18.

Estimulación y medida de
proliferación y apoptosis

David Díaz
 Proliferación celular
1. Estimulación del crecimiento celular
1. Estimulación policlonal: Mitógenos: PHA, ConA, ésteres de forbol

2. Medida del crecimiento celular

1. En bruto
1. Incorporación de 3H-T

2. En células individuales
1. Microscopia y contadores hematológicos
2. Análisis del contenido de DNA
1. Estimulación del crecimiento celular

Mitógeno

Proliferación
 1.1. Estimulación policlonal del crecimiento celular
mediante moléculas mitogénicas

TCR

PKC

T T

Fitohemaglutinina (PHA)
Concanavalina A (ConA) Superantígenos bacterianos Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)

La capacidad de proliferación in vitro de los linfocitos T tras estimulación con lectinas mitogénicas de plantas
PHA y ConA es el método más común de medida de respuesta proliferativa

PMA es un agonista de PKC y su principal desventaja es su toxicidad

Medida del crecimiento celular
 2.1.1. En bruto: cuantificación de la replicación
utilizando timidina tritiada (3H-T)
3H-timidina

1º replicación

3H-timidina

2º replicación

3H-timidina

3º replicación
2.1.1. En bruto: cuantificación de la replicación
utilizando timidina tritiada (3H-T)

n Técnica muy sensible

n Correlaciona con la síntesis bruta de DNA,
pero no con el crecimiento neto
n Muy eficiente en tiempo
n Utiliza isótopos radioactivos
2.2.1. En células individuales: Microscopia. Cámara de contaje

1 mm
0.1 mm
1 mm

Volume : 0.1mm3

1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3

http://sites.google.com/site/inmunotutoriales/citometriadeflujo-inmunofenotipo
http://www.dailymotion.com/video/xcf6vx_cell-counting-suspension-cell_tech
2.2.1. Cámara de contaje con azul tripán
n Sonda vital: sonda catiónica excluida por células
viables pero permeable en células no viables
n Permite medida directa del número de células
viables
n Muestra poco representativa: errores de contaje
elevados
 Método automatizado para la determinación óptima
del número de células y viabilidad por azul tripán

Viable Dead
cell cell
Innovatis

Marked viable and dead cells

En células individuales: Microscopia o
contadores hematológicos
n Problema las células se cultivan a
densidades muy bajas 50-1000 x 103
n Microscopia tedioso
n Contadores impreciso
n No informan de subpoblaciones celulares:
microscopia de fluorescencia o confocal. Los
inmunólogos del siglo XXI necesitamos otros
métodos
2.2.2. Análisis del contenido de DNA
Cantidad de DNA en células individuales

Fase Cantidad DNA

G0/G1 2n

S 2n-4n

G2/M 4n
Cantidad de DNA en células individuales
Yoduro de propidio (PI)

Fijación

Permeabilización

http://www.youtube.com/watch?v=JuHk08g6NMg
2.2.2. Análisis del ciclo celular

G0/G1
S
M1 G2/M
M3
M2

2n 4n
 Apoptosis
n Inducción de apoptosis
q Inhibidores de la síntesis de proteínas
q Interferencia con el ciclo celular

n Medida de apoptosis
q En bruto
n Electroforesis: patrón en escalera
q En células individuales
n Comet assay
n Traslocación de PS
Inducción de apoptosis

n La cicloheximida (cycloheximide, CHX) es un

antibiótico producido por Streptomyces griseus. Su
principal actividad biológica es inhibir la síntesis de
proteínas en células eucariotas, lo que conduce a
un arresto del ciclo celular y a la muerte celular.

n La estaurosporina (staurosporine, ST), un inhibidor

de la proteína quinasa, ha sido caracterizado como
un potente inductor de apoptosis en muchos tipos
celulares
Inducción de apoptosis: Interferencia con el
ciclo celular
n Etoposido induce apoptosis en fase S.
Inhibidor de la topoisomerasa II.
Quimioterapia

n Radiación en S y G2/M
Medida de apoptosis
 Cambios característicos de la apoptosis Técnicas
Deshidratación celular, condensación del microscopía óptica
citoplasma, disminución del tamaño y cambio microscopía
en la apariencia. electrónica
citometría de flujo
Condensación de la cromatina (media luna). microscopía óptica
Desintegración de la envoltura nuclear, microscopía óptica
degradación de lamina, (cariorresis
fragmentación nuclear).
Emisión de cuerpos apoptóticos (fragmentos microscopía óptica
nucleares acompañados de restos de orgánulos microscopía
citoplásmicos rodeados de membrana electrónica
plasmática) son fagocitados por las células
vecinas sin estimular una respuesta inflamatoria.
Activación de endonucleasas Patrón en escalera
de migración del
DNA en gel.
microspopía óptica
Citometria de flujo
Preservación de la integridad estructural y parte Microscopía óptica
de la función de la membrana. Citometría de flujo
Orgánulos (mitocondrias y lisosomas) Citometría de flujo
mantienen su estructura aunque su función se
altera
Perdida de asimetría de los fosfolípidos de Citometría de flujo
membrana exposición de fosfatidil serina
En bruto. Electroforesis: patrón en escalera

n Extracción de DNA y electroforesis

n Sello distintivo (Hallmark) de apoptosis
Electroforesis: patrón en escalera
En células individuales: Comet assay
Comet assay
CAMBIOS EN LA COMPOSICIÓN LIPÍDICA:
AUMENTO DE FOSFATIDILSERINA (PS)

- Translocación de la PS durante la apoptosis

- La translocación es universal y específica
- Anexina V reconoce específicamente PS
- Combinación con sondas vitales (7AAD)
CAMBIOS EN LA COMPOSICIÓN LIPÍDICA:
AUMENTO DE PS
CAMBIOS EN LA COMPOSICIÓN LIPÍDICA:
AUMENTO DE PS

R2
R3
Habéis aprendido

n Estimulación de células para su crecimiento

y/o inducción de apoptosis
n Determinación de crecimiento celular y
apoptosis