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DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA
ELABORADO POR:
México D. F.
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PRÓLOGO
procesos en los que se emplea un agente biológico (organismo, tejido, célula, organelo o
enzima) para transformar una materia prima en un producto o bien de interés. Las
etc…), transformar metabolitos para combinar la producción con síntesis química, facilitar el
Si bien existen diversos agentes biológicos y de diversos orígenes que se emplean para
llevar a cabo una Bioconversión, las más utilizadas y sencillas de emplear son las células y
enzimas de origen microbiano (Bacterias y Levaduras). Es por esto, que este curso se enfoca
las que opera. Es por ello, que el objetivo del laboratorio, además de la realización de las
cabo.
2
ÍNDICE
PRÓLOGO .............................................................................................................................................. 2
ÍNDICE ................................................................................................................................................... 3
REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA. ..................................................................... 4
INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES .................................................................. 6
C.1. CAPACITACIÓN DEL USO Y MANEJO DE LOS EQUIPOS DE LABORATORIO. ................................... 6
C.2. Adiestramiento en el uso, funcionamiento y bases del Espectrofotómetro y centrífugas ......... 10
C.3. PREPARACIÓN DE REACTIVOS REQUERIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES. ...... 14
C. 4. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES. ......................................................................... 14
C.5. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA .................................................................................................. 16
PRÁCTICA 1. Determinación de crecimiento celular por turbidimetría (D.O.), peso seco y cuenta
directa en cámara de Neubauer ......................................................................................................... 18
PRÁCTICA 2. Determinación de actividad enzimática y efecto de la concentración de enzima. ....... 22
PRÁCTICA 3: Efecto de pH y temperatura en la actividad enzimática de la invertasa ....................... 26
PRÁCTICA 4: Determinación de las constantes cinéticas de la enzima libre ...................................... 29
PRÁCTICA 5: Inmovilización de Enzimas ............................................................................................. 33
PRÁCTICA 6: Determinación de las constantes cinéticas y estabilidad de la enzima Inmovilizada .... 39
PRÁCTICA 7: Conocimiento, preparación y esterilización de un Biorreactor con medio de cultivo. .. 43
PRÁCTICA 8: Producción de enzimas con células libres ...................................................................... 46
PRÁCTICA 9: Inmovilización celular y Producción de enzimas con células inmovilizadas .................. 52
ANEXO I. Preparación de soluciones. .................................................................................................. 59
ANEXO II. Técnicas y Determinaciones. .............................................................................................. 61
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4
Reglamento aprobado por la Academia de Biotecnología de UPIBI en su cuarta reunión ordinaria del
primer semestre 2001-2002 del 9 de noviembre de 2002.
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Objetivo general
Objetivos particulares
Capacitar al alumno en el uso de micropipetas, espectrofotómetro, centrifuga e
instrumental de laboratorio.
Preparación del reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) y del reactivo de
Bradford
Elaboración de las curvas estándar para la determinación de azúcares reductores y
proteína
Posición Inicial1 2 3 4
Primer Tope
Segundo Tope
Figura 1. Manera de asir una pipeta automática y tomar una muestra (presión del émbolo).
2. El volumen requerido se fija girando el émbolo (Fig. 2). Se debe girar suavemente
(evitar estar cambiando constantemente los volúmenes, para evitar descalibrar las
pipetas). NUNCA fijar el volumen más allá de los límites de la pipeta.
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Trabajo práctico
NOTA IMPORTANTE
Cuando se pipetean solventes volátiles (como diclorometano, acetona, cloroetileno,
cloroformo, etc.) antes de tomar la muestra, se debe saturar la pipeta con el solvente. Esto
se logra introduciendo la punta en el solvente y se baja y sube el émbolo repetidamente sin
llegar al primer tope. Finalmente teniendo la punta en el solvente bajar el émbolo hasta el
primer tope y tomar toda la muestra llevando hasta la posición inicial. Si no se satura, al
sacar la punta el solvente se sale de punta, debido a que se volatiliza dentro de la misma.
Cuando se toman muestras viscosas o densas (como el glicerol), debe esperar a que suba
muy lentamente todo el volumen, al no hacerlo y retirar la punta entrará aire, formando
burbujas. Esto indica que aún no se había tomado todo el volumen y se debe repetir todo el
procedimiento.
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Fotometría
La luz visible es una forma de energía electromagnética, igual que los rayos ultravioleta,
infrarrojos etc., que es irradiada a partir de una fuente energética en líneas o rayos
virtualmente rectos. Se propaga en el vacío sin necesitar sustancia transportadora. Dentro
de su trayectoria rectilínea describe ciclos en forma de ondas regulares que vibran
perpendicularmente a su dirección de desplazamiento.
Se denomina longitud de onda (λ) a la distancia entre dos picos sucesivos de una onda.
La luz que percibe el ojo humano se denomina luz visible y comprende desde 400 a 700 nm.
Longitudes de onda superiores a 700 nm no son visibles para el ojo y se llama infrarroja;
entre 100 y 400 nm es radiación ultravioleta (UV).
Cuando un objeto se interpone en la trayectoria de un haz de radiación, la energía puede
atravesar el objeto (transmisión, T), ser reflejada por el objeto (reflexión, R) o ser captada
por el objeto (absorción, A). Las medidas de absorción de luz se basan en dos leyes, la ley
de Lambert y la ley de Beer.
∙
I = I0 ⋅ 10 -K.L ∙ 10 log ∙
Dónde:
I = intensidad de luz transmitida I0 = intensidad de luz incidente
K= coeficiente de extinción molar
L= espesor de capa
K es el coeficiente de extinción, define la cantidad de luz que una substancia absorbe a cierta
longitud de onda, por unidad de masa o por concentración molar.
Ley de Beer. Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente
(Figura 6), su intensidad disminuye exponencialmente a medida que aumenta la
concentración de la sustancia absorbente en el medio.
´∙
∙ 10 ´∙
Dónde:
C = concentración de la sustancia absorbente
Absorbente concentración C
Luz Rayo incidente Rayo emergente
monocromática
Intensidad I0 Intensidad I
Espesor de la solución L
10
∙ ∙
∙ 10 ∙ ∙
Dónde:
ε = coeficiente de extinción molar, es una medida de la energía absorbida cuando la solución
contiene un mol por litro.
El cociente de las intensidades se conoce como transmitancia (T) y se suele expresar como
un porcentaje
% ∙ 100
En algunos colorímetros este registro consta de dos escalas, una mide absorbancias (A)
y la otra transmitancias (T). La escala de A va desde 0 a ∞ , la de T va desde 0 a 100, en
sentido contrario.
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Colimador Fototubo
Registro
Monocromador Celda con
muestra
Fuente de luz
Figura 7. Esquema de las partes básicas de un espectrofotómetro
Antes de realizar una medida, el aparato debe calibrarse, para lo cual se introduce una
CELDA (o cubeta) con el blanco y se lleva a cien de transmitancia = a cero de absorbancia.
Posteriormente, se introduce una celda con la muestra y se determina, ya sea la
transmitancia o la absorbancia a la longitud de onda determinada.
Trabajo práctico.
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CENTRÍFUGA
Trabajo práctico.
La centrífuga emplea grandes fuerzas, por lo que es indispensable que el rotor se mantenga
equilibrado para evitar que este se venza hacia uno de sus lados. Para ello, el rotor cuenta
con camisas removibles, dentro de las cuales se colocan los tubos a centrifugar. Todos los
tubos que se desea centrifugar deben ser debidamente equilibrados, ajustando el peso del
tubo y la camisa a otro par tubo y camisa, adicionando agua en la camisa de uno de los
tubos, por medio de una balanza de dos platillos. Cuando la centrífuga no cuenta con
camisas removibles, se deben equilibrar pares de tubos. Cuando se desea centrifugar un
número impar de tubos, o no es posible adicionar o modificar al contenido de los tubos, se
emplean “tubos de equilibrio”, tubos a los que se coloca agua para equilibrar su peso con el
de los tubos de muestra.
Una vez equilibrados, los tubos equilibrados se colocan opuestos en el rotor, y los
distintos pares se reparten de manera lo más homogénea posible para procurar que todo el
diámetro del rotor se encuentra sujeto aproximadamente a la misma fuerza y este no se
venza hacia algún lado.
Con ayuda del profesor, reconocer las partes de las centrífugas del laboratorio, identificar
sus controles y conocer el procedimiento de operación.
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Preparar las cantidades indicadas por los profesores de los reactivos indicados a
continuación, siguiendo las instrucciones presentadas en el Anexo I del manual.
Reactivo de Bradford,
Reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS),
Amortiguador de fosfatos pH 6.0, 0.16 M,
Amortiguador de acetatos pH 4.5, 0.25 M,
Los medios de cultivo son mezclas más o menos complejas, compuestas por diversas sales,
iones, micronutrientes, nutrientes complejos, entre otros. La composición de los medios varía
considerablemente dependiendo del sistema, célula, objetivo de la fermentación, etc. Los
mediossiempre contienen c una fuente de carbono (generalmente un azúcar), que suele ser
la fuente principal de energía para los microorganismos. En sustratos complejos diversas
enzimas catalizan reacciones sobre mono, di, oligo y polisacáridos.
1. Preparar una serie de microtubos de 1.5 mL (un microtubo por cada muestra y
adicionalmente un tubo que se utilizará como blanco), a cada uno de ellos se le adiciona
0.1 mL (100 µL de reactivo de ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS)
2. Adicionar a cada tubo (CON EL dns), 0.1 mL (100 µL) de cada una de las diluciones
preparadas de acuerdo a la curva tipo que se trabaje (Tabla 2) o de las muestras a
tratar. Se puede homogenizar la rección con pequeños golpes con los dedos o pasando
por la gradilla.
3. Se puede sellar la tapa del tubo con película plástica, para evitar que se abran durante
la ebullición, en tubos con tapas de rosca no es necesario.
4. Poner todos los tubos simultáneamente a baño maría en ebullición por 5 min.
5. Posteriormente pasar a baño de hielo por 5 min o hasta que estén a temperatura
ambiente.
6. Añadir 1 mL de agua destilada a cada tubo.
7. Homogenizar los tubos volteando los tubos, y pasar a una celda.
8. Determinar la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm en el espectrofotómetro,
ajustando la absorbancia a cero con el blanco. Las lecturas con absorbancias mayores
a 1 no se consideran para la curva.
9. En el caso de que la absorbancia de una muestra sea mayor a 1 se deberá de realizar
una dilución de la muestra original y repetir todo el procedimiento antes descrito.
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Elaborar la curva patrón en donde se grafique en el eje de las ordenas (eje “y”) los valores
de absorbancia determinada a 540 nm y el en el eje de las abscisas (eje ”x”) la concentración
de maltosa en g/L.
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Las proteínas están presentes en los medios y en los cultivos como sustrato y como enzimas
sistetizadas por los microprganismos para llevar a acabo el metabolismo, pésima redacción.
Conocer la concentración de porteína en un medio o un extracto enzimático es parte
indispensable para la caracterización del medio y de las enzimas. Las proteínas son
polímeros de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Existen diversas técnicas
que ayudan a estimar la concentración de proteínas, ya sea a partir de reacciones con los
extremos amino y carboxilo, formación de complejos con el enlace peptídico o diversas
determinaciones para algunos grupos R de los aminoácidos.
Si no se conoce el coeficiente, se puede hace una curva tipo con albúmina de suero bovino
(BSA) o la proteína a trabajar, como se indica en la Tabla 3:
Conc. de BSA
(μg/mL)
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Sol. de BSA
1000 μg/mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
(mL)
Agua destilada
(mL)
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Se determina la absorbancia a 280 nm
ajustando el equipo a una absorbancia de cero con un “blanco de reactivos” (el que no
contiene proteína). Con los datos, realizar una regresión lineal y obtener la ecuación de la
recta, con la que se calculará la concentración de la proteína “problema”.
Método de Bradford
El método de Bradford involucra la unión del azul brillante de Coomassie G-250 a la proteína.
Esta unión provoca un color con un máximo de absorción de 465 a 595 nm lo que permite
la cuantificación. Dicha unión es independiente de los aminoácidos que constituyen las
proteínas. La concentración de proteína se determina por medio de una curva tipo con
albúmina sérica bovina (BSA) y el reactivo de Bradford.
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Preparar diferentes diluciones de BSA entre 0 y 100 µg/mL, a partir de una solución de 100
µg/mL (Tabla 4).
Tabla 4. Curva Tipo de albúmina de suero bovino (BSA), para determinación de proteína
por el método de Bradford
Concentración
de BSA 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
(μg/mL)
Solución de
BSA 100 μg/mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
(mL
Agua destilada
(mL)
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Absorbancia 280 nm
1. Preparar la serie de tubos de acuerdo a la tabla 5 . Determinar la absorbancia de las
muestras de la curva tipo de BSA a una longitud de onda de 280 nm, ajustando el
espectrofotómetro a cero utilizando agua como blanco
2. Con los datos, realizar una regresión lineal y obtener la ecuación de la recta, con la que
se calculará la concentración de la muestra “problema”.
3. Interpolar las absorbancias obtenidas de la muestras “problema”, las cuales las
proporcionará el profesor, en la ecuación de la curva estándar de proteína para lectura
a 280 nm.
Referencias
Martin Holtzhauer (2006). Basic Methods for the Biochemical Lab. 1era edición en Inglés.
Springer Labor Manual, págs. 6 - 8.
Bradford MM (1976) Anal Biochem 72:248.
Whitaker JR, Granum PR (1980) Anal Biochem 109:155.
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OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS PARTICULARES
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Densidad óptica
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Las lecturas de absorbancia deben encontrarse dentro del intervalo de linealidad de la curva
estándar (depende de la técnica y el equipo en que se determina la absorbancia). En caso
de ser menores a cero, se considera un valor de cero, en caso de ser mayor el límite de
linealidad, se deben diluir utilizando un diluyente adecuado. La DO se puede graficar en
función de la concentración de proteína extracelular, peso seco, número de células, proteína
celular, etc. Haciendo posible correlacionarlas para la estimación de manera rápida de todas
estas variables.
Peso seco
Una medida más precisa para estimar la concentración de biomasa es el peso seco; el cual
consiste en toma un volumen de cultivo homogéneo, que posteriormente se centrifuga y se
remueve el medio (medio de cultivo) y la pastilla celular se resuspende en un poco de agua
y se pasa a una charola de alumnio a peso constante, se introduce en una estufa a una
temperatura de 60 a 70 ºC, para ser secada y posteriormente pesada, la diferencia de pesos
proporciona la biomasa seca, determinar la biomasa en g/L considerando el peso de la
biomasa y el volumen de la muestra empleada.
1. El día anterior a la determinación, etiquetar charolas de aluminio (dos por cada muestra)
e incubarlas a 60°C por 24 horas en una estufa hasta alcanzar el peso constante.
2. En el momento de realizar la determinación, atemperar las charolas en un desecador y
pesarlas.
3. Tomar 10 mL de cada de una de las diluciones del medio de cultivo, y colocarlos en
tubos para centrífuga de 15 mL.
4. Equilibrar el peso de los tubos de dos en dos.
5. Centrifugar las muestras a 6000 rpm por 5 minutos.
6. Desechar el sobrenadante de centrifugación, y resuspender la pastilla en 1 mL de
solución salina con ayuda de un vortex.
7. Colocar las pastillas resuspendidas en cada una de las charolas previamente pesadas.
8. Incubar las charolas en una estufa a 60°C por 24 h.
9. Atemperar las charolas en desecador y pesar cada una
Otro método, preferentemente para células grandes como las levaduras o células
sanguíneas, es contar directamente al microscopio. Esto presenta la ventaja de evitar
interferencias (agentes ajenos a la biomasa que generan turbiedad o variaciones de peso)
presentes en otras técnicas. Otra ventaja de esta técnica, es que permite acoplar colorantes,
los cuales ayudan a diferenciar entre células vivas y muertas.
La cámara de Neubauer es una cámara adaptada para ser utilizada en un microscopio de
campo claro o de contraste de fases. En una cámara simple, la porción central, que es donde
se realiza el conteo, está dividida en 3 partes. En la parte central se encuentra grabada una
retícula cuadrangular. En el caso de las cámaras dobles, que son las más comunes, existen
2 zonas de conteo, una superior y otra inferior al eje longitudinal de la cámara. (Figura 8).
La retícula completa mide 3 mm x 3 mm de lado. Subdividida a su vez en 9 cuadrados de 1
mm de lado cada uno. (Fig. 8. [1]).
En caso de recuento de sangre, los cuadrados de las esquinas son los destinados al
recuento de leucocitos. Al existir estos en menor número que los hematíes, se necesitan
menos líneas de referencia para realizar el conteo. El cuadrado central es el destinado al
recuento de hematíes, plaquetas, levaduras. Se divide en 25 cuadrados medianos de 0.1
mm de lado (Fig.8. [2]), y cada uno de estos cuadros se subdivide a su vez en 16 cuadrados
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pequeños. (Fig 8. [3]). El cuadrado central está por tanto formado por 400 cuadrados
pequeños.
Dónde:
N: La media de las células contadas (suma de células contadas por
subdivisión/Número de subdivisiones contadas)
25: números de subdivisiones
104: factor para pasar el número de células en el volumen del cuadrado central a mL,
donde (volumen = 1 mm * 1 mm * 0.1 mm = 0.1 mm3) y 1000 mm3 = 1000 μL=1 mL,
por lo tanto 0.1 mm3 * 104 = 1000 mm3 = 1 mL
Fd: factor de dilución realizado a la muestra original
más subdivisiones. Evitar contar dos veces la misma célula u omitir alguna. Cuando una
célula se encuentra en alguno de los bordes, se elige si la célula cuenta o no según se
encuentre sobre el borde superior o inferior y derecho o izquierdo.
7. En caso de que el número de células sea muy elevado y se dificulte su conteo, será
necesario diluir la suspensión en una proporción conocida, la que deberá ser tenida en
cuenta en la estimación final (Factor de dilución, F).
8. Calcular el número de células de acuerdo a la fórmula 1.
ANÁLISIS DE RESULTADOS.
1. Presentar en una tabla los valores obtenidos por las tres determinaciones (con sus
unidades correspondientes) para cada dilución.
2. Elaborar tres gráfivas con ecuación y correlación de :
a. absorbancia (x) vs peso seco (y).
b. absorbancia (x) vs número de células (y).
c. peso seco (x) vs número de células (y).
REFERENCIAS.
Oscar Bastidas. Technical Note - Neubauer Chamber Cell Counting. Celeromics, inc.
Fugelsang, K.C. and Edwards, C.G. (2007). Wine Microbiology. Practical applications and
procedures., Edn. 2nd. (Springer, USA).
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INTRODUCCIÓN
Dentro de toda célula se realizan miles de reacciones que son necesarias para el
crecimiento, mantenimiento y desarrollo de la célula (metabolismo celular); las moléculas
que llevan a cabo estas reacciones son las enzimas.
Las enzimas son proteínas con capacidad catalítica, es decir, reducen la energía de
activación de la reacción para acelerar la reacción. Las enzimas transforman el sustrato y se
obtiene un producto, pero a diferencia del producto que sufre una transformación, la enzima
no sufre ningún cambio después de realizada la reacción; para que se lleve a cabo la
reacción es necesario que la enzima y el sustrato estén en contacto, para esto la enzima
tiene un sitio catalítico donde entra el sustrato (existen dos modelos: el de “llave – cerradura”
y el de ajuste inducido) formándose el complejo Enzima – Sustrato y se llevan a cabo una
serie de pasos (estado transitorio) para finalmente obtener el producto de la reacción.
→ →
Para poder estudiar, o emplear una enzima, es necesario conocer su concentración, y si
bien es posible conocer de manera relativamente sencilla la cantidad de proteína en un
sistema, poder determinar cuánto de esas proteínas corresponde a la enzima de interés, o
cuánta de esa enzima se encuentra en forma total o parcialmente funcional es sumamente
complicado y costoso. Por ello, para facilitar el uso de las enzimas, en lugar de medir
directamente la cantidad de enzima en el sistema, se mide la capacidad catalítica de una
preparación enzimática.
Además de la definición de Unidades Internacionales, existen otras unidades para ésta, por
ejemplo, las del Sistema Internacional de Unidades. El SI emplea como unidad de actividad
enzimática el katal (kat), que se define como la cantidad de enzima necesaria para
transformar un mol de sustrato por segundo. La existencia de estas unidades se debe a que
la velocidad de catálisis de cada enzima puede variar mucho con respecto a la de otras
enzimas, siendo complicado el uso de una misma unidad para todas las enzimas; por
ejemplo, el katal es una unidad demasiado grande para la actividad enzimática de casi todas
las enzimas, siendo más común el uso de submúltiplos, como el microkatal o nanokatal.
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OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Materiales y Reactivos:
Reactivos:
Materiales:
Juego de Micropipetas.
Puntas de 200 y 1000 µL para micropipetas.
Agitador magnético.
Microtubos de 1.5 mL.
Baño maría.
Espectrofotómetro.
Celdas para espectrofotómetro.
23
8. Una vez terminada la cinética enzimática tratar los microtubos de las muestras junto con
el blanco y el testigo con la técnica de determinación de azúcares reductores
Una Unidad corresponde a la cantidad de enzima que libera 1 µmol de maltosa por minuto
a pH 6.0 y 25°C.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
La actividad enzimática se puede definir como la razón de cambio del producto o del sustrato
con respecto al tiempo por acción de la enzima.
Para poder calcular esta razón de cambio se procede a realizar una gráfica de dispersión de
las concentraciones de maltosa con respecto al tiempo (se grafica en el eje “x” el tiempo y
en el eje “y” las concentraciones de maltosa). Con estos datos se procede a realizar una
regresión lineal para obtener el valor de la pendiente de la ecuación obtenida; esta es la
razón de cambio, es decir, la actividad enzimática que se busca.
Determinar:
AE: en g/ L min , mol/L min
AE esp: en g/ L * min * mg de Port , mol/L* min *mg de Port
UI: cantidad de enzima necesaria para transformar 1 micromol de sustrato en un minuto
Katal: cantidad de enzima necesaria para transformar un mol de sustrato por segundo.
Número de recambio Kcat (s-1): número de moléculas de sustrato convertidas en producto por
segundo por una molécula de enzima.
24
REFERENCIAS
25
OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto de los parámetros fisicoquímicos sobre la actividad enzimática
de la invertasa.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Evaluar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
Evaluar el efecto del pH en la actividad enzimática.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Materiales y Reactivos.
Reactivos:
Regulador de Acetatos 0.1 M, pH 3.0, 4.0 y 5.0
Regulador de Fosfatos 0.1 M, pH 6.0 y7.0
Regulador de Boratos 0.1 M pH 8.0, 9.0 y 10
Reactivo de DNS.
Reactivo de Bradford.
Agua destilada.
Materiales:
Juego de Micropipetas.
Puntas de 200 y 1000 µL para micropipetas.
Vaso de precipitados de 20 mL.
Agitador magnético.
Microtubos de 1.5 mL.
Baño maría a diferentes temperaturas.
Espectrofotómetro.
Celdas para espectrofotómetro.
Potenciómetro.
26
11. Adicionar, con ayuda de una micropipeta, 0.05 mL (50 µL) a los 0.95 mL de sustrato a
un pH determinado en intervalos de 30 s.
12. Una vez transcurridos el tiempo exacto de reacción (3 min) de cada tubo, tomar 0.1mL
de la solución de reacción y transferir a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS por
duplicado.
13. Repetir la reacción (punto 12 y 13) para cada pH.
5. Una vez terminada la cinética enzimática tratar los microtubos de las muestras junto con
el blanco y el testigo con la técnica de determinación de azúcares reductores.
6. Utilizando la ecuación de la curva patrón de azúcares reductores, interpolar las
absorbancias para calcular las concentraciones de maltosa y llenar la tabla siguiente:
7. . Hacer la gráfica de Actividad enzimática y U vs pH de la reacción.
8. Discutir los resultados de las actividades enzimáticos obtenidos por todos los equipos
del grupo.
Efecto de la temperatura en la actividad enzimática.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Medición de Actividad Catalítica.
Para poder calcular la actividad enzimática de todos los ensayos realizados se procede
a realizar una gráfica de dispersión de las concentraciones de glucosa con respecto al tiempo
(se grafica en el eje “x” el tiempo y en el eje “y” las concentraciones de maltosa). Con estos
datos se procede a realizar una regresión lineal para obtener el valor de la pendiente de la
ecuación obtenida; esta es la razón de cambio, es decir, la actividad enzimática que se
busca.
Determinar
AE: en g/ L min , mol/L min
AE esp: en g/ L * min * mg de Port , mol/L* min *mg de Port
UI: cantidad de enzima necesaria para transformar 1 micromol de sustrato en un minuto
Katal: cantidad de enzima necesaria para transformar un mol de sustrato por segundo.
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Número de recambio Kcat (s-1): número de moléculas de sustrato convertidas en producto por
segundo por una molécula de enzima.
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INTRODUCCIÓN
Uno de los factores más importantes que afecta la velocidad de una reacción enzimática es
la concentración de sustrato. A concentraciones elevadas de sustrato, la velocidad de
reacción es independiente de la concentración del sustrato; para concentraciones bajas, la
tasa de reacción es de primer orden, se ve afectada por la concentración total de enzima.
Uno de los modelos más conocidos y al que se ajusta una gran cantidad de enzimas
utilizadas comercialmente es el propuesto por Michaelis y Menten.
Sin embargo, estudiar este efecto en el laboratorio se torna difícil dado que la concentración
de sustrato varía durante el curso de la reacción. Un método que simplifica la realización de
experimentos de cinética es medir la velocidad inicial o V0 donde la concentración de sustrato
es mucho mayor que la concentración de la enzima. Bajo estas condiciones, cambios en la
concentración del sustrato son ínfimos y por lo tanto se considera que la concentración de
sustrato se mantiene constante. Cuando la concentración de enzima se mantiene constante
y la concentración de sustrato varía se obtiene la Vmax y Km (Fig. 1)
Figura 9. Gráfica de la ecuación de Michaelis‐Menten
29
La velocidad V indica la cantidad de moléculas de sustrato que son catalizadas por una
preparación de enzima en determinada cantidad de tiempo. Partiendo de los datos de
concentración inicial del sustrato junto con la velocidad inicial de la reacción, puede
analizarse los datos siguiendo el modelo de Michaelis-Menten, de Lineweaver-Burk, Eadie-
Hofstee, Augustinsson; entre otros. Los últimos tres aplican transformación de los datos para
su linearización, haciendo más preciso el cálculo de los parámetros cinéticos por medio de
análisis gráfico y matemático.
Utilizando la forma original de la ecuación de Michaelis-Menten no es posible obtener un
valor preciso de la velocidad máxima, ya que los datos presentan un comportamiento
asintótico respecto a ésta.
30
El cálculo de las constantes se hará en forma comparativa usando tres métodos gráficos
que están basados en las formas lineales de la ecuación Michaelis-Menten, que fueron
antes mencionados
OBJETIVOS
General
Determinar por diferentes modelos las constantes cinéticas de una enzima libre.
Específicos
Calcular las constantes cinéticas, Km y Vmax, de una enzima (invertasa).
Determinar el efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de las
reacciones enzimáticas.
Determinar las velocidades iniciales de una reacción enzimática.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Reactivos:
8. Una vez terminada la cinética enzimática tratar los microtubos de las muestras junto
con el blanco con la técnica para la determinación de azúcares reductores.
9. Repetir los pasos 2 al 7 por cada concentración de sacarosa.
10. Determinar mediante el método de Bradford (por duplicado), la concentración de
proteína en cada una de las soluciones enzimáticas proporcionadas por el profesor.
11. Utilizando la ecuación de la curva patrón de maltosa, interpolar las absorbancias
para calcular las concentraciones de maltosa y llenar la tabla siguiente:
Tabla 5. Resultados de la cinética enzimática para determinar las constantes cinéticas de
la invertasa.
Por cada concentración de sustrato
Sacarosa (g/L)
Tiempo Abs. Conc. de Concentración Actividad enzimática
(min) (λ=540 nm) glucosa de sacarosa (mM de sustrato
(g/L) (g/L) transformado /min)*
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*Considerando el control
ANÁLISIS DE RESULTADOS.
Para cada una de las concentraciones de sustrato, hacer una gráfica de Absorbancia con
respecto al tiempo y calcular las velocidades iníciales, con el trazo de la tangente a tiempo
cero del curso de la reacción.
Hacer la gráfica de velocidades iníciales (vo) vs concentración de sustrato.
Hacer las gráficas de 1/vo vs 1/[So], [So]/vo vs [So] y vo vs vo/ [S] o y calcule Km y Vmax, con
cada uno de los modelos. Presentar los valores de éstas en una tabla.
Determinar la constante catalítica de la enzima para esta reacción, suponer que la
preparación enzimática es 100% enzima, e investigar el peso molecular de ésta.
Discutir los resultados obtenidos por todos los equipos del grupo.
CUESTIONARIO:
¿Cuál son las principales causas por las cuales se determina la velocidad inicial en una
cinética enzimática?
¿Cuál es la funcionalidad de cada constante enzimática calculada para la caracterización
de una enzima?
Cite un ejemplo donde se analicen una o varias de estas constantes, donde se especifique
el objetivo del cálculo de éstas.
¿Por qué el uso de sustratos cromogénicos en algunos ensayos enzimáticos?
¿Cómo afecta la concentración del sustrato en la actividad enzimática y cuáles pueden ser
sus posibles causas?
¿Cuál es la finalidad de usar un testigo en la medición de la actividad?
REFERENCIAS:
Dubois, T., Jacquet, A., Scheneck, A. G. and Looze, Y. (1988). The thiol proteinases from
the latex of Carica papaya L. I. Fractionation Purification and Preliminary
Characterization. Biological Chem Hoppe-Seyler. 369: 733-740.
Jeremy Mark Berg, Lubert Stryer, Jeremy Berg, John Tymoczko. (2008). Bioquimica.
Editorial Reverté. 217-225.
Segel H. Irwin. (1976). Biochemical Calculations “How to solve mathematical problems in
general biochemistry”. John Wiley & Sons, Second Edition.
32
INTRODUCCIÓN.
Técnicas de inmovilización.
Atrapamiento
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida
porosa constituida generalmente por prepolímeros entrucruzables o polímeros del tipo
poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de
inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del
monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o
mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras,
que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada
en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida
dentro de las microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento requiere un control
riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la
naturaleza del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína.
Unión a soportes
Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de una mayor
información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el
comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización
incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de pH
óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte debe tener
resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente
separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran
variedad de materiales como soportes para la inmovilización de numerosas enzimas. Estos
materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los
encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y más corrientemente en forma de esferas.
Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:
1. Soportes inorgánicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que
pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.) o materiales
manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso,
alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.)
Adsorción
En la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones
iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno.
Unión covalente
La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de inmovilización más
interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se basa
en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las
proteínas. De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las
enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son principalmente
la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la
arginina y los ácidos aspártico y glutámico.
Reticulado
También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha sido
ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas. El método del reticulado
consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las
moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehídos,
diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas
con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares
irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.
34
Las aplicaciones más importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en:
OBJETIVOS
General
Evaluar la capacidad catalítica de una enzima inmovilizada, respecto a su forma libre.
Específicos
Inmovilizar una enzima (invertasa) por atrapamiento en alginato.
Determinar la actividad enzimática de la enzima inmovilizada realizando cinéticas
enzimáticas de la invertasa inmovilizada.
Determinar el porcentaje de inmovilización cuantificando la concentración de
proteína en el cloruro de calcio residual.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Material y equipo.
Materiales: Equipos:
35
36
37
ANÁLISIS DE RESULTADOS
38
4.1 INTRODUCCIÓN
Efectos en la estabilidad
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después de su
inmovilización, que se debe principalmente a las siguientes razones:
39
2) Efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que, si tienen la misma
carga existe una repulsión mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atracción.
Cuando el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de km’ aparente puede verse
reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en disolución.
4.2 OBJETIVOS
General
Evaluar la estabilidad de una enzima libre e inmovilizada a diferentes tiempos.
Específicos
Determinar la actividad enzimática de una enzima libre e inmovilizada a diferentes
tiempos tras ssu preparación.
Determinar las constantes cinéticas de una enzima libre e inmovilizada a diferentes
tiempos.
Evaluar el efecto de la inmovilización sobre la estabilidad de la actividad
enzimática.
40
41
Parámetros cinéticos
Día 0 Día Día Día
Enzima
Km Vmax Km Vmax Km Vmax Km Vmax
Libre
Inmovilizada
Km en µMsac
Vmax en µMsac/min
42
5.1 INTRODUCCIÓN.
Medios de Cultivo
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y
en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos
medios son esenciales en las fermentaciones por lo que un control en su fabricación,
preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de
los resultados obtenidos.
Métodos de Esterilización
La selección del método de esterilización y el régimen a usarse deben ser hechos de acuerdo
a criterios apropiados de esterilización; los métodos pueden ser: Calor húmedo
Calor seco
Filtración
Compuestos químicos
Radiación
43
5.2 OBJETIVOS
Objetivo general
Adquirir conocimientos prácticos para establecer un birreactor con medio de cultivo para un
bioproceso.
Objetivos específicos
Conocer las partes y funciones de un Biorreactor de laboratorio.
Formular un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos.
Conocer el funcionamiento de una autoclave.
Esterilizar el biorreactor y medio por calor húmedo.
Determinar cualitativamente la eficacia del proceso de esterilización por calor
húmedo.
Conocer la manera de preparar el inóculo para una fermentación.
Conocer la manera de inocular un biorreactor de laboratorio.
5.3.1 MATERIALES
- Cajas de Petri
- Tubos de ensayo
- Vasos de precipitado de diferentes volúmenes
- Barras magnéticas para agitación (mosca)
- Guantes de asbesto
- Solución de Cloruro de Sodio al 0.85%
- Pipetas de 1 y 10 mL
- Pipetas automáticas de 1 y 10 mL
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Medio de cultivo para levaduras
- Matraces de 250 mL
- Medio de cultivo para levaduras
5.3.2 EQUIPO
- Biorreactor de Laboratorio
- Balanza analítica
- Incubadora con control de temperatura
- Autoclave eléctrica de 50 L de volumen
- Campana de flujo laminar vertical
- Microscopio óptico
- Agitador Vortex
- Placa de agitación magnética
44
El profesor, en conjunto con los alumnos, reconocerá las partes del biorreactor y describirá
las funciones de cada una. Se explicará la correcta manera de ensamblar el biorreactor,
así como el manejo de éste y el módulo de control.
45
6.1 INTRODUCCIÓN
6.2 OBJETIVOS
Objetivo general
Adquirir los conocimientos prácticos para producir una enzima extracelular por medio de
una fermentación con células libres.
Objetivos específicos
Producir invertasa con células libres de levaduras en cultivo sumergido.
Monitorear y obtener la cinética de crecimiento de biomasa.
Monitorear y obtener la cinética de producción de enzima.
Determinar la actividad catalítica de la invertasa.
Establecer las constantes cinéticas (Km, Vmax) de la invertasa
6.3.1. Materiales
- Vasos de precipitado de diferentes volúmenes
- Barras magnéticas para agitación (mosca)
- Guantes de asbesto
- Agar nutritivo
- Medio de cultivo para levaduras
- Solución del reactivo DNS
- Solución de glucosa, 2 g/L
- Solución del reactivo de Bradford
- Solución de anthrona
- Solución de sacarosa, 30 g/L
- Solución buffer fosfatos 0.1 M a pH 6.9
- Solución estéril de cloruro de sodio, 0.09%
- Colorantes y soluciones para tinción de Gram
- Pipetas de 1 y 10 mL
- Portaobjetos
- Charolas de aluminio de 5 cm de diámetro
- Tiras de pH
6.3.2. Equipos
- Biorreactor de laboratorio New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra de 5 L con su
módulo de control, partes y electrodos.
- Centrífuga para tubos falcón de 30 mL
- Balanza analítica
- Espectrofotómetro visible
- Incubadora orbital con control de agitación y temperatura
- Autoclave eléctrica de 50 L de volumen
- Campana de flujo laminar
- Microscopio óptico
- Agitador Vortex
- Baño de agua con control de temperatura
47
La muestra del tiempo cero (T0) se toma justo después de inocular el biorreactor. Si en los
tiempos T7, T8 y T9, no hay cambios significativos en la evolución del crecimiento celular y
en la producción de invertasa, se procede a detener la fermentación.
* NOTA: El programa de muestreo anterior es una propuesta susceptible a modificación.
48
Las metodologías para estas técnicas, se encuentran en los apartados actividades previas,
práctica 1 y anexos. Sólo se presenta un esquema del tratamiento de las muestras.
Muestra (en Tinción de Gram
esterilidad) Siembra en placa
Centrifugar
10 mL
Sobrenadante Pastilla celular
DO 600 nm Peso Seco
(blanco)
Sustrato residual
Proteína extracelular
Actividad enzimática
49
6.5 CUESTIONARIO
6.5 REFERENCIAS
Bailey, J.E. and OllIs, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd Edition, McGraw-Hill
International Editions, 1986, New York, 984 p.
Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, San Diego, 439p.
López, Agustín; QUINTERO, Rodolfo. Tecnología Enzimática. UNAM. México, 1987.
Scragg, Alan. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas biológicos en procesos tecnológicos.
Editorial Limusa. México, 1999.
Segel H. Irwin, Biochemical Calculations (How to solve mathematical problems in general
biochemestry). Editorial John Wiley & Sons, Segunda edición, Estados Unidos de América
1976
Stanbury, P.F. and Whitaker, A. Principles of fermentation technology. Pergamon Press,
1984. Oxford, 255p.
Vogel, H.C. and Todaro, C.L. Fermentation and biochemical engineering handbook. 2nd
edition, Noyes Publications, 1997. New Jersey, 801p.
50
HOJA DE CONTROL DE CINÉTICA DE PRODUCCIÓN DE ENZIMA POR CÉLULAS LIBRES
CONDICIONES
Aireación (vvm)
Agitación (rpm)
Fecha y hora de inicio:
Fecha y hora de término:
Charola
Bradford
Tiempo Pureza de Charola con DO No de DNS (DO) se
Muestra T ( °C) pH (DO) de Observaciones
(h) Cultivo (+,-) (g) Muestra PS (600 nm) Cel/mL sobrenadante
sobrenadante
(g)
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
51
7.1 INTRODUCCIÓN
Inmovilización de células: La inmovilización celular se define como la localización de
células en una región definida en el espacio con la preservación de las funciones
celulares. Esta región de inmovilización debe ser una fase sólida que permita el
intercambio de sustratos y productos con el medio exterior, no debe ser tóxica para las
células y debo ser fácilmente manipulable.
- Adsorción.
Las células pueden anclarse naturalmente a una superficie, las células se anclan al
soporte por atracciones electrostáticas (fuerzas de Van der Walls, iónicas y de puentes de
hidrógeno). El crecimiento produce una biopelícula en la superficie del soporte y las
limitaciones de transferencia de masa tienen lugar dentro de esta biopelícula.
52
- Enlace covalente.
En este tipo de inmovilización el fuerte enlace de la célula-soporte reduce la pérdida
celular. La unión directa de las células a un soporte activado es posible por la
modificación química de la matriz por medio de la utilización de sustancias que sirvan de
puente de unión química. El glutaraldehído es usado para tal fin, sin embargo, el riesgo del
daño celular, debido a los enlaces covalentes alrededor de la membrana celular, puede ser
una limitante.
- Micro-encapsulación.
La micro-encapsulación se usa en el área farmacéutica o en el campo de ¡ü medicina
para producción de fármacos e inmovilización de enzimas. Una microcápsula consiste
en una semi-membrana permeable, esférica, delgada y fuerte que rodea un centro
liquido, con un diámetro que varia de unas mieras a 1mm. La membrana sin/e como una
barrera semipermeable permitiendo la entrada cíe sustrato y la salida de metabolitos,
pero no permite el paso de células.
- Atrapamiento o inclusión.
De entre los métodos de inmovilización de células, el método de inclusión celular ha
mostrado ser el que permite un mejor control de la inmovilización y es el que preserva mejor
las funciones celulares. Este método consiste en atrapar las células en una red
tridimensional rígida de hidrogel; los soportes de inmovilización pueden ser sintéticos
(por ejemplo la poliacrilamida, el poliuretano) o naturales, (por ejemplo el agar, la
gelatina, el alginato y la carragenina). Una de las características particulares del
método de inclusión o atrapamiento celular está relacionada con las condiciones
de gelificación del soporte y la reversibilidad del proceso de gelificación. La gelificación
se realiza por cambios en la temperatura o por la presencia de iones. Además, la
gelificación es reversible, así, bajo ciertas condiciones físicas se cuenta con una
suspensión celular que puede ser gelificada, quedando las células atrapadas;
posteriormente se puede volver a liberar las células aumentando la temperatura o
retirando los iones. Uno de ios materiales más empleados para realizar la inmovilización
por inclusión celular es la K-carragenina.
Kapa-carragenina.
La K-carragenina es un polisacárido no tóxico, de fácil adquisición, aislado a partir de algas
marinas. Es ampliamente usado en las industrias cosmética y alimentaria como agente
gelificante, espesante y estabilizante. Es un polímero, el cual esta constituido por una
estructura unitaria de sulfato de β-D galactosa y 3,6-anhidro-α-D-galactosa.
La K-carragenina gelifica al enfriarse o al contacto con una solución de algún agente
inductor del gel, tales corno iones potasio o calcio.
Una ventaja al emplear K-carragenina es, que la inmovilización puede efectuarse bajo
condiciones muy suaves, sin el uso de químicos que puedan inhibir la actividad
enzimática de las células.
Alimentación
Células
inmovilizadas
Aspersor de aire
Productos
A B
Productos Productos
Células
inmovilizadas
Alimentación
Alimentación
54
7.2 OBJETIVOS:
General:
El alumno producirá invertasa mediante Saccharomyces cerevisiae en estado libre e
inmovilizado en esferas de alginato de sodio, durante una fermentación en un biorreactor a nivel
laboratorio.
Específicos:
El alumno inmovilizará células de S. cerevisiae en alginato de sodio.
El alumno preparará el medio de cultivo para el crecimiento de la levadura y la producción
de la enzima.
El alumno llevará a cabo la cinética de crecimiento de la levadura en estado libre e
inmovilizado.
El alumno monitoreará la producción de proteína en las células (en estado libre e
inmovilizado) durante el tiempo de proceso.
El alumno determinará la actividad enzimática y la actividad enzimática especifica de la
invertasa producida por las células en estado libre e inmovilizado.
Probetas. Buffer pH 4
Termómetro Buffer pH 7
Autoclave Aceite de inmersión
Baño María Solución de antrona
Potenciómetro. Alcohol al 70 %
Microscopio óptico Solución de sacarosa
Centrífuga Pinzas
Balanza analítica Charolas de aluminio
Espectrofotómetro UV-VIS Baño de hielo
Campana de flujo laminar Sacarosa
Tubos Falcón Extracto de levadura
Tubos Eppendorf estériles (150 aprox.) Vasos de precipitado de diferentes
Portaobjetos volúmenes
Asa bacteriológica Barras magnéticas para agitación (mosca)
Lámpara de alcohol Jeringa de 10 ml con punta roma
Mechero de Bunsen Manguera de silicón de 2 mm de diámetro
Micropipetas para bomba peristáltica
Encendedor Agar nutritivo.
Portaobjetos Parrilla de agitación y calentamiento
Puntas para micropipetas Soporte Universal
Tiras de medición de pH Solución estéril de cloruro de calcio al 1%.
Charolas de aluminio secas Solución de alginato al 2%
Soluciones para realizar tinción de Gram Pipetas de 1 y 10 mL
Cristal Violeta 1 colador de cocina metálico
Lugol
Alcohol-cetona
Safranina
Reactivo DNS
Reactivo de Bradford
Solución de sacarosa al 30%
Agua destilada
55
7.3.2. Inmovilización de células de Saccharomyces cerevisiae.
56
7.3.5. Tratamiento de las muestras.
*Cuenta en placa se realizará al inicio, tiempo cero, un tiempo intermedio y tiempo final, por
triplicado y tres diluciones, en medio para levaduras con 15 g/L de agar, inoculando con 0.1
mL de la dilución correspondiente (100 a 10-9 y extendiendo con varilla en “L”. (Se requieren
de 54 cajas por equipo, puntas estériles de 1000 y 100 µL, para las diluciones: 30 tubos
eppendorf estériles, solución isotónica estéril)
En sobrenadante centrifugado a 5000 rpm 15 min determinar:
Proteína por Bradford (Volumen de muestra 0.75 mL)
Azúcares reductores (Volumen de muestra 0.3 mL)
Azúcares totales (Volumen de muestra 0.6 mL)
pH ((Volumen de muestra 1 mL)
Actividad enzimática: (Volumen de muestra 250 µL)
Notas:
IMPORTANTE, la única muestra que debe permanecer sin contaminar (tomada y
manipulada en condiciones de esterilidad) es la usada para cuenta en placa.
Tiempos recomendados: en función de los horarios de la clase, establecer el programa de
muestreo, la principal actividad se lleva a cabo en las primeras 12-18 horas, por lo que
dejar al inicio toda la noche el sistema puede hacer que se pierdan los puntos más
interesantes. Se recomienda dejar todo listo, enfriar e iniciar en la mañana.
Las muestras pueden ser tomadas y guardadas en refrigeración para el posterior análisis.
Se recomienda hacer de forma inmediata la cuanta en placa y Tinción de Gram (esta última
para asegurar que no hay contaminación).
7.6 REFERENCIAS
Aehle, W. (2007). Enzymes in Industry - Production and Applications (Tercera edición ed.). Leiden:
Wiley-VCH.
Adrio, J. L., & Demian, A. L. (2005). Microbial Cells and Enzymes: A Century of Progress. En J.
Barredo (Ed.), Microbial Enzymes and Biotransformations (Vol. 17, págs. 1-18). Totowa, New Jersey,
United States of America: Humana Press.
Aranda Barradas J. S.; Salgado Manjarréz E. 2002. Saccharomyces cerevisiae biomass production
and its uses in the food industry. Tecnología de Alimentos, (37): 7-15
Knauf, M., & Kraus, K. (2007). Specific yeasts developed for modern ethanol production. Sugar
Industry , 131 (11), 753-757.
Líden, G. (2002). Undestanding the bioreactor. Bioprocess and Biosystems Engineering , 24 (5), 273-
279.
57
M.E. Gregory, M. B.-H. (1996). Optimising enzyme production by bakers yeast in continuous
culture. Bioprocess Engineering (15), 239-245.
Leland, H. (1974). Saccharomyces cerevisiae cell cycle. Bacteriological reviews , Vol. 38 (2), 164-198.
Manchester, K. L. (1995). Louis Pasteur (1822–1895) — chance and the prepared mind. Trends in
Biotechnology , 13 (12), 511-515.
Stroh, W. (1998). Industrial enzymes market: growth experienced from new products and movement
into global market. Genetic Engineering News , 18, 11-38.
Prescott L., Harley J. y Klein D. (2004). Microbiología (Quinta edición ed.). Madrid, España: Mc Graw
Hill. 1240 págs.
White, M. D.; Glick, B. R.; Robinson, C. W. Bacterial, yeast, and fungal cultures. Effects of
microorganism type and culture characteristics on bioreactor design and operation. In Bioreactor
System Design; 1995; pp 47-87. Observaciones
HOJA DE CONTROL DE CINÉTICA DE PRODUCCIÓN DE ENZIMA POR CÉLULAS LIBRES
sobrenadante
Bradford
(DO) de
Cel/mL sobrenadante
No de DNS (DO) se
Muestra PS (600 nm)
DO
Charola
con
(g)
Pureza de Charola
Cultivo (+,-) (g)
pH
Fecha y hora de término:
T ( °C)
Fecha y hora de inicio:
Tiempo
Aireación (vvm)
Agitación (rpm)
CONDICIONES
(h)
Muestra
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
58
Bradford, Reactivo de
Reactivos de Gram
a) Cristal Violeta
Disolver 0.5 g de cristal violeta en 100 mL de agua destilada.
b) Lugol
En un mortero, mezclar 0.3 g de yodo metálico y 0.6 g de yoduro de Potasio.
Disolver el contenido del mortero en 50 mL de agua. Con pequeñas
cantidades de agua, lavar el contenido del mortero, adicionándolo a la
solución y cuidando no rebasar los 100 mL de volumen total, al que se afora.
c) Alcohol-Acetona
Mezclar 33.3 mL de acetona con 66.7 mL de Etanol absoluto.
59
d) Safranina
Disolver 1 g de Safranina en 100 mL de agua destilada.
Reguladores
Solución de sacarosa 3%
60
Determinación de Azúcares Reductores mediante DNS
1. Colocar 0.1 mL de DNS en un tubo eppendorf de 1.5 mL .
2. Tomar 0.1 mL de muestra a analizar.
3. Adicionar la muestra al tubo con los 0.1 mL de DNS.
4. Preparar un blanco con 0.1 mL + 0.1 mL de blanco (agua o regulador).
5. Incubar en baño maría en ebullición por 5 min todos los tubos de manera
simultánea.
6. Pasar los tubos a baño frio por 5 min o que hasta que ya estén fríos.
7. Adicionar 1 mL de agua destilada a cada tubo y homogeinizar.
8. Leer a 540 nm, emplear el blanco para ajustar a cero de abs..
Determinación de Bradford
Determinación de Biomasa por Peso Seco
Determinación de Biomasa por Densidad Óptica
61
62