CLONACIN EN HONGOS

INTEGRANTES:
Cristina Bustos
Maura Fiallos
Johanna Fiallos
Tatiana Ortiz
Jenny Sevilla

INTRODUCCIN
o En estudio y anlisis de ADN eucaritico
ha sido facilitado por su clonacin en
procariontes mediante vectores.
o Secuencias que se pueden adquirir en
grandes cantidades y cambiada in vivo
o in vitro
o Secuencias reorganizadas pueden ser
tomadas de fuera de las bacterias y
colocadas dentro de organismos
eucariontes induciendo modificaciones
en la expresin de genes

o El control gentico se da en
ambientes eucaritico
o Los genes son reintroducidos en su
origen.
o Las clulas de levaduras son ms
fciles de modificar y de crecer.
o Su bioqumica celular es similar que
en eucariontes ms complejos

o Clulas se seleccionan en la
superficie del medio slido.
o Facilidad de manipulacin
o Las dos tcnicas son utilizadas en un
amplio rango de levaduras y hongos
filamentosos.

o Se puede introducir ADN en

levaduras y hongos filamentosos
o Se encontr que los plsmidos de
enterobacterias como R751(INcPb) y
F (IncF) puede facilitar la trasferencia
de plsmidos de E. coli a S.
cereviciae y Schizosaccharomyces
pombe

Destino del ADN introducido en

hongos

o Se confirman
resultados por
endonucleasas
de restriccin
o Leu 2- es
digestada
o Aumento de la
longitud del
fragmento

o Recombinacin ilegtima (plsmido Ti

de Agrobaterium)
o Recombinacin ilegtima obligada
con BamH1 generando fragmentos
de recombinacin.
o Mtodo expandido a otros hongos

Vectores plsmido para uso en

hongos

Plsmido episomal de
lavadura
Primer plsmido YEp construido por
recombinacin de una clonacin
mediante el vector de E. coli con el
plsmido de 2m de levadura de
origen natural.
Este plsmido tiene un tamao de 6.3
kb, un nmero de copias de 50 a 100
por clula haploide y no tiene
ninguna funcin conocida.

Replicacin del plsmido de

levadura
Se aislaron fragmentos cromosmicos de las
secuencias con ADN que permiten a los
vectores de E. coli replicarse en clulas de
levadura.
Estos tipos de secuencias se denominan
ARS (secuencia de replicacin autnoma).
Una ARS es muy diferente de un centrmero
CENTRMERO: acta como un origen de
replicacin
ARS: involucrada en la segregacin
cromosmica

Centrmero de los
plsmidos de levadura
Clarke y Carbon (1980) aislaron un
nmero de hbridos de plsmidos que
contienen segmentos de ADN.
La mayora de los recombinantes
eran en levadura. Sin embargo, uno
de ellos se mantuvo estable a travs
de la mitosis y la meiosis.
El segmento de estabilidad fue
confinado a una regin 1,6 kb

Cromosomas artificiales de
levadura
Los extremos de los cromosomas de la
levadura, como las de todos los dems
cromosomas eucariotas lineales, tienen
estructuras nicas que son llamados telmeros.
Para mantener la integridad de los extremos de
molculas de ADN, la estructura de los
telmeros se ha desarrollado como un
dispositivo que a menudo no se puede terminar
por los mecanismos convencionales de la
replicacin del ADN.

Cromosomas artificiales de
levadura
Szostek y Blackburn (1982) desarrollaron el
primer vector que podra ser mantenido como
una molcula lineal, imitando de ese modo un
cromosoma, mediante la clonacin de los
telmeros de levadura en un YRp. Tales
vectores son conocidos como cromosomas
artificiales de levadura (YAC).
Su estabilidad mejora cuando el tamao de la
insercin se incrementa. Por lo tanto, no hay
ninguna limitacin prctica para el tamao de
un YAC y son herramientas esenciales en
cualquier proyecto de secuenciacin del
genoma.

Retrovirus como
vectores

Ty secuencia de 5.9 kb en el genoma de

S. cerevisiae.
Que consiste en una regin central que
tiene dos marcos largos abiertos de
lectura (ORFs) que tiene dos terminales
idnticos constituido por repeticiones
llamados delta.
Cada elemento delta tener un promotor
con secuencias que son reconocidas por
la enzima de transposicin.
En la transcripcin Ty se convierte en
una molcula de ADN por una
transcriptasa reserva
Se aplico con el virus de
inmunodeficiencia humana (VIH)

Eleccin del vector para

clonacin

Hay tres razones para la

clonacin de los genes en la
levadura.
1.La posibilidad de utilizar levadura
como un husped de clonacin
para la sobreproduccin de
protenas de valor comercial.
La levadura da un nmero de
ventajas, tales como la capacidad
de glicosilar las protenas durante
la secrecin y la ausencia de
toxinas.
La levadura tambin se utiliza en la
produccin de alimentos y
bebidas.

Eleccin del vector para

clonacin
2. La clonacin de genes en la levadura
es la capacidad para clonar grandes
fragmentos de ADN. Aunque no hay
lmite terico para el tamao del ADN
que puede ser clonado en un plsmido
bacteriano, los plsmidos grandes
recombinantes exhiben inestabilidad
estructural y segregadora.
3. Los genes clonados pueden ser
analizados fcilmente

Construccin de plsmido por

recombinacin homloga en
levadura
El gen clonado se mueve a un plsmido
diferente.
El anlisis gentico puede requerir
muchos alelos diferentes de un gen
clonado
para
estudios
funcionales
posteriores.
Los plsmidos linealizados se reparan de
manera
eficiente
durante
la
transformacin de levadura mediante
recombinacin con un fragmento de
restriccin de ADN homloga.

 Se
remueve
HIS3
de
pBR328 a YEp420.
Fragmento de HIS3 se
mezcla con YEp420 que ha
sido linealizado con EcoRI y
la mezcla se transform en
levadura.
Dos eventos cruces que se
producen entre regiones
homlogas que flanquean
el sitio EcoRI de Yep420
resultar en la generacin
de un YEp recombinante
que contiene tanto los
genes HIS3 y URA3.

Expresin de genes clonados.

Hubo muchos intentos fallidos para
expresar genes heterlogos de eucariotas
bacterianas o ms altos cuando la
manipulacin gentica de los hongos se
hizo posible por primera vez.
Estructura de hongos tiene una estructura
especial; cuatro elementos estructurales
pueden ser reconocidos en el promotor de
la levadura.

Expresin de genes
clonados

Varias secuencias de consenso se

encuentran en el sitio de iniciacin de la
transcripcin. Dos de estas secuencias, TC
(G / A) y PuPuPyPuPu, representan ms de
la mitad de los sitios de inicio de levadura
conocidas.
La TATA box, esta es una regin rica en AT
con la secuencia cannica TATAT / AAT / A,
que se encuentra 60-120 nucletidos
antes del sitio de iniciacin.
Tercer y cuarto elemento estructura son
secuencias de activacin y secuencias

Expresin de genes
clonados.
La unin de protenas de control
positivas a UAS aumenta la tasa de
transcripcin y la supresin de la UAS
suprime la transcripcin.
La unin de protenas de control
negativas a URS reduce la tasa de
transcripcin de los genes que
necesitan
ser
regulados
negativamente.

Expresin de genes
clonados

El nivel de la transcripcin puede ser

afectada por secuencias localizadas en el
gen en s y que se hace referencia a
secuencias de activacin DAS.
Cuando se utiliza el promotor de
fosfoglicerato quinasa, varias protenas
heterlogas se acumulan a 1% - 2% de la
protena celular total, mientras que en s
fosfoglicerato quinasa acumula a ms de
50 por ciento.
Estas cantidades decepcionantes de
protena heterloga reflejan los niveles

Sobreexpresin de protenas
en hongos.
El primero sobre los sistemas de expresin
desarrollado fueron para S. cerevisiae y
utilizan los promotores de genes que
codifican enzimas glucolticas abundantes,
alcohol deshidrogenasa ADHI, PGK o
gliceraldehdo 3 fosfato deshidrogenasa
GAP.
Ahora hay una gran variedad de promotores
nativos y de ingeniera disponibles, que
difieren en la fuerza, la regulacin y la
relacin de induccin.
El promotor ideal es aquel que est
estrechamente regulada de modo que la
fase de crecimiento se puede aislar de la
fase de induccin. Esto disminuye la

Sobreexpresin de protenas
en hongos.
El promotor ideal tambin tendr una alta
relacin de induccin.
Un
promotor
que
tiene
estas
caractersticas y que ahora es el ms
utilizado es a partir del gen GAL1. En la
levadura, la regulacin galactosa es ahora
muy bien estudiado y se ha convertido en
un sistema modelo para la regulacin de la
transcripcin eucaritica.

Sobreexpresin de protenas en
hongos

Sobreexpresin de protenas
en hongos.
La transcripcin de GAL1 es limitado por la
proteina GAL4.
Sin embargo, la expresin GAL4 puede
estar fusionado al promotor GAL10,
expresin GAL4 est ahora regulada por
galactosa.

VECTORES ESPECIALISTAS

VECTORES ESPECIALISTAS

VECTORES
ESPECIALISTAS

VECTORES ESPECIALISTAS

DISPLIEGUE LEVADURAS EN LA
SUPERFICIE

DISPLIEGUE LEVADURAS EN LA SUPERFICIE

DETECCIN DE INTERACCIONES
PROTENA-PROTENA
Chien et al (1991) han hecho
uso de las propiedades de la
protena GAL 4 en un mtodo
para

la

deteccin

interacciones

de

protena-

protena
La

protena

GAL

posee

dominios separados para la

unin a ADN -UAS y para la
activacin transcripcional
Los

plsmidos

construidos

fueron
con

la

codificacin de dos protenas

DETECCIN DE INTERACCIONES PROTENAPROTENA

IDENTIFICANDO GENES
QUE CODIFICAN
ACTIVIDADES
PARTICULARES
CELULARES

 Es conocido que las secuencias de genes

codifican cada actividad bioqumica de
S.cervisiae.
Martzen at al. (1999) han desarrollado un rpido
y sensible mtodo para conectar actividades
bioqumicas especficas con genes particulares
Punto inicial : un vector de levadura que
contiene el gen glutatin S-tranferasa (GST) bajo
el control del promotor CUPI.
Un largo nmero de diferentes fragmentos de
ADN que lleva la levadura ORFs (seis marcos
abiertos de lectura) fueron clonados en este
vector para generar la fusin GST-ORF.

Los diferentes transformantes fueron

dispersadas en 64 -96 placas de microtitulacin
(64x 96 =6144) para correlacionar genes con
actividad.

Las fusines GST-ORF son fcilmente

purificados por cromatografa de afinidad
usando glutatin inmovilizado.

Una vez que se identific una placa con la

actividad deseada, se hicieron grupos de clones
de cada sistema de 8 filas y pozos de 12
columnas y estos 20 posillos se volvieron a
ensayar. (punto de interseccin identificara el
clon deseado entre la columna y fila
identificada)

La secuenciacin de la ORF entonces permite la

identificacin del gen correspondiente a la
actividad

Determinacin de funciones
asociadas con un gen
particular

Esto consiste en la determinacin del perfil de

expresin del gen, la ubicacin subcelular de la
protena, y el fenotipo de una cepa nula que carezca
de la protena.
Ross Macdonal (1997) desarrollo un sistema basado
en la transposicin , generando de forma
simultanea todos los constructos (unin ADN plasmido) y es adecuado para la muta gnesis de
cualquier gen de S.cerviciae.

Cada uno lleva un gen reportero (-galactosidasa o

la protena verde fluorescente) que carece de un
promotor. Que se detectan por la actividad de la
enzima o por la fluorescencia.

 Genes de levadura se clonan en una cepa

de E.coli
que sobreexpresa la Tn3
transposasa , esto es llevado sobre un
derivado del factor sex F, que es introducido
por
apareamiento
producindose
la
transposicin .
El ADN que contiene el transposn es
escindido del vector y se transforma en
parte de E.coli por la actividad del marcador
URA3.
No se reporta actividad si se ve que se
produce la recombinacin homloga en el
lugar URA3, pero la funcin del gen se
pierde.
Este reporte de actividad puede ser util
para estudiar la expresin del gen clonado
bajo diferentes condiciones de crecimiento.

 Si los transformantes llevan un gen de fago P1,

bajo el control del promotor GALL, la escisin de la
mayora de las secuencias de transposones puede
ser inducida por el crecimiento de la cepa husped
en presencia de galactosa.
Si se emplea anticuerpos contra la hemaglutinina
se restaura la actividad del gen y se puede
purificar.
El anlisis mutacional a gran escala de genoma de
la levadura es eliminar individualmente cada gen
usando una reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) metodologa basada.

 Para cada gen, un casete supresor es construido que

contiene un gen de resistencia
Un grupo de cepas mutantes de levadura por lo tanto se
puede analizar en un solo experimento mediante la
amplificacin de los cdigos de barras.