Laboratorio de Microbiología y Ambiente

Facultad de Ingeniería Ambiental-S3

Universidad Nacional de Ingeniería

METABOLISMO MICROBIANO

Los microorganismos como todo ser vivo, pueden modificar su entorno y utilizar los
compuestos químicos en solución como fuente de energía y como bloques de construcción
para su crecimiento y reproducción. Todas las actividades celulares son medidas por enzimas
y los microorganismos producen muchos tipos de enzimas cuyas actividades se
interrelacionan.

Mediante el ensayo de los productos finales de la acción enzimática y la desaparición de

ciertas sustancias del medio, los microbiólogos pueden establecer la composición enzimática
de un microorganismo y pueden identificarlo y diferenciarlo de especies muy relacionadas.

Muchos microorganismos, al igual que en organismos más complejos como los humanos,
utilizan varios carbohidratos como su principal fuente de energía. Estos incluyen
polisacáridos, disacáridos y monosacáridos. Entre los productos comunes de la hidrólisis
de los carbohidratos por los microorganismos están los ácidos orgánicos (por ejemplo: ácido
acético y ácido láctico) y gases (tales como dióxido de carbono e hidrógeno). De este modo,
la capacidad (o la incapacidad) de un organismo para romper un azúcar simple, combinación
de azúcares, o varios otros carbohidratos en el medio proveen información para la
clasificación de especies bacterianas. La fácil detección de ácido y gas producido por
especies de bacterias es de importancia práctica.

Muchas bacterias pueden degradar una variedad de proteínas y usar el péptido resultante y
aminoácidos para energía y para sintetizar sus propias proteínas. La actividad proteolítica
varía de especie a especie, estas características pueden ser usadas para caracterizar una
especie.
Los lípidos que son descompuestos comúnmente por los microorganismos son los
triglicéridos y los fosfolípidos. Los triglicéridos son ésteres de glicerol y ácidos grasos. La
descomposición de los triglicéridos por los microorganismos causa rancidez en alimentos que
contienen una alta proporción de grasas, por ejemplo, mantequilla y margarina (los ácidos
grasos formados causan el sabor y aroma rancio). Otros microorganismos tienen la
capacidad de utilizar la urea como fuente de nitrógeno. Entre los Gram negativos, el género
Proteus sp. puede ser distinguido de otros por su habilidad para producir grandes cantidades
de la enzima ureasa.

GUÍA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO N°6: ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN
Para el caso de los microorganismos, la mayoría de los carbohidratos de que disponen se
encuentra en la forma de polisacáridos. Un ejemplo común de estos compuestos es el almidón.

Un organismo puede hidrolizar almidón sólo si produce la enzima amilasa. Como no todos los
microorganismos producen amilasa, la hidrólisis del almidón puede ser usado para ayudar a
identificar microorganismos desconocidos.

La hidrólisis de la proteína, algunas veces llamada peptonización, es también útil para la

identificación de especies microbianas; por ejemplo, la gelatina es un buen sustrato para el
ensayo de microorganismos para el ensayo de microorganismos con enzimas proteolíticas. La
caseína, es la principal proteína de la leche y muchas bacterias producen enzimas que
hidrolizan esta proteína en derivados más solubles como proteosas, peptonas, péptidos y
aminoácidos; por citarlos en orden decreciente de tamaño.

Muchos microorganismos pueden degradar grasas y aceites (lipólisis) y obtener así acetato
para el metabolismo de carbohidratos y la síntesis de aminoácidos. La presencia de lipasa
constituye otra característica de los microorganismos que puede ser útil para su calcificación.
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Todas las bacterias aerobias obtienen su energía por medio de la respiración, proceso responsable
de la oxidación de diversos sustratos. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema
citocromo oxidasa, que se encuentra por lo general en los organismos aerobios, y los hace capaces
de utilizar el O2 como aceptor final de hidrogeno para reducir el O2 en peróxido de hidrógeno, el
último enlace de la cadena de la respiración aeróbica. La reacción oxidasa positiva está limitada a
aquellos organismos capaces de desarrollar en presencia de O2 y de producir la enzima catalasa.

OBEJETIVO

 Reconocer e interpretar la actividad enzimática en cultivos bacterianos.

MATERIALES

 Medios de cultivos: Placas de agar almidón, agar gelatina, agar caseína, agar grasa.
 Asa de Kölle
 Mechero
 Cultivo de microorganismos de 18 horas.

PROCEDIMIENTO

1.- Con un plumón marcador dividir la base de la placa en cuatro secciones, enumerados con I,
II, III y IV.
2.- Utilizando la aguja de Kölle, colocar una estría de cada cultivo en un cuadrante. Deja el
primer cuadrante como control.
3.- Invertir las placas e incubar a 37º C por 18-24 horas.

Después de la incubación determinar los resultados de la prueba como sigue:

A. Hidrólisis del almidón

• Cubrir la superficie de la placa con solución lugol
• Las zonas claras o transparentes alrededor de las colonias bacterianas indican
la hidrólisis del almidón. Anotar sus resultados en el cuadro de conclusiones.

Se utiliza la solución iodada del Gram. Se adiciona unas gotas de solución iodada sobre la siembra
cultivada en el medio base de almidón. La amilosa y la amilopectina se comportan diferente frente
al Iodo. La amilosa se combina más fuertemente con el Iodo que la amilopectina y produce un color
azul intenso. El color puede variar hacia el purpura y al incoloro si el almidón ha sido hidrolizado. La
amilopectina da un color rojo con el Iodo ya que no se une efectivamente y puede virar hacia el
incoloro si se encuentran presentes acrodextrinas.
https://www.youtube.com/watch?v=iwia0eIzfJI
https://www.youtube.com/watch?v=knPRiWAkkmI
https://www.youtube.com/watch?v=5UYYXOHfEWg
https://www.youtube.com/watch?v=LxanPlN62rs

B. Hidrólisis de la gelatina

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas)

que licúen la gelatina.
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• Cubrir la superficie de la placa de agar gelatina con HgCl 2 por 5’.

• La actividad de la gelatinasa se indica por medio de zonas trasparentes
alrededor de las colonias. La zona opaca del medio se debe a la gelatina
precipitada.
• Anotar las conclusiones en la sección de resultados y observaciones.

Un precipitado blanco indica presencia de gelatina no hidrolizada; la ausencia del precipitado en la

región de crecimiento bacteriano indica hidrólisis de la gelatina.

Enzimatic and Genetic Variability in Bacillus spp. Strains with Plant Beneficial Qualities
Oana-Alina SICUIA1,2, Iulian GROSU1, Florica CONSTANTINESCU2, Cătălina VOAIDEŞ1, Călina
Petruţa CORNEA1,

C. Hidrólisis de la caseína
Observar zonas claras de hidrólisis alrededor de las colonias que indican la
degradación de la caseína. Para incrementar el contraste, se puede utilizar también
HgCl2 , ácido acético.

La caseína es la proteína principal de la leche de mamíferos, es una fosfoproteína con propiedades

ácidas, que es hidrolizada por diversas pepsinas. Es una proteína conjugada ya que por hidrólisis
produce además de aminoácidos, un grupo prostético (porción no aminoácido de una proteína)
formado por fosfato esterificado a restos de serina.

https://www.youtube.com/watch?v=c3tx4oY1ncQ

D. Hidrólisis de los lípidos

• Cubrir la superficie del medio con Cu2SO4.
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• Un color verde azulado alrededor de las colonias indica la producción de la

enzima lipasa.
https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0718-07642016000600012
E. Prueba de la catalasa

La enzima catalasa se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas

que contienen citocromos. Por lo general, los organismos que no poseen el sistema de citocromos,
carecen también de la enzima catalasa. Esta enzima descompone el peróxido de hidrógeno en O2
y H2O. Químicamente es una hemoproteína, de estructura similar a la hemoglobina, salvo que los
cuatro átomos de Fe se encuentran en estado oxidado (Fe+++) en vez de reducido (Fe++). El
peróxido de hidrógeno se forma como un producto final oxidativo de la descomposición aeróbica
de los azúcares. Las oxidaciones de flavoproteínas por O2 conducen a la formación de peróxidos
cuya acumulación es tóxica para las bacterias provocando su muerte.

Técnicas del portaobjeto:

Con palillo de madera transferir bacterias del centro de una colonia bien aislada a la superficie de
un portaobjeto limpio.
Añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%.

Método en tubo o en placa de agar:

Añadir unas gotas del peróxido diluido al 3%, directamente sobre la superficie del desarrollo del
pico de flauta o placa.

Interpretación del resultado: La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas (O2)
se considera una reacción positiva.

PRÁCTICA VIRTUAL: http://learn.chm.msu.edu/vibl/index.html

https://vlab.amrita.edu/index.php?sub=3&brch=73&sim=703&cnt=1

https://www.youtube.com/watch?v=9tZIfzToHsA
https://www.youtube.com/watch?v=j7bH9rHyRw8
https://www.youtube.com/watch?v=7MW9Qjrkd3A

F. Prueba de la oxidasa

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se
debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es
reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie
bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora
de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos
aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo, pero los
anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. La citocromo oxidasa en presencia de O2
atmósferico, citocromo C y un reactivo de oxidasa, oxida al reactivo, para formar un compuesto
coloreado. Los diversos colorantes usados para la prueba de oxidasa son aceptores de electrones
artificiales.
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El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-

p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente
compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias
oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.

1. Método en placa directa

* Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no
invertirla.
* Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15
segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

2. Método indirecto sobre papel

* Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.

* Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
* Extender con el asa de siembra (palillos de madera) una colonia sobre el papel impregnado.
* La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.

Realización de la prueba:

https://www.youtube.com/watch?v=dF2DpV8J1Yc

https://www.youtube.com/watch?v=7Aa1xO2cC1M

https://www.youtube.com/watch?v=7bkXl_iT6lQ

http://universe84a.com/oxidase-test/

PRÁCTICA VIRTUAL: http://learn.chm.msu.edu/vibl/index.html

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué las amilasas, gelatinazas, caseinasas y lipasas son clasificadas como enzimas hidrolíticas?
2. Las enzimas que hidrolizan la caseína y gelatina rompen el mismo enlace químico, ¿Cuál es?