INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ACAPULCO

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

INGENIERÍA BIOQUÍMICA
MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

EQUIPO: 4 GRUPO: “B”

DISEÑO EXPERIMENTAL 4°: Determinación de coliformes totales y

fecales, técnica del NMP.

ALUMNO: BENITEZ ROJAS LAURA ISABEL

No. DE CONTROL: 15320526

PROFESOR: M.C. MIGUEL ÁNGEL DÍAZ ALDAY

FECHA DE ENTREGA: 09 DE SEMPTIEMBRE DE 2018

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CONTENIDO
INVESTIGACIÓN ............................................................................................... 3
Escherichia coli enterotoxigénica ETEC ......................................................... 3
Escherichia coli enteropatógena ECEP .......................................................... 3
Escherichia coli enteroinvasiva EIEC ............................................................. 4
Escherichia coli enterohemorrágica EHE........................................................ 4
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 5
HIPOTESIS ........................................................................................................ 5
PROCEDIIENTO ................................................................................................ 5
1.1 Prueba presuntiva .................................................................................... 5
1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales .................... 6
1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales. .................. 6
Control de calidad para coliformes fecales ............................................................... 7
1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli ................................................ 7
1.4.1 Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC). ...... 7
CÁLCULOS ........................................................................................................ 9
GRAFICAS Y DIAGRAMAS ............................................................................. 11
BIBLIOGRAFÍA Y LINKOGRAFÍA ................................................................... 11

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INVESTIGACIÓN
El grupo de coliforme se divide en coliforme totales y coliforme termotolerantes.
Los coliformes totales está compuesto por bacilos Gram- negativos aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción
de gas en un lapso máximo de 48h a 35°C ± 2°C. El grupo está conformado por
4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.
Dentro de estos géneros podemos encontrar muchas especies pero la más
prominente es la Escherichia coli. (NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-
SSA1-1995)

La Escherichia coli es un bacilo, que vive en el intestino de los seres humanos,

existen ciertas cepas de E. Coli patógenas. En las cuales encontramos: E. coli
enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli
enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli
enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras
cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores,
las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de
agua y alimentos contaminados. (Food and Drug Administration. ,2003)

Escherichia coli enterotoxigénica ETEC

El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. La infección puede
ser adquirida por el consumo de alimentos tales como vegetales frescos (lechuga
en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en
aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis
infectiva puede ser más baja. (Murray P, Baron E.J, Pfaller M, Tenover F, Yolken
R.,1999)

Escherichia coli enteropatógena ECEP

El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que es codificada por el
gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plásmido, ambas

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proteínas permiten su unión a los enterocitos y la destrucción de las

microvellosidades intestinales. Las epidemias causadas por este
microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos
cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis infectiva es de
106 microorganismos. (Brogden KA et al. ,2000)

Escherichia coli enteroinvasiva EIEC

A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos,
en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias.
Algunas características importantes de este microorganismo que permiten
diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de
carbono, no descarboxilan la lisina, es inmóvil y anaerogénicas. La
patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir
el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas.
(Brogden KA et al. ,2000)

Escherichia coli enterohemorrágica EHE

Esta produce verotoxina, denominada así por su efecto citotóxico sobre las
células Vero, una línea de células renales de mono verde africano. Existen al
menos dos variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con
colitis hemorrágica, una variedad grave de diarrea; y con el síndrome urémico
hemolítico, enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia
hemolítica microangiopática y trombocitopenia. La causa más común de esta
infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente
carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis
hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la
cocción completa de la carne. (Murray P, Baron E.J, Pfaller M, Tenover F, Yolken
R., 1999)

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El grupo coliforme constituye a los microorganismos que habitan principalmente
en la flora intestinal, son constantes, abundantes y casi exclusivos de la materia
fecal y pueden sobrevivir en aguas potables, por lo tanto se pueden usar como
indicador de contaminación fecal en el agua. (Mims, Playfair, Roitt, Wakelin and
Williams., 1999)

También cuando los coliformes llegan a los alimentos, se reproducen y a

diferencia del agua que indica una contaminación reciente, en los alimentos
indica malas prácticas sanitarias. (Mims, Playfair, Roitt, Wakelin and Williams.
,1999)

La determinación de microorganismos por coliformes totales por el método del

número más probable se basa en que los coliformes fermentan la lactosa en
ácido y gas. Se divide en dos fases la presuntiva y afirmativa. (NORMA OFICIAL
MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995)

HIPOTESIS

Se espera que el número de coliformes totales se encuentre debajo del máximo

permitido por las autoridades, ya que la muestra es tomada de productos que
se encuentran en el mercado y están en constante monitoreo, así como que se
usan los estándares de calidad y salubridad requeridos.

PROCEDIIENTO
1. Agua y hielo

1.1 Prueba presuntiva 

1. Agitar la muestra y transferir volúmenes de acuerdo con el cuadro 1, a
cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan
seleccionado. Agitar los tubos para homogeneizar la muestra.
2. Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h., observar
si hay formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de
Durham); si no se observa producción de gas, incubar 24 h. más.
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Tabla 1. Preparación de inóculo con caldo lauril sulfato de sodio

1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

1. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la
prueba presuntiva, a tubos que contiene caldo de bilis verde brillante
(brila), con campana de Durham.
2. Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.
3. Incubar a 35  2C durante 24 a 48 h.
4. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez
(crecimiento) y producción de gas después de un período de incubación
de 24 a 48 h.
5. Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de
organismos coliformes totales/100 mL.

1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

1. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la
prueba presuntiva a tubos con caldo EC.
2. Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.
3. Incubar a 44.5  0.1C en incubadora o un baño de agua con circulación
durante 24 a 48 h.
4. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento
y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.
5. Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de
organismos coliformes fecales/ 100 mL.

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Control de calidad para coliformes fecales

Inocular en tubos de caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una
de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar junto con las
muestras.

1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli

1. Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y
sembrar por estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su
aislamiento. Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h.
2. Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología
colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no
hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más
parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estándar para
realizar las pruebas de morfología microscópica y pruebas bioquímicas.
3. Incubar las placas a 35°C por 18-24 h.
4. Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia
de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.

1.4.1 Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC).

A partir de las cajas de agar cuenta estándar, selecionar una colonia,
resuspenderla en 2 ml de solución salina isotonica para realizar las siguientes
pruebas bioqupimicas.

a. Producción de indol (I)

1. Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo con

caldo triptona, incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h.
2. Finalizada la incubación, adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de
Kovacs o Ehrlich.
3. La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera
como prueba positiva para la presencia de indol.

b. Producción de ácidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM)

1. Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que

contenga caldo RM-VP, incubar a 35°C por 48 ± 2 h.

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2. Finalizada la incubación, adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.

3. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un
color amarillo es una prueba negativa. c. Producción de metabolitos
neutros (Voges-Proskauer VP)
4. Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que
contenga caldo RM-VP, incubar a 35°C por 48 ± 2 h.
5. Finalizada la incubación , adicionar 0.6 mL de solución KOH 40% (VP1),
agiatr y 0.2 mL de solución alfa- naftol (VP2 )y agitar.
6. Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una
prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.

d. Utilización del citrato (C)

1. Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que

contenga caldo citrato de Koser o agar citrato de Simmons (opcional)
Incubar a 35°C por 96 h.
2. El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato
de Koser, se considera una prueba positiva.

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Material Reactivos
Mechero Agar caldo lactosado
Caja Petri Agar caldo bilis verde brillante
Matraz Erlenmeyer Caldo EC
Pipeta de 1 mL Agar medio estándar
Pipeta de 5 mL Agar eosina azul de metileno
Pipeta de 10 mL Caldo RM-VP
Vaso precipitado Reactivo de Kovac
Tubos de ensayos Rojo de metilo
Varilla para agitar Alfa naftol
Utensilios estériles Hidroxido de potasio al 40%
Campana de Durham Tinción de Gram
Portaobjetos
Cubreobjetos Muestra
Equipo Barbacoa de chivo
Autoclave (olla)
Balanza
Incubadora
Campana de flujo laminar
Microscopio

CÁLCULOS
Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable
conforme al procedimiento señalado en la tabla 1, para estimar la población de
bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli en
muestras de agua.

Tabla 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con
20 mL de muestra de agua o hielo.
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Tabla 3. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos
con 10 mL de muestra de agua o hielo.

Todos los cultivos que:

Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos, no esporulados, fermenten la
lactosa con producción de gas dentro de las 48 h. a 35°C. y se obtenga las
siguientes combinaciones para las pruebas IMVIC: Biotipo 1(++--)

Biotipo 2 (-+--) son consideradas como Escherichia coli.

Para calcular el NMP de E. coli utilizar a proporción de los tubos positivos de la

prueba confirmatoria en caldo EC.

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GRAFICAS Y DIAGRAMAS

BIBLIOGRAFÍA Y LINKOGRAFÍA
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995. Productos cárnicos
troceados y curados. Productos cárnicos curados y madurados. Disposiciones y
especificaciones sanitarias. Apéndice normativo B. De la estimación de la
densidad microbiana por la técnica de número más probable.

Food and Drug Administration “Bacteriological Analytical Manual”. 9 th ed.

Arlington, VA: AOAC. 2003

Murray P, Baron E.J, Pfaller M, Tenover F, Yolken R., Manual of Clinical

Microbiology. 7th edition. ASM Press, Washington. 1999.

Brogden KA et al., Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens. 3rd ed. ASM

Press. Washington. 2000
Mims, Playfair, Roitt, Wakelin and Williams., Microbiología Médica, 2ª edición.
Mosby, Harcourt Brace, España, 1999.

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