EXPRESION DE ROTEINAS RECOMBIANTES EN LEVADURAS Alfredo Lagares Guzmn QF, MSc INTRODUCCION

La clonacin en bacterias ha permitido obtener a escala industrial algunas protenas recombinantes, especialmente de inters teraputico. Sin embargo, no siempre las protenas de origen eucaritico se producen adecuadamente en huspedes procariticos, ya que a menudo son inestables o carecen de actividad biolgica. Por otro lado las protenas recombinantes obtenidas en bacterias, a pesar de haber sido cuidadosamente purificadas, pueden venir acompaadas de pequeas cantidades de sustancias bacterianas contaminantes, que pueden tener efectos pirognicos (induccin de fiebre). Por todas estas razones, la ingeniera gentica ha desarrollado otros sistemas, principalmente eucariticos, que salven al menos algunos de estos obstculos. En este sentido, las levaduras presentan una serie de ventajas: Son eucariotas, y por lo tanto ms semejantes a las clulas de los organismos superiores que los procariotas (por ejemplo, sus mecanismos de secrecin) A diferencia de las bacterias, producen cierto tipo de modificaciones postraduccionales en las protenas (glucosilaciones en ciertos aminocidos, eliminacin de la metionina inicial, rotura proteoltica de un precursor inactivo, etc.), lo que puede hacer que las protenas heterlogas de

organismos superiores puedan alcanzar su actividad biolgica (aunque esto no siempre est garantizado) A semejanza de ciertas bacterias, la levadura Saccharomyces cerevisiae es muy fcil de manejar con mtodos microbiolgicos S. cerevisiae est muy bien estudiada al nivel gentico y molecular. No slo se puede realizar gentica clsica (mutagnesis y recombinacin meitica, alternancia de ciclo haploide y diploide), sino que cuenta con herramientas avanzadas de ingeniera gentica, y su genoma se secuenci totalmente en 1996 Desde hace decenios, las levaduras se cultivan a escala industrial, y participan en multitud de procesos biotecnolgicos. Adems, cuenta con la calificacin oficial de organismo reconocido como seguro (GRAS), indispensable para poder usarlo en obtencin de sustancias para consumo humano.

Por todo ello, las levaduras son los huspedes eucariticos de clonacin ms fciles de usar, y una buena alternativa para intentar la produccin industrial de protenas de inters. (Sin embargo, debido a que las levaduras poseen un sistema de splicing diferente y menos efectivo que el de eucariotas superiores, si queremos expresar estos genes, hay que recurrir no a la versin genmica, sino al cADN tras retrocopia del correspondiente ARNm maduro).

Existe multitud de tipos diferentes de vectores, cada uno con una serie de caractersticas apropiadas para fines concretos. En general, los vectores de levadura, aparte de secuencias de levadura, contienen tambin secuencias de vectores bacterianos, previstas para su amplificacin y

manejo sobre todo en E. coli. Por esta razn se suelen calificar como vectores bifuncionales o lanzadera (porque permiten pasar del husped bacteriano a la levadura, y viceversa).

1. SINTESIS DE PROTEINAS RECOMBINANTES EN LEVADURAS

Cuando

las

clulas

bacterianas

son

incapaces

de

modificar

correctamente, una protena recombinada, se procede a la produccin de la misma en organismos eucariota. Las levaduras constituyen a menudo el primer recurso en el que se pueden expresar genes eucariotas que son incorrectamente expresados en bacterias. Las levaduras estn bien caracterizadas desde el punto de gentico. Su genoma mide 1.4 x 107 nucleicos. vista

Las levaduras se utilizan como vectores de expresin para exprimir protenas de mamferos glicosiladas. El uso de levaduras tambin permite entre otros de analizar la funcin de esas protenas en un medio eucariota e utilizar las seales de secuencia intracelulares que permiten enviar esas protenas a un organito. 1.1. TIPOS DE LEVADURAS Levaduras Auxtrofas

Un auxtrofas en un organismo que requiere uno o ms factores orgnicos (como aminocidos, nucleicos o vitaminas) que no le son necesarios al tipo salvaje. La mayora de las cepas de levadura que se utilizan en la actualidad son auttrofas, c-a-d deficiente en una o mas encimas implicadas en la biosntesis de un aminocido o un nucleico, las levaduras auttrofas no se reproducen en medio que permiten el crecimiento de la especie salvaje; ellas necesitan un medio que contenga el producto final de la va metablica afectuosa. Por ejemplo, una levadura auttrofa por la histidina necesita la presencia de histidina en el medio. Los plasmidos que contienen el gen H153 que codifica la enzima deshidrataza imidazole glicerol fosfato pueden ser introducidos en protenas auxtrofas a la histidina mediante un procedimiento anlogo a la transformacin bacteriana. El gen HIS3 codifica la enzima necesaria a la levadura auxtrofa y le permite reproducirse en un medio desprovisto de histidina. Saccharomyces Cerevisiae y Pichia Pastoris La levadura Saccharomyces Cereisiae ha incrementado su utilizacin en los ltimos 10 aos para la obtencin de protenas heterologas. El Saccharomyces Cerevisiae fue desarrollado como el primer sistema de expresin eucariota ya que al ser un organismo unicelular poda manipularse genticamente utilizando la mayora de las tcnicas comnmente empleadas para E.coli y como organismos eucaritico es un husped apropiado para la produccin de protenas eucariticas idnticas.

Saccharomyces Cerevisiae es adems adecuado por su seguridad para la produccin de productos farmacuticos recombinares por que a diferencia del E. coli no produce pirogenos o endotoxinas y tiene un amplio historial, con un grado de seguridad elevado cuando se emplea en procesos de fermentacin a gran escala en la industria. La produccin de protenas humanas en clulas de organismos inferiores mediante tecnologa recombinante es una muy prometedora aproximacin de tratamiento de muchas enfermedades producidas por la deficiencia de una protena en particular. Aunque la E.coli fue el primer hospedero empleado con xito para expresar protenas humanas, recombinates, tuvo algunas limitaciones, causadas principalmente por su inhabilidad para hacer algunas modificaciones postranduccionales, como la glycosilacin. Debido a esto la levadura Saccharomyces Cerevisiae, fue considerada y usada al comienzo para tales propsitos. Sin embargo la Saccharomyces Cerevisiae glicosila protenas de manera muy diferente a las clulas humanas y produce protenas bastante antignicas; por este motivo algunas otras levaduras no-convencionales con Pichia Pastoris, han sido usadas recientemente. En este sistema la expresin de protenas humanas no esta asociada al crecimiento; puede crecer a altas densidades celulares, aumentando la productividad y el crecimiento de la protena heterlogas, tiene un promotor muy eficiente, inducible por adicin de metanol, el cual puede ser usado como nica fuente de Carbono y energa.

Las modificaciones postranduccionables, parecen ms semejantes a las clulas humanas que a los de otros sistemas no mamferos usados para la produccin de glicoproteinas humanas y no secretan considerables cantidades de protenas endgenas, del cual simplifica la purificacin de las protenas expresadas. 1.1.2. Levadura Prottrofa Las levaduras se convierten en prottrofas cuando el marcador metablico es expresado. El gen HIS3 puede entonces utilizarse para relacionar las levaduras transformadas del mismo modo que el gen de resistencia a la ampicilina presente en un plasmado bacteriano permite relacionar bacterias transformadas. 1.2. PLASMIDOS ADAPTADOS Una segunda aplicacin de tcnicas de A.D.N recombinates en levaduras ha sido en la construccin replicacin en levaduras. Tales vectores permiten la ampliacin de plsmidos recombinados en bacterias antes de ser introducidas en las levaduras. Esos vectores son especiales pues contienen un segmento de ADN plsmidico bacteriano, para permitir la manipulacin y preparacin de ADN a gran escala y adems un marcador adecuado de levadura. Para seleccionar las transformantes. de plasmidos con buena capacidad de

Vectores de clonacin de la levadura; integradas de levadura (YIP). Replicador de levadura (YRp). Centromerico de levadura (YCp) y episoma de levadura (Yep) Vectores indicadores del gen procariotica con resistencia a la ampicilina (Amp 2), de origen replicativo procaritico (oris), marcador auxtrofico de levadura (HIS3), de la secuencia autnoma replicativa (ARS), del centrmero de la levadura (CEN), y de las secuencias de 2 u de DNA. Secuencias adicionales del ADN bacterianas ( ) y de la levadura ( ).

1.2.1. Plsmido replicativo de levadura YRp (plsmido levadura replicante) Son vectores que incluyen una secuencia autnoma de reproduccin (ARS) de origen cromosmico, adems de los elementos encontrados en YIps. Los YRps son capaces de replicar de forma autonoma y estan presentes en un nmero de 3 30 copias por clula. Los vectores YRp actualmente se utilizan en casos aislados como consecuencia de su inestabilidad. 1.2.2. Plsmido episomales de levadura YEp Los vectores YEp (plasmado levadura episomal) se basan en secuencias ARS procedentes de plsmidos endgenos de levadura 2 que contiene la informacin gentica para su propia replicacin y segregacin. Ellas son capaces de replicarse de manera autnoma, son diez veces ms estables que los YRps y bajo condiciones selectivas aparecen entre el 60% y el 95% de la poblacin celular.

Estos plsmidos son empleados ms frecuentemente como vectores de la levadura y son ampliamente utilizados en sistemas para la expresin de levaduras. 1.2.3. Plasmidos centromricos de levadura YCp (levadura

centromerico plasmido) Incluyen un ARS y un centrmero de levadura. Los YCps pueden replicarse sin estar integrados en un cromosoma y son estables durante la divisin celular. Adems de su empleo como vectores generales de clonacin de levaduras, estas formas de plsmido son la base de un tipo muy especializado de vectores para la clonacin de levaduras, el cromosoma artificial de levadura.

1.2.4. promotor inducible y gen de seleccin: El gen de inters se clona a menudo adelante del promotor inducible, GAL1 o GAL 10, los dos. El promotor es reprimido en presencia de glucosa e inducido en presencia de la galactosa. Los genes GAL producen enzimas responsables del metabolismo de la galactosa. Los promotores des genes GAL1 y GAL10 se activan cuando el factor de transcripcin GAL4 se fija en la secuencia UAS (Upstream Activating Sequence), que es la equivalente del enhancer en la levadura. La protena GAL80 no permite esta activacin cuando se une a GAL4. Los genes GAL son inducidos por la galactosa, puesto que estos al unirse con GALBO liberan el factor de transcripcin GAL4.

El inserto debe terminarse mediante un terminador de levadura.

1.3. PRODUCCIN DE PROTEINAS A PARTIR DE S. CEREVISIAE El S. Cerevisiae se convirti en una contribucin muy valiosa a la biotecnologa moderna. Sin embargo y a pesar de la versatilidad de los sistemas de expresin de levaduras, la recuperacin obtenida referida a niveles altos de protenas heterlogas autenticas y biolgicamente activas es todava materia de ensayo y error. La recuperacin satisfactoria de proteinas heterologas depende de una variedad de vectores entre los que se incluyen: La fuente del DNA, el

nivel total de mRNA presente en la clula y la naturaleza del producto requerido. 1.4. EXPRESIN EN P. PASTORIS

Otra especie de levadura, Pichia Pastoris, es capaz de producir cantidades importantes de protena recombinada, a veces del orden de gramo por litro. Pichia Pastoris es una levadura metilotrofa.

En ausencia de glucosa como fuente de carbono, sta levadura es capaz de utilizar el metanol. El promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) controla la expresin de alcohol oxidasa, que cataliza la primera etapa de la va metablica del metanol. Como la enzima posee una actividad especfica dbil, ella es producida en la levadura en grandes cantidades.

El sistema original de expresin en P. pastoris est basado en el promotor de uno de los genes de la alcohol-oxidasa. La alcohol-oxidasa cataliza la primera reaccin de la ruta de degradacin del metanol, al oxidarlo hasta formaldehido y perxido de hidrgeno. La reaccin tiene lugar en el peroxima, orgnulo que secuestran el perxido del resto de la clula. La alcohol-oxidasa tiene poca afinidad por el metanol, pero esto lo compensa esta levadura sintetizando grandes cantidades de la enzima, determinada por dos genes, AOX1, AOX2. El producto del primero representa ms del 90% de la actividad total. El promotor de AOX1 est fuertemente regulado

e inducido por metanol, pero est reprimido en otras condiciones, como hambre de carbono.

Cuando las clulas son incubadas en presencia de grandes cantidades de metanol, la alcohol oxidasa constituye ms del 30% de protenas solubles. En ausencia de metanol, no se detecta la presencia de la alcohol oxidasa.

Se han construido vectores que permiten clonar genes de inters a lo largo del promotor AOX1.

Este promotor, inactivo en presencia de glucosa, es metanol inducible. Ciertos vectores tambin contienen una secuencia seal, a menudo aquella de una feromona de un factor que le permite el acoplamiento a levaduras. Las protenas que contienen esas seales son las que se secretan en el medio.

Las ventajas de este sistema son las siguientes: Ventajas derivadas de las caractersticas metablicas de esta levadura:

Gran preferencia por el metabolismo respiratorio, lo que

permite cultivos ms densos que otras levaduras

 Modificaciones postraduccionales mejores que los de S.

cerevisiae: procesamiento proteoltico, glucosilacin y formacin de puentes disulfuro

Muy altos niveles de secrecin de protena heterloga, con

apenas secrecin de protena nativa Sistema fcilmente escalable a escala industrial Sistema ms barato y ms rpido que los de eucariotas superiores A pesar de lo anterior, este sistema de expresin presenta ciertas limitaciones, algunas de las cuales se estn resolviendo en los ltimos aos: 1. El metanol que se necesita para la induccin supone cierto riesgo de fuego y puede no ser adecuado para producir protenas alimentarias. Por lo tanto, se necesitan promotores fuertes que no necesiten metanol para su induccin. Ya se cuenta con algunos: a. Promotor del gen de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAP). Suministra un alto nivel constitutivo de expresin en glucosa o glicerol. El inconveniente es que al ser constitutivo, puede no ser adecuado para expresar protenas que supongan efectos negativos para el hospedador. b. Promotor del gen FLD1 de P. pastoris, codificador de una glutatin-deshidrogensasa dependiente de formaldehido. Se puede inducir por metanol o por metilamina (una fuente inocua de N) en medios con glucosa. Los niveles inducidos de expresin con este promotor son parecidos a los del gen AOX1 en metanol.

2. Se necesitan promotores de expresin moderada. Algunos ejemplos: a. Del gen PEX8, que codifica una protena de biognesis del peroxisoma. Suministra expresin a bajo nivel sobre glucosa, y se induce moderadamente (unas 10 veces) cuando las clulas se pasan a metanol. b. Del gen YPT1: confiere expresin baja pero constitutiva en glucosa, metanol o manitol 3. Otra limitacin era la carencia de ms genes marcadores para seleccionar los recombinantes. Hasta hace poco, solo se dispona de HIS4, ARG4 y Sh ble (resistencia al antibitico zeocina). Ahora contamos con otros marcadores: ADE1, URA3.

1.5. VENTAJAS La principal ventaja para la produccin de proteinas recombinantes a gran escala, es la utilizacin de cepas modificadas en su pared celular que permite una fcil y eficiente liberacin del producto intracelular.

Este sistema de recuperacin del producto se puede acoplar a procedimientos de purificacin en un solo paso. Adems, las levaduras son sistemas idneos para mimetizar

funcionalmente a las clulas humanas cuando expresan proteinas desde ese origen. De esta manera se pueden obtener tambin levaduras humanizadas y utilizarlas en bioensayos para la identificacin de molculas con actividad farmacolgica. 1.6. PURIFICACIN

1.6.1. Cromatografa de afinidad La generacin de protenas hibridas de fusin a un pptido con capacidad de unin a matrices especficas, mediante cromatografa de afinidad, permite un elevado grado de purificacin en un solo paso.

La expresin en levaduras de protenas diana permite la realizacin de procesos de Screening de frmacos, mediante la deteccin de las alteraciones fisiolgicas a nivel celular causados por la interferencia de las molculas bioactivas sobre la funcionalidad de la protena.

1.6.2. Cromatografa de exclusin o filtracin en gel La cromatografa de exclusin o filtracin en gel es una clase de cromatografa slido-lquido que permite la separacin de dos o ms sustancias en funcin de su tamao molecular.

Mecanismo de la separacin En la cromatografa de filtracin en gel, se rellena una columna con partculas muy pequeas de una sustancia inerte que contiene pequeos poros (ste es el gel). Para realizar la separacin de molculas de distinto tamao, se aplica sobre el lecho del gel la muestra con estas molculas. Al ir realizando la elucin, las molculas con un tamao mayor que el de los poros del gel se movern slo en el espacio que queda entre las partculas, no sufriendo, por lo tanto, retraso en su recorrido a travs de la columna (se dice que quedan excluidas del gel. Por el contrario, las molculas con un tamao menor que el de los poros difunden hacia el interior y el exterior de stos, con mayor probabilidad cuanto menor es su tamao molecular. Por lo tanto, las molculas eluyen de la columna por orden de tamao decreciente. Se define el intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel como los valores extremos (mximo y mnimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar. El volumen de elucin es el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna. Se llama volumen de exclusin de la columna al volumen al que eluyen las molculas de tamao superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los huecos entre las partculas de gel. Materiales para la filtracion en gel Un gel es una red tridimensional cuya estructura est entrecruzada al azar. Los geles utilizados como tamiz molecular son polmeros hidroflicos

e insolubles cuyas cadenas polimricas se entrecruzan hasta formar una red tridimensional.

Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida. En esta prctica se utilizar el gel dextrano.

El gel de dextrano (polmero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeas bolitas) se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, segn el tamao de poro, proporcionando lmites de exclusion comprendidos entre 1 y 200 000
Propiedades de algunos geles de Sephadex (gel dextrano) Peso molecular, lmites de fraccionamiento Tipo G10 G15 G25 G50 G75 G100 G150 G200 polisacridos hasta 700 pptidos/protenas hasta 700 agua retenida (g/g gel seco) 1.0 1.5 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 20.0 2 3 5 10 12-15 15-20 20-30 30-40 vol. de gel hidratado (ml/g gel seco)

hasta 1 500 100 - 5 000 500 - 10 000 1 000 - 50 000 1 000 - 100 000 1 000 - 150 000 1 000 - 200 000

hasta 1 500 1 000 - 5 000 1 500 - 30 000 3 000 - 80 000 4 000 - 150 000 5 000 - 400 000 5 000 - 800 000

daltons. Estos geles se identifican por una denominacin de G-10 hasta G-200, lo que se refiere a la capacidad de retencin de agua multiplicada por 10. gel

Aplicaciones de la filtracin en gel

Adems de utilizarse para la separacin de sustancias de distintos pesos moleculares o para la purificacin de protenas, se emplea para la determinacin de pesos moleculares de protenas. Para una gran variedad de tipos de geles se ha comprobado que existe una relacin lineal entre el volumen de elucin y el logaritmo del peso molecular de las protenas. Por lo tanto, es suficiente medir el volumen de elucin de una protena desconocida para llevarlo a una recta de calibrado (preparada con protenas puras de peso molecular conocido) y deducir aproximadamente su peso molecular. Esta tcnica puede tambin proporcionar un mtodo para el tratamiento de una protena con un determinado reactivo. Este ser uno de los aspectos a ensayar en el presente experimento. En esta prctica se emplea una columna rellena con Sephadex G-25 (dextrano de alto entrecruzamiento, pequeo tamao de poro).