Fluoróforos para microscopía

confocal
Fluoróforos
Fluoróforo, es una molécula fluorescente que absorbe un
fotón de luz a una determinada longitud de onda y, después
de un breve intervalo, emite un fotón de energía a diferente
longitud de onda
Stoke’s shift
 Propiedades de los fluoróforos
Propiedad
Espectro de excitación
Espectro de absorción
Espectro de emisión
Coeficiente de extinción (EC)
Variación de Stoke (Stoke’s Shift)
Rendimiento cuántico de fluorescencia (QY)
Enfriamiento/Extinción (Queching)
Fotoblanqueado (Photobleaching)
Configuración óptima de la luz de excitación
Similar al espectro de excitación
Longitud de onda a la cual se emiten los
fotones absorbidos
Capacidad de absorción de luz a una
longitud de onda específica
Diferencia entre los máximos de excitación y
emisión (gran ventaja)
Número de fotones de fluorescencia emitidos
por fotón absorbido
Pérdida reversible de la fluorescencia
(entorno)/Disminución QY
Pérdida irreversible de la fluorescencia
(ROS)
Tipos de marcaje
Microscopía de
Epitope tags
inmunofluorescen
Acoplamiento del DNA probes
Fluoróforo se cia
liga fluoroforo a un
directamente a químico que se
liga a la
la estructura
estructura celular
celular

Indicadores para
DAPI Rhodamine-Phalloidin parámetros
dinámicos
Phalloidin: es una
intracelulares
toxina de hongo que
se une a F-actina
Nanocristales (Qdot)
Fotoblanqueado
“Photobleaching”
Fotoblanqueado

El citoesqueleto de células se tiñó con fluoresceína y colorante Texas Red, se excitó con láser 488 o 594 nm
¿Cómo reducir el fotoblanqueado?
1. Fluoroforo con alta fotoestabilidad
2. Evitar el oxígeno
1. Desoxigenación del espécimen (Burbujeo con Nitrógeno)
2. Antioxidantes (antifade)
1. Carotenoides ( crocetin, etretinate) Cultivos celulares
2. Analogos de la vitamina E, vitamina C, glutatión reducido,
imidazol, cysteamine y el aminoácido histidina
3. DABCO
3. Limitar el tiempo de exposición
 Emisión cruzada (Crosstalk)
Marcaje múltiple (utilización
de más de un fluoróforo)

1.-Excitación cruzada
2.-Emisión cruzada
¿Cómo elegir un buen fluoróforo?
• Definir la naturaleza del fluoróforo en base a la estructura que se desea
marcar
• Ubicar los espectros de las fuentes de iluminación del microscopio
confocal (láser o lámparas que se tienen)
• Si es marcaje múltiple, utilizar fluoróforos como amplia variación de Stoke/
o ubicar los filtros
https://igene.thermofisher.com/products/selector/dyes
Microscopía confocal
Ventajas Desventajas
Mayor resolución Lenta velocidad de escaneo
provocando fotoblanqueado
Co-localización
Reconstrucción de imágenes en 3D
Mayor contraste
Realizar secciones ópticas
Analisis de imágenes
Imágenes lambda