueden

observar los factores involucrados en la deducción de la ley de
Beer. Recordemos que 𝑃𝑥 hace referencia a la intensidad de la
radiación electromagnética, 𝑑𝑥 corresponde al espesor de una
capa infinitesimalmente delgado de la muestra, 𝐶 es la
concentración y α es una constante de proporcionalidad.

Como se había explicado anteriormente, la potencia del haz que entra en la capa delgada de la
muestra es proporcional al número de fotones por centímetro cuadrado, de manera que esta
disminución fraccional de la potencia es proporcional al grosor de la muestra y la concentración del
analito:
𝑑𝑃
− 𝑃
= α𝐶𝑑𝑥

Para resolver la ecuación anterior, se integra de ambos lados de la ecuación:

𝑑𝑃
∫− 𝑃
= ∫ α𝐶𝑑𝑥

1
−∫ 𝑃
𝑑𝑃 = α𝐶∫ 𝑑𝑥

Colocamos los límites de integración, en donde 𝑏, es el grosor total de la muestra, como se observa
en el diagrama anterior.
𝑃=𝑃𝑇 𝑥=𝑏
1
− ∫ 𝑃
𝑑𝑃 = α𝐶 ∫ 𝑑𝑥
𝑃=𝑃0 𝑥=0

Al resolver, se obtiene:

( ) ( )
− 𝑃𝑇 − ln 𝑙𝑛 𝑃0 ] = α𝐶(𝑏 − 0)

− (𝑃𝑇) − ln 𝑙𝑛 (𝑃0) ] = α𝐶𝑏

Por propiedades de logaritmos:

− ln 𝑙𝑛 ( ) 𝑃𝑇
𝑃0
= α𝐶𝑏
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La expresión de la izquierda es muy parecida a la de absorbancia, excepto por la base del logaritmo
aplicado, de manera que puede convertirse a un logaritmo de base 10, para que sea equivalente a
la fórmula para calcular la absorbancia.

( )
𝑃𝑇

( )
𝑃𝑇 log𝑙𝑜𝑔 𝑃0
ln 𝑙𝑛 𝑃0
= log𝑙𝑜𝑔 (𝑒)

Y combinando esta y la ecuación anterior, se tiene:

log𝑙𝑜𝑔 ( )
𝑃𝑇
𝑃0
= α𝐶𝑏
log𝑙𝑜𝑔 (𝑒)

− log 𝑙𝑜𝑔 ( )
𝑃𝑇
𝑃0
= α𝐶𝑏×𝑙𝑜𝑔⁡(𝑒)

La expresión del lado izquierdo corresponde a la forma de calcular la absorbancia (𝐴), y por el lado
derecho, las constantes α y log 𝑙𝑜𝑔 (𝑒) , se agrupan en una sola, que llamaremos 𝑎:

𝐴 = 𝑎𝑏𝐶

Esta expresión se conoce como la ley de Beer-Lambert.