INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
SEGUNDO SEMESTRE CICLO 2019-2020
GUÍA DE INVESTIGACIÓN

Programa Académico: Ingeniería Biotecnológica

Unidad de Aprendizaje: Ingeniería Enzimática Nivel: IV Grupo: 4BM1
Profesor: César Agustín Jiménez Sierra

UNIDAD V: Inmovilización de enzimas.

Tema: Catálisis con enzimas inmovilizadas.
Fecha: 25/mayo/2020.

Gonzalez Estrella Rosa Angelica

Curiel Giles Paola Abigail
Diaz Leal Gutiérrez David
Lozada Reséndiz Juan Carlos Ramón
Ramírez Pineda Juan Carlos

Si bien la inmovilización de enzimas genera múltiples ventajas, también presenta diversas

limitantes y requerimientos diferentes a los de las enzimas libres. Es necesario, por tanto, conocer
cuáles son dichas limitantes y los mecanismos que permite compensarlas o reducirlas para
obtener procesos rentables. Uno de los aspectos para ello es el diseño y adecuada selección de los
reactores y condiciones de operación adecuados para sistemas inmovilizados.

1. ¿Cuáles son las principales limitantes que se presentan al trabajar con enzimas
inmovilizadas (mencionar al menos 6)?

 La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.

 La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas
fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.
 Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la movilización.
 A menudo, la inmovilización altera significativamente el comportamiento de las
enzimas.
 La actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional, estérico y del
microentorno.

(2020). Retrieved 27 May 2020, from http://www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdf

2. ¿Qué son el porcentaje de inmovilización y la eficiencia del catalizador inmovilizado o

inmovilización? ¿Cómo se calculan?
La cantidad de enzima inmovilizada se determinó midiendo las concentraciones en la solución
enzimática inicial (mg proteína inicial), el sobrenadante y en las soluciones de lavado (mg
proteína final) usando un reactivo, según la metodología del fabricante (AMRESCO). A partir de
estos datos se calcularon el porcentaje de inmovilización y los mg de proteína/g de soporte.

(2020). Retrieved 27 May 2020, from http://www.scielo.org.pe/pdf/rsqp/v82n4/a09v82n4.pdf

La cantidad de enzima inmovilizada en perlas de quitosano, en cada perla (Ep) se estima como la
diferencia entre la cantidad de enzima inicial y la enzima que queda en el sobrenadante,
dividido por el número de perlas, de acuerdo con la Ec. 4. El porcentaje de inmovilización se
obtiene según la Ec. 5.
Siendo:
enzima comercial (Eo),
para el sobrenadante de las perlas (Es).

(2020). Retrieved 27 May 2020, from

http://www.edutecne.utn.edu.ar/cytal_frvm/CyTAL_2012/TF/TF028.pdf

3. ¿Qué es el efecto difusional? ¿Cómo se puede reducir este efecto en sistemas

inmovilizados?
Como consecuencia de la inmovilización, la difusión de los sustratos hacia el centro activo de la
enzima puede estar impedida por resistencias de tipo externo e interno.

a) resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el medio de reacción, el

sustrato deberá atravesar la película líquida estacionaria (capa de Nernst o de disfusión) que
rodea el soporte. En las proximidades de un soporte no cargado, la concentración de sustrato es
menor que en el resto de la disolución, puesto que existe un gradiente de concentración a
través de la zona de difusión. Por tanto, los valores de km para las enzimas inmovilizadas son
siempre aparentes (km’)
b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que atravesar el interior
del gel, microcápsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada.
Existen diversas maneras de minimizar estos efectos difusionales como por ejemplo: disminuir
el tamaño del biocatalizador, aumentar la concentración de sustrato, incrementar la agitación o
el flujo en el reactor, etc. Con estas medidas se consigue reducir el grosor de la capa de Nernst,
y como consecuencia, el valor de km’ disminuye.

(2020). Retrieved 28 May 2020, from http://www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdf

 4. ¿Qué es la generación de microambientes en la superficie de soportes de inmovilización?
¿Qué es la partición, generada por este efecto y cómo se compensa?

La inmovilización altera el comportamiento de las enzimas.Se produce una alteración del

microentorno de la enzima debido a su interacción con el soporte, haciendo por ejemplo que
enzimas sensibles al oxígeno, como nitrogenasas ó hidrogenasas, vean favorecida su actividad
cuando están inmovilizadas, debido a que la fuerza iónica que tiene el entorno disminuye la
concentración efectiva de oxígeno en el medio.

Inmovilización de enzimas. (2020). Retrieved 28 May 2020, from

https://apuntesbiotecnologiageneral.blogspot.com/2014/09/inmovilizacion-de-enzimas.html

La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual, especialmente cuando

el soporte tiene grupos cargados eléctricamente. El efecto observado suele ser un
desplazamiento en el valor del pH óptimo de la catálisis enzimática y, muchas veces, un
ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una
enzima unida a un soporte cargado negativamente (v.g. CM-sephadex) tendrá en su
microentorno una concentración mayor de hidrogeniones que en el medio de reacción. Como
resultado, la enzima inmovilizada será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más
activa a pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente (v.g. DEAE-
sephadex).

(2020). Retrieved 28 May 2020, from http://www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdf

5. ¿Cómo se ven alteradas las constantes cinéticas de una enzima a causa de las limitantes
de la inmovilización?

Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por
diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimática puede ser debido a que:
1. la unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo está
impedido
2. los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún aminoácido que forme parte del centro
activo o que sea esencial para la actividad catalítica de la enzima
3. la inmovilización puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva,
4. las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalización o desactivación de la
enzima.

Si la pérdida de actividad no es total después de la inmovilización, los cambios (disminución o

aumento de la actividad enzimática) se deberán principalmente a efectos difusionales,
electrostáticos, estéricos y/o del microentorno.

1) Efectos difusionales:
Como consecuencia de la inmovilización, la difusión de los sustratos hacia el centro
activo de la enzima puede estar impedida por resistencias de tipo externo e interno.
 a) resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el medio de reacción,
el sustrato deberá atravesar la película líquida estacionaria (capa de Nernst o de
disfusión) que rodea el soporte. En las proximidades de un soporte no cargado, la
concentración de sustrato es menor que en el resto de la disolución, puesto que existe
un gradiente de concentración a través de la zona de difusión. Por tanto, los valores de
km para las enzimas inmovilizadas son siempre aparentes (km’)
b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que atravesar el
interior del gel, microcápsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima
inmovilizada. Existen diversas maneras de minimizar estos efectos difusionales como
por ejemplo: disminuir el tamaño del biocatalizador, aumentar la concentración de
sustrato, incrementar la agitación o el flujo en el reactor, etc. Con estas medidas se
consigue reducir el grosor de la capa de Nernst, y como consecuencia, el valor de km’
disminuye.

2) Efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que, si tienen la

misma carga existe una repulsión mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay
atracción. Cuando el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de km’
aparente puede verse reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en
disolución. Hornby y cols. (13) desarrollaron una expresión matemática que permite
calcular la actividad de las enzimas inmovilizadas, teniendo en cuenta tanto los factores
de difusión como los electrostáticos. La expresión de Michaelis-Menten en este caso es:

donde x=espesor de la capa de Nernst; D=coeficiente de difusión; T=temperatura (ºK);

z=valencia del sustrato; F=constante de Faraday; R=constante universal de los gases y
V=gradiente de potencial en el soporte. Se puede disminuir el valor de km’, variando
tanto el término de difusión como el término electrostático. En el primer caso, la
disminución del valor de km’ se consigue al disminir el tamaño del soporte (con lo que
disminuye el término “x”) o al aumentar el flujo o la agitación. En el término
electrostático, si “z” y “V” tienen el mismo signo, es decir si el soporte y el sustrato
tienen la misma carga, el término electrostático es menor de 1 y km’ aumenta. Si tienen
cargas opuestas, la km’ disminuye. Si no poseen carga, km’ sólo dependerá del témino
de disfusión.

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 6. ¿Cuáles son los principales tipos de reactores empleados para sistemas inmovilizados
(mencionar el menos 5 y describir brevemente al menos 1)?

Reactores enzimáticos que utilizan enzimas inmovilizadas

Reactores de membrana: se emplean membranas permeables al producto final, permeables o

no al sustrato y no permeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo líquido
de sustrato que atraviesa al reactor. La enzima se adsorbe previamente sobre la membrana.

Inmovilización de enzimas. (2020). Retrieved 28 May 2020, from

https://apuntesbiotecnologiageneral.blogspot.com/2014/09/inmovilizacion-de-enzimas.html

Ultrafiltracion:
Reactores de mezcla completa que por la naturaleza selectiva de las membranas de separacion
se pueden separar compuestos con pesos moleculares altos y bajos
Ventajas: operan de forma similar que con las enzimas soluble
Desventajas: Pueden taponarse la membrana si hay particulas insolubles, no pueden operar a
caacidades elevadas

Lecho fluizado:
Las particulas del biocatalizador se suspenden y mezclan por el rapido fluido ascendente del
sustrato
Ventajas: ideal para sustratos colodales o insolubles
Desventajas: dificil de operar, se puede perder enzima inmovilizada

Continuo de leho empacado:

El sustrato pasa atraves del lecho de enzima inmovilizada y el producto se obtiene ala salida
El grado de conversion se controla regulando el tiempo de permanencia en el reactor, la
velocidad de flujo y las dimensiones del reactor
Ventajas: menor costo, facil operacion y mejor control de calidad de productos
Desventajas: menor grado de conversion y altas caidas de presion para derivados de tamaño de
particula pequeño

Tanque agitado continui:

Consiste en un tanque con una entrada de sustrato y una salida de producto
Ventajas: se requiere de un menor volumen de reactor.
Desventajas: se puede perder enzima en la separacion y por ruptura del soporte

Tanque agitado discontinuo:

(Con alimentacion por lote discontinuos)Se mezcla el sustrato con la enzima y una vez alcanzado
el grado de reaccion deseado se descarga
Ventajas: Mejora el rendimiento(limitaciones difusionales)
Desventajas: utiles paa tranajas a pequeña y mediana escala, se puede perder enzima en la
separacion y por ruptura, se emplean comunmente con enzimas solubles

Reactores para enzimas inmovilizadas (Ventajas: (4. Altas velocidades de…. (2020). Retrieved
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inmovilizadas