FLUOROMETRIA y FOSFORIMETRIA

Luminiscencia: Se pierde una parte de exceso de energía como calor y emite la energía remanente como radiación
electromagnética de una longitud de onda mayor que la absorbida.

Cuando una molécula tiene un estado electrónico excitado más estable que el usual, el exceso de energía vibracional
será disipado por colisiones, mientras que la molécula permanece en el estado electrónico excitado; más tarde la
molécula sigue uno de los dos caminos siguientes:

 regresa directamente al estado electrónico basal con la emisión de radiación (fluorescencia)

 puede desplazarse a un nivel triplete metaestable antes de emitir radiación (fosforescencia)

PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS

 Tiempo de vida típico para un estado electrónico excitado es de cerca de 10 -8 s

o Los materiales que presentan fluorescencia emiten el exceso de la radiación dentro de 10- 8 a 10-4 s,
después de la absorción (compuestos orgánicos)
o El tiempo de vida de la fosforescencia es mucho mayor, en un rango de 10-4 a 20 s o más (boro
dicetonatos multiciclicos)
 Pocas sustancias presentan fluorescencia o fosforescencia, los métodos analíticos que emplean estas
propiedades presentan alta sensibilidad y selectividad.
 La mayoría de sustancias que presentan fluorescencia o fosforescencia son moléculas orgánicas grandes, rígidas
o multicíclicas. En algunos casos, la rigidez es el resultado de la formación de complejos con un ion metálico, la
luminiscencia puede ser usada como una metodología para el análisis de cationes metálicos.

ESTADO ESPÍN DE UN ELECTRÓN

En un sistema con n número de electrones desapareados se tienen (n + 1) desdoblamientos degenerados o estados de

igual energía asociados con el espín del electrón (estado singulete, doblete, triplete, etc)

Cuando la radiación UV/vis de la frecuencia apropiada es absorbida por una molécula, uno o más de los electrones
apareados (generalmente un electrón π) es elevado a un estado singulete excitado, en el cual el espín del electrón
promovido no cambia y el espín neto es todavía cero. Sin embargo, en determinadas condiciones (cruce de intersistema)
un grupo de espines electrónicos pueden ser desapareados y los dos electrones desapareados están en igual sentido y se
genera un estado triplete excitado.

FACTORES DE LA ESTRUCTURA MOLECULAR QUE AFECTAN LA LUMINISENCIA

 Debe poseer una estructura molecular que absorba radiación ultravioleta o visible.

 Entre más grande sea la absorbencia de una molécula más intensa es su luminiscencia. Las moléculas que
contienen dobles enlaces conjugados y alto grado de estabilidad de resonancia, son particularmente útiles para
estudio.

 Los hidrocarburos aromáticos, particularmente rígidos, planos, con estructuras multicíclicas son ideales. Los
anillos aromáticos que contienen heteroátomos generalmente presentan mejor fosforescencia que
fluorescencia.

 En el caso de los sustituyentes presentes en compuestos aromáticos:

 Los grupos donadores de electrones generalmente mejoran la fluorescencia

 Un átomo de número atómico grande en un sistema electrónico π generalmente mejora la

fosforescencia y disminuye la fluorescencia.
  Los grupos desactivadores del núcleo disminuye o incluso destruye la fluorescencia.

Reacción química y extinción (quenching) de oxígeno pueden competir con la luminiscencia. El oxígeno disminuye la
intensidad de la fluorescencia de un compuesto orgánico por oxidación; generalmente, el oxígeno extingue los estados
singuletes y tripletes excitados por la promoción del cruce de intersistema a través de colisiones con las especies
excitadas y forma un complejo de transferencia de carga transitoria.

FACTORES DE ESTRUCTURA MOLECULAR EN LUMINISCENCIA: Los iones cloruro disminuyen la fluorescencia

ESPECTRO DE EXCITACIÓN CONTRA ESPECTRO DE EMISIÓN

 Espectros de excitación: Se obtienen a partir del registro de la intensidad luminiscente a una longitud de onda
determinada.
 Espectros fluorescentes y fosforescentes: implican excitación a una longitud de onda fija mientras se registra la
intensidad de emisión como función de la longitud de onda.

RENDIMIENTO CUÁNTICO DE LA FLUORESCENCIA MOLECULAR

Relación entre el número de moléculas que fluorescen y el número de moléculas excitadas, o la relación de fotones
emitidos y fotones absorbidos. Crece en cuanto a la fluoresencia está presente

INSTRUMENTACIÓN

Los componentes principales de cualquier instrumento de luminiscencia incluyen:

 Fuente de radiación.
 Monocromador.
 Celda de muestra
 Detector.

Fuente de radiación

Lámpara de arco de xenón o de mercurio

• Más común en fluorómetros de filtro es la lámpara de arco de mercurio a baja presión equipada con una
ventana de sílice fundida.

• Para los espectrofluorómetros en donde se requiere una fuente de radiación continua, se utiliza una lámpara de
arco de xenón a elevada presión de 75 a 450 W

Monocromadores y detectores

La mayoría de los espectrofluorómetros están equipados con monocromadores.

Detectores: Los tubos fotomultiplicadores han sido ampliamente utilizados como detectores en instrumentos de
fluorescencia sensibles. Los detectores de diodos alineados también han sido propuestos para los espectrofluorómetros.

Cubetas: Vidrio, sílice o cuarzo

FLUORÓMETROS

El haz que proviene de la lámpara de mercurio se divide en un haz de referencia y en un haz de muestra. Ambos haces
pasan a través del filtro primario y el haz de referencia es entonces reflejado hacia el tubo fotomultiplicador de
referencia. Las salidas eléctricas de los dos detectores están conectadas a un comparador de estado sólido, el cual mide
la relación de intensidades entre la muestra y la referencia; esta relación sirve como parámetro analítico.

ESPECTROFLUORÓMETROS
Permiten obtener de manera simultánea el espectro de excitación y de emisión. Los espectrofluorómetros utilizan dos
monocromadores de red, la radiación del primer monocromador se desdobla en dos, una parte pasa a través del
fotomultiplicador de referencia y otra por el de la muestra. La radiación fluorescente resultante, después de ser
dispersada en el segundo monocromador, se detecta en un segundo fotomultiplicador.

FOSFORÍMETROS

Similares a los fluorometros y espectrofluorometros, pero requieren dos componentes adicionales:

 Un dispositivo que alternativamente irradia la muestra y, después de un tiempo adecuado, mide la intensidad de
fosforescencia..
 Normalmente las medidas de fosforescencia se llevan a cabo a la temperatura del nitrógeno líquido, con el
objeto de prevenir la degradación de la radiación de salida por des activación colisional. Normalmente forma
parte del fosforímetro un recipiente Dewar con ventanas de cuarzo. A esta temperatura, el analito está en un
cristal de disolvente sólido (el disolvente más usual es una mezcla de dietil eter, pentano y etanol)

CALIBRADO DEL INSTRUMENTO

La estandarización a menudo se lleva a cabo con una solución sulfato de quinina aproximadamente 10-5 M. Esta
disolución generalmente se excita con una radiación de 350 nm y emite radiación a 450 nm.