Número de proteínas recombinantes aprobadas

en diferentes sistemas de expresión

Expresión de proteínas recombinantes en
levaduras

Saccharomyces cerevisiae.

Pichia pastoris

Hansenula polymorpha
Ventajas
Es un organismo clasificado como GRAS (generally regarded as safe).

La pared celular no contiene ningún componente tóxico (como

pirógenos en E. coli).

Fácil de cultivar (cultivos de alta densidad) no requiere equipamiento ni

medios de cultivo costosos.

Amplio conocimiento de su fisiología, bioquímica y genética.

Gran variedad de vectores de expresión capaces de producir

buenos niveles de proteínas recombinantes.

Las proteínas recombinantes se mantienen en estado soluble y en su

forma nativa (no hay formación de cuerpos de inclusión como E. coli).

Puede ser secretada la medio de cultivo o al espacio periplásmico.

Realiza modificaciones post-traduccionales.

 Desventajas

Crecimiento más lento y bajos niveles de producción si se

compara con E. coli.

Células difíciles de romper.

No glicosilan exactamente igual que las células de mamíferos.

Expresión de proteínas recombinantes en
levaduras
 Vectores: Episomales e Integrativos

Origen de replicación.

Marcador de selección (marcador auxotrófico).

Elementos para propagación y selección en E. coli.

Un promotor activo en levadura

Un sitio de clonado múltiple

Una secuencia terminadora de la

transcripción
Saccharomyces cerevisiae:

Como sistema de expresión de

proteínas recombinantes
 Episomales: YEp
Yeast Episomal plasmids

ARS (secuencias de replicación autonóma).

•1-20 copias por célula.

•Inestables.

•Secuencias centroméricas.

•No tan usados.

Episomales
2µm

•100 copias por célula.

•ORI : origen de replicación.

•STB: secuencia de estabilización en cis.

•Mayor estabilidad.
 Integrativos:YIp
Yeast Integrative plasmids

Recombinación con secuencias homólogas del genoma.

Generalmente dirigidos al alelo mutado del marcador de selección

Buena estabilidad.

Generalmente bajo números de copia, puede incrementarse aumentando

la cantidad de vectores en el proceso de transformación..

Recombinación en regiones de ADN ribosomal, rDNA.

Buena estabilidad.

Alto número de copias. ( rDNA de levaduras esta presente en 150

copias aprox.).
 Integrativos:YIp

Cromosoma

Cromosoma

Esquema de integración de los plasmidos YIp

 Marcador de selección.
Marcador auxotrófico
Cepas mutantes irreversibles para la auxotrofía.

TRP1: auxotrofía para triptófano.

LEU2: auxotrofía para leucina.
HIS3: auxotrofía para hisitidina.
URA3: auxotrofía para uracilo.

Promotores defectivos resulta en células con un

alto número de copias de
plasmidos.

Marcadores de selección Dominantes

Higromicina B
Cloranfenicol.
Kanamicina
Estabilidad de plásmidos sistemas de adicción

Tomada de Nielsen J, Bioengineered 4:4, 207–211; 2013, NovoNordisk.

•El gen endógeno de la triosa fosfato isomerasa (TPI1) es eliminado.

•En el vector de expresión se inserta el gen homologo (POT1) de
Schizosaccharomyces pombeis, que además contiene en este caso el gen de
la insulina.
•Si la célula pierde el plásmido no puede realizar glicolisis y muere.
•Por otro lado las células que expresan el plásmido en alto número de copias
tienen mayor capacidad de crecimiento.
•Como resultado general se obtiene una levadura recombinante más estable.
 Promotores
Constitutivos
Alcohol dehidrogenasa (ADH1).
Gliceraldehído-3-fosfato Enzimas de glicolisis,
dehidrogenasa (GAPD).
2-5% de glucosa.
Gliceraldehído fosfato kinasa (GPK).
Triosa Fosfato Isomerasa (TPI).

Factor de elongación de la traducción (TEF).

Principal desventaja es si pequeñas concentraciones de la

proteína recombinante son tóxicas puede afectar el crecimiento
de la cepa.
 Promotores

Inducibles

Promotor Inducción Niveles

Fosfatasa Acida (PHO5) Bajas concentraciones de ~200 veces
Fosfato
Alcohol dehidrogenasa (ADH2) Bajas concentraciones de ~100 veces
glucosa
Metalotionina (CUP1) 0.03-0.1 mM Cu++ ~40 veces

Promotores regulados por Inducible por galactosa ~1000 veces

galactosa
GAL1, GAL10, GAL4
 Promotor GAL

galactosa

+
Gal3
Gal80

Gal80
Gal4 Gal4

UAS GAL UAS GAL

OFF ON
Synthesis of recombinant human parainfluenza virus 1 and 3
nucleocapsid proteins in yeast Saccharomyces cerevisiae
Molecular and process design for rotavirus-like
particle production in S. cerevisiae
 Dual System Biotech
KickStart™ Protein Expression Kit

ADH2 promoter
2micron replication origin (yeast)
Multiple cloning site
AmpR resistance gene
CYC1 terminator
pBS replication origin (E. coli)
KanMX cassette
 Dual System Biotech
KickStart™ Protein Expression Kit

ADH2 promoter
KanMX cassette
Strep-tag
2micron replication origin (yeast)
HA tag
AmpR resistance gene
Multiple cloning site
pBS replication origin (E. coli)
CYC1 terminator
 Pichia pastoris :
Como sistema de expresión de proteínas
recombinantes (http://www.pichia.com)

Ventajas
Fácil de manipular genéticamente.

Fácil de cultivar (cultivos de alta densidad) no requiere equipamiento ni

medios de cultivo costosos.

Gran variedad de vectores de expresión capaces de producir buenos niveles

de proteínas recombinantes.

Bajos niveles de proteasas

Crabtree negativo

Promotor alcohol oxidase I (AOX1), altos niveles de expresión

(~1000 veces) inducible por metanol y bien regulado.
 Pichia pastoris :
Como sistema de expresión de proteínas
recombinantes

Desventajas

Metanol altamente inflamable y tóxico.

Alto consumo de oxígeno.

 Pichia pastoris

Methanol utilisation pathway in methylotrophic yeasts: The main pathways and the respective enzymes working in the methanol
metabolism in methylotrophic yeasts are shown. AOX: alcohol oxidase, CAT: catalase FLD: formaldehyde dehydrogenase, FGH: S-
formylglutathione hydrolase, FDH: formate dehydrogenase, DAS: dihydroxyacetone synthase, TPI: triosephosphate isomerase, DAK:
dihydroxyacetone kinase, FBA: fructose 1,6-bisphosphate aldolase , FBP: fructose 1,6-bisphosphatase, MFS: methylformate synthase;
DHA: dihydroxyacetone, GAP: glyceraldehyde 3-phosphate, DHAP: dihydroxyacetone phosphate, F1,6BP: fructose 1,6-bisphosphate, F6P:
fructose 6-phosphate, Pi: phosphate, Xu5P: xylulose 5-phosphate, GSH: glutathione, PYR: pyruvate; PPP: pentose phosphate pathway,
TCA: tricarboxylic acid cycle
 Pichia pastoris :
Como sistema de expresión de proteínas
recombinantes

Marcador de selección.
Marcador auxotrófico
Cepas mutantes irreversibles para la auxotrofía.

TRP1: auxotrofía para triptófano.

HIS4: auxotrofía para hisitidina.
URA3: auxotrofía para uracilo.
ADE2: biosíntesis de nucleótidos de purina
 Pichia pastoris
Vectores

Episomales

Basado en secuencias ARS, no muy usados

Integrativos

Recombinación homóloga en secuencias de HIS4 o AOX1

 Pichia pastoris

Esquema de los mecanismos de recombinación de los plásmidos

de expresión en Pichia pastoris
 Pichia pastoris
Inducibles

Alcohol Oxidasa AOX1 (pAOX1) se induce por metanol es

represible por glucosa, etanol y glicerol.

Constitutivos
Promotor Gliceraldehido dehidrogenasa (pGAP), crecimiento
y producción de proteína recombinante simultánea
principalmente en fuente de carbono glucosa y glicerol.
 PichiaPink™ Expression System Invitrogen

Marcador de selección:
Gen ADE2: auxotrofia para
adenina.

Colonias sin el marcador de

selección son rosas por
acumulación de precursores.

Colonias blancas expresan altos

niveles de ADE2 indicando la
integración de un alto número de
copias del plásmido
PichiaPink™ Expression System

pPink-HC pPinkα-HC

AOX1 promotor α-mating factor pre-sequence

ADE2 promoter & gene CYC1 terminador

Ampicillin (bla) gene

MCS: multiple cloning site

Typical fed batch production strategy for methanol induced
recombinant protein production (RPP) by Pichia pastoris
 Hansenula polymorpha:
Como sistema de expresión de proteínas
recombinantes

Sistema de expresión similar a

Pichia pastoris
Promotor Metanol oxidasa (MOX), altos niveles de
expresión (~1000 veces) inducible por metanol y bien
regulado.
La principal diferencia es que no es inhibido por
glicerol, por lo cual puede crecer en glicerol y ser
inducido por la presencia de metanol al mismo tiempo.

Crabtree negativo
Mayor capacidad de secretar proteínas
ARTES Biotechnology GmbH
http://www.artes-biotechnology.com

CoMed™system
 ARTES
Biotechnology GmbH

CoMed™system
Respuesta al estrés causado sobre-expresión de
proteínas recombinantes, (Unfolded Protein
Response,UPR)
Factor de Transcripción, Hac1p, principal regulador de la
respuesta.

Dos respuestas:

Chaperonas y foldasas => rescata a las proteína para que continúen la

vía secretoria.

Proteínas asociadas a la degradación, ERAD => las proteínas son

dirigidas a la vía de degradación.
Trafico, glicosilación y secreción
Patrón de glicosilación en diferentes sistemas de expresión
Limitaciones de la expresión en levaduras

Neu5Ac, N-acetylneuraminic acid; Neu5Gc, N-glycolylneuraminic acid; Gal, galactose;

GlcNAc, N-acetylglucosamine; Man, mannose; Xyl, xylose; Fuc, fucose.
Humanización de las glicosilación en Pichia
 Comparación entre distintas levaduras de
aplicación industrial

Característica S. cereviceae P. pastoris H. polymorpha

Aplicación industrial + + +
Equipamiento a - + +
prueba explosión
Gras + - -
Eficiencia secreción - + +
Hiperglicosilación + - -
Estabilidad plásmidos + - -
episomales
Actividad proteasa Alta Baja Baja
Producción HBsAg en Pichia pastoris.
Producción de Antígenos Recombinantes en Levaduras
Producción de Antígenos Recombinantes en Levaduras
Producción de antígenos de Hepatitis B
en S. cerevisiae (Merck)
Producción de antígenos de Hepatitis B
en S. cerevisiae (Merck)
 Producción de antígenos de Hepatitis B
en S. cerevisiae (Merck)

Alimentación en medio YEP Inducción en medio con 2 % galactossa

+ 2% glucosa

~ 40 g PS biomasa/l