Módulo 1.

Muestreo y examen microscópico de los alimentos Cuando se elaboran alimentos o cuando se tiene que controlar su calidad y/o seguridad, los análisis microbiológicos proporcionan información muy valiosa, respecto a: la calidad de las materias primas, las condiciones sanitarias en que se procesó el alimento, y sobre la efectividad del proceso, específicamente de los métodos de conservación. Como químicos sabemos que antes de proceder a un análisis es indispensable: • tener claro el objetivo de un análisis, • identificar los analitos adecuados y las técnicas para determinarlos, y • planear correctamente el tipo y la forma de muestreo y de manejo de las muestras.

Parte A. PLANES DE MUESTREO Y CRITERIO MICROBIOLÓGICO
ICMSF es la Comisión Internacional para la Especificación Microbiológica de los Alimentos (en inglés, International Comssion on Microbiological Specification for Food) y forma parte de la Organización Mundial para la Salud (OMS). Está constituida por representantes de la mayoría de los países en el mundo. ICMSF surgió por la necesidad de regular el comercio internacional de alimentos estableciendo límites microbiológicos, métodos de análisis y de muestreo. Existen diversos métodos de muestreo, pero el de ICMSF está siendo adoptado rápidamente por la industria de alimentos relacionada con el comercio internacional. La calidad de los alimentos Según Adams y Moss (2000), la calidad de los alimentos depende de 3 factores: • Seguridad. Un alimento no debe contener ciertos niveles de microorganismos patógenos o de sus toxinas que causen enfermedades cuando éste se consuma. • Aceptabilidad. Un alimento no debe contener niveles de microorganismos tales que lo conviertan en organolépticamente inaceptable en poco tiempo. • Consistencia. La calidad de los alimentos debe ser consistente, es decir, no mostrar variaciones de lote a lote, tanto desde el punto de vista de seguridad como de aceptabilidad. Para determinar la calidad de un alimento se debe tomar una muestra y suponer que la calidad de esa muestra refleja la del lote del que fue tomado. La validez de esta extrapolación dependerá de la representatividad de las muestras y de la exactitud y precisión del análisis. De ahí la importancia de establecer un plan de muestreo adecuado. 1

evaluando la seguridad del alimento. que es el número máximo de unidades defectuosas aceptables. Un plan de muestreo es más estricto mientras mayor sea el número de unidades analizadas (n) y menor el número máximo de unidades defectuosas a aceptar (c). la vida de anaquel y la utilidad o adecuabilidad de un alimento o ingrediente para cierto propósito (Smoot y Pierson. de acuerdo con el alimento y el microorganismo a analizar. 2002).Es necesario entonces contar con un criterio microbiológico para determinar si un alimento es de buena o de mala calidad. Mediante el uso de una curva de operación característica (para un par determinado de valores n y c) se puede determinar qué tan discriminante es un plan de muestreo. Un plan de muestreo está descrito por 2 valores: n. 2 . PLANES DE MUESTREO (ICMSF. 2002) Un plan de muestreo debe incluir un procedimiento de muestreo y un criterio de decisión. La unidad de muestra es cada uno de los elementos que constituyen la muestra. • Detalles de los métodos analíticos para detectar o cuantificar esos microorganismos o toxinas. que es el número de unidades a analizar y c. mientras que el riesgo del consumidor describe la probabilidad de que un lote malo sea aceptado falsamente (Pa). En esta curva se grafica la probabilidad de aceptación de un lote contra la calidad real del lote (porcentaje de unidades defectuosas). ya que al diferir en origen. • El número y tamaño de muestra que debe ser tomado de un lote de alimento. • Los límites microbiológicos apropiados. Según la Comisión Internacional para la Especificación Microbiológica de Alimentos (ICMSF. el seguimiento de buenas prácticas de manufactura. deben incluirse los siguientes factores en un criterio microbiológico: • Una descripción del alimento al que aplica el criterio. El riesgo del productor describe la probabilidad de que un lote aceptable sea falsamente rechazado (1 . • Una descripción de los microorganismos o toxinas capaces de causar problemas. cada alimento representa diferentes problemas de descomposición y de seguridad.Pa). Una muestra es un grupo de unidades que se sustraen para estimar el carácter de una población. composición y procesamiento. 1997).

ésta deberá ser representativa. Por estas razones existen presiones políticas o administrativas para reducir el muestreo. en el caso que se esperen diferencias en la calidad del lote. • La sustracción de un número grande de unidades pequeñas provee mayor protección que la del mismo peso total de muestra en menos unidades. Esto traerá como consecuencia el aumento en la probabilidad de error. • Lo relevante no es la sustracción de una fracción del lote. ser reprocesado. • Cuando no es posible tomar una muestra al azar de todo un cargamento. las decisiones se basan en la presencia o ausencia de algún microorganismo o en el resultado positivo o negativo de una prueba. MÉTODOS DE MUESTREO Existen diferentes tipos de datos: En el caso de los de atributos. sino el tamaño de la muestra tomada al azar y los criterios de aceptación y de rechazo. • El tamaño de la muestra es crítico en situaciones de análisis de presencia o ausencia. se le llama a esta sección el marco y los resultados y conclusiones aplicarán solamente a éste. Planes de 2 clases (Figura 1). Para asegurar que la condición de la muestra tomada sea lo más similar a la del lote del que se sustrajo. • Al aumentar el riesgo debe aumentar el número y el tamaño de las unidades. para minimizar la probabilidad de aceptar un lote que debería ser rechazado. sino sólo de una sección accesible. En los de medida la variable es continua. Se consideran los siguientes principios fundamentales: • n se refiere al número de unidades que se sustraen de manera separada e independiente. destruido o prohibido para el consumo humano. Los de medida pueden ser convertidos en los del tipo atributo estableciendo un valor límite. • La muestra real consiste de aquéllas unidades que se examinan. 3 . después de analizar las unidades: ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m se consideran aceptables. ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores mayores de m se consideran defectuosas. • A menor uniformidad. Son aquéllos en los que la muestra se divide en dos clases. Para lograr lo anterior se sugiere realizar un muestreo al azar o un muestreo estratificado. • Los análisis microbiológicos son laboriosos y lentos y los alimentos son perecederos.Un lote rechazado deberá regresarse al productor. será necesario sustraer un mayor número de muestras. como una concentración o un número.

⇒ Las unidades con las que se obtengan valores mayores de M defectuosas. algunas unidades pueden resultar en el rango marginalmente aceptable. • Permiten advertir aumentos en los riesgos. m es un valor crítico arriba del cual la unidad analizada se considera defectuosa. de analizar las se consideran se consideran se consideran En ambos casos la probabilidad de aceptación dependerá de los valores n y c seleccionados. aún observando buenas prácticas de manufactura. sin causar problemas. Las ventajas del uso de los planes de tres clases son: • De acuerdo con la experiencia práctica. después unidades: ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m aceptables. 4 . ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre m y M marginalmente aceptables. y se pueden aceptar. • Se afectan menos por cambios en la distribución de microorganismos dentro de un lote. Son aquéllos en los que la muestra se divide en tres clases. Planes de 3 clases (Figura 2). debidos a causas desconocidas. si existe una tendencia de aumento en el número de unidades marginalmente aceptables.Se pudo haber realizado una prueba para determinar la presencia o ausencia de un microorganismo o una para determinar una cuenta microbiana o la concentración de una toxina.

PLANES DE 3 CLASES Resultados cuantitativos Concentraciones m M Aceptables Marginalmente aceptables Defectuosas 5 .PLAN DE MUESTREO DE DOS CLASES n = número de unidades a analizar c = número máximo de unidades defectuosas que se pueden aceptar m = Cantidad que distingue aceptables de defectuosas m Aceptables Defectuosas Figura 1 Planes de muestreo de dos clases.

Figura 2 Planes de muestreo de 3 clases. o sea que para considerar que la calidad del lote es buena analizarse 5 unidades del lote y no se acepta ninguna unidad defectuosa. Entonces cuando el lote no contiene ninguna unidad defectuosa la probabilidad de aceptación es de 95% y cuando contiene 45% de unidades defectuosas. con el plan establecido. Curvas de operación Una curva de operación (Figura 4) es la que se obtiene al graficar la probabilidad de aceptación. Se presentan 4 figuras con curvas para diferentes valores de n (5. Se presenta en la Figura 4 la curva de operación para el plan de muestreo n = 5 c = 0. la Pa disminuye cuando n aumenta y cuando el valor c disminuye. Medición del microorganismo por: Pruebas de presencia o ausencia concentración ↓ Plan de dos clases ↓ Es posible aceptar la presencia de este microorganismo en el alimento? ↓ ↓ NO SI c=0 c≥0 ↓ ↓ Seleccionar Seleccionar n nyc Figura 3 Selección del tipo de plan de muestreo. con valores entre 0 y 1 y el porcentaje real de unidades defectuosas del lote (considerando que se hubieran analizado cada una de las unidades del lote).15 y 20) y en cada figura se presentan curvas de operación para diferentes valores de c. 10. la probabilidad de rechazo sería de 95%. Pruebas ↓ Plan de tres clases ↓ Seleccionar n y c de 6 . En la Figura 3 se presenta un diagrama de flujo sugerido por el ICMSF (2002) para la selección del tipo de plan de muestreo. El efecto de n y c en la rigurosidad del plan de muestreo En la Figura 5 se presentan las curvas de operación para diversos valores de n y c. Como se puede observar.

Figura 4 Curva de operación característica para el plan de muestreo n=5. (ICMSF.Es posible entonces. diseñar planes de muestreo tan estrictos como se requiera. modificando los valores de n y c. c=0. 7 . 2002).

La seriedad del tipo de riesgo según el microorganismo a analizar. 2002). la posibilidad de ocurrencia del estado portador y la extensión potencial. 2. Las condiciones a las que se expondrá el lote del alimento. El plan de muestreo deberá ser más estricto mientras mayor sea el riesgo que implique el tipo de microorganismo a analizar. Shigella dysenteriae. Vibrio cholerae.Figura 5 Efecto de los valores n y c en la rigurosidad del plan de muestreo (ICMSF. Tipo de riesgo. dañan su salud. amenazan su vida y presentan dosis infectivas pequeñas. Los factores a considerar en el tipo de riesgo son: • Médicos y epidemiológicos. como la asociación inherente con riesgos severos. Taenia solium y Taenia saginata. su frecuencia. que produce una toxina fatal. como ocurre en el caso de Salmonella typhi. SELECCIÓN DEL PLAN DE MUESTREO Para seleccionar un plan de muestreo adecuado es necesario considerar: 1. duración. • Etiológicos. la infectividad del microorganismo. o como Clostridium botulinum. que sobreviven y se multiplican en el hombre. que incluyen la severidad clínica de la enfermedad producida. Entamoeba histolytica. 8 .

Riesgo severo. la asociación entre ciertos tipos de patógenos con ciertos alimentos. Se clasifica entonces a los microorganismos o grupos de microorganismos de acuerdo al tipo de riesgo que representan en: Sin riesgo a la salud. Incluye microorganismos que presentan riesgos epidemiológicos severos. Se incluye aquí a los grupos microbianos responsables de la descomposición de alimentos. Dependiendo de la naturaleza del microorganismo y de la del alimento. las costumbres dietéticas y de la preparación de los alimentos. Riesgo moderado de extensión amplia. como los microorganismos mesófilos aerobios. Riesgo indirecto. Efecto de las condiciones a las que se expondrá el alimento. existen condiciones que pueden provocar: 9 . La propensidad de ciertos tipos de microorganismos patógenos de encontrarse distribuidos ampliamente en el reino animal. Son diseminados por alimentos específicos. un bebé o un enfermo puede ser un riesgo severo. La enfermedad resulta de inóculos relativamente pequeños.• Factores clínicos. para un adulto. que indican (de manera indirecta) la posible presencia de microorganismos patógenos. la paratifoidea. ancianos y enfermos. que disminuyen su aceptabilidad. Riesgo moderado de extensión moderada. los coliformes totales y fecales. las costumbres locales. Se considera a los microorganismos indicadores. ya que se debe tomar en cuenta que lo que para un adulto normal representa un riesgo moderado. Los microorganismos incluidos en este grupo presentan riesgos severos a la salud. Se deberán tomar en cuenta las altas tasas de mortalidad ocasionadas por enfermedades como la disentería y el botulismo. los enterococos y Staphylococcus aureus. Son microorganismos ubicuos en la naturaleza y la enfermedad que producen está relacionada con números grandes del patógeno. Se debe mencionar que ésta no es una clasificación rígida. • Factores epidemiológicos. la convalescencia larga de enfermedades como la fiebre tifoidea. los estándares de higiene. la brucelosis y la vulnerabilidad de niños. pero pueden introducirse al alimento por contaminación ambiental o cruzada. su vida de anaquel. pero que como grupo de microorganismos no se considera que causen daño a la salud. las secuelas severas de la acción de Streptococcus beta-hemolítico. En la Tabla 1 se presenta una clasificación de microorganismos y parásitos de acuerdo con los criterios anteriores.

así como un plan de muestreo para cada uno (Tabla 2). • Disminución del riesgo. Por ejemplo. cuando la cocción no ocurre inmediatamente antes del consumo. el ICMSF propone que se consideren 15 casos. Tipo de riesgo Riesgo severo Organismo Clostridium botulinum tipos A.• Aumento del riesgo. o el nivel de detectabilidad de una prueba. E y F Shigella dysenteriae Salmonella typhi serotipos paratyphi A y B Escherichia coli enterohemorrágica virus de la hepatitis A y E Brucella abortus. El valor M es un nivel de contaminación riesgoso. provocado por malas prácticas higiénicas. El valor m se define como el nivel de microorganismos aceptable y obtenible con buenas prácticas de manufactura. Tabla 1 Agrupación de microorganismos y de parásitos de acuerdo al tipo de severidad del riesgo (Smoot y Pierson. Determinación de los valores m y M. cuando se sabe que se aplicará al alimento un procesamiento térmico. 1997). Éste puede ocurrir por recontaminación después del procesamiento. B. Indicadores de sanidad: niveles que indican una condición de sanidad inaceptable. uso de tal manera que permita la multiplicación de microorganismos. Microorganismos de descomposición: serán los niveles de microorganismos que producen una descomposición detectable (olor o sabor) o una vida de anaquel inaceptablemente corta. Brucella suis Vibrio cholerae 01 Vibrio vulnificus Taenia solium 10 . Microorganismos que presentan un riesgo a la salud: los niveles de microorganismos (o concentración de toxinas) que producen enfermedades. Combinando estos dos aspectos. o un valor numérico. • El riesgo no se modifica. Puede tener un valor de cero o de ausencia de cierto microorganismo.

otras cepas enterovirulentas de E. Shigella spp. coli Streptococcus pyogenes Rotavirus Virus del grupo Norwalk Entamoeba histolytica Diphyllobotrium latum Ascaris lumbricoides Criptosporidium parvum Riesgo moderado de extensión limitada Bacillus cereus Campylobacter jejuni Clostridium perfringens Staphylococcus aureus Vibrio cholerae no 01 Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Giardia lamblia Taenia saginata 11 .Riesgo moderado de potencialmente amplia extensión Listeria monocytogenes Salmonella spp.

c = 2 n = 5. Condiciones en las que se espera que el alimento sea manejado y consumido después del muestreo Condiciones que Condiciones que Condiciones que reducen el riesgo no modifican el incrementan el riesgo riesgo Vida de anaquel Sin cambio Vida de anaquel aumenta disminuye Caso 1 Caso 2 Caso 3 3 clases 3 clases 3 clases n = 5. (2001).. Fundamentals and Frontiers. c = 0 Caso 13 Caso 14 Caso 15 2 clases 2 clases 2 clases n = 15. 12 .R. ICMSF (2002) Microorganisms in Foods 7. Doyle M. c = 1 n = 10.J. vida de anaquel. c = 3 n = 5. D.U. c = 2 n = 5. c = 1 Caso 7 Caso 8 Caso 9 3 clases 3 clases 3 clases n = 5. c = 0 Grado de riesgo Sin riesgo directo. extensión limitada Moderado. The Royal Society of Chemistry. Food Microbiology. Moss. E... directo. c = 1 Caso 10 Caso 11 Caso 12 2 clases 2 clases 2 clases n = 5. Microbiological Testing in Food Safety Kluwer Academic/Plenum Publishers. Montville T.P. c = 2 n = 5.C. c = 0 n = 60. directo Referencias Adams M.R. extensión amplia Severo.O. (2000). indirecto (indicadores) Moderado. c = 1 Riesgo disminuye Riesgo no cambia Riesgo aumenta Caso 4 Caso 5 Caso 6 3 clases 3 clases 3 clases n = 5. c = 0 n = 20. descomposición Riesgo a la salud Bajo. c = 3 n = 5. ASM Press. c = 0 n = 30. M. Gran Bretaña.Tabla 2 Planes de muestreo sugeridos por el ICMSF (2002) para las diferentes combinaciones de riesgo a la salud y condiciones de uso. c = 0 n = 10. Beuchat L. Washington. Food Microbiology. directo.

(1997) Indicator microorganisms and microbiological criteria.R. tratamiento térmico..Smoot L. (Eds) Food Microbiology. Montville T. ó Campylobacter.D. Por ejemplo la presencia de gran cantidad de cocos Grampositivos puede implicar la presencia de toxina estafilocóccica..M. es importante hacer un examen microscópico directo del alimento o de una de las primeras diluciones. aún cuando los microorganismos pueden no estar viables. para buscar alguno de los géneros posiblemente implicados: Salmonella. Si se encuentran cantidades importantes de bacilos Grampositivos esporulados.C. Vibrio. EXAMEN MICROSCÓPICO DEL ALIMENTO Cuando se tiene un alimento alterado por microorganismos ó en descomposición y cuando se sospecha que un alimento está involucrado en una ETA. ASM Press. Portaobjetos previamente marcados Asa microbiológica Reactivos Colorantes de Gram Metanol Xilol (xileno ó dimetil-bencenos) PRECAUCIÓN: Flamable. Shigella. D. Yersinia. Fundamentals and Frontiers. En: Doyle M. la microbiota que se encuentra en una tinción de Gram de dicha preparación puede orientar al analista sobre el problema. Beuchat L. conviene considerar el manejo que ha tenido el alimento (refrigeración. Washington.J.. Escherichia. condiciones aeróbicas o anaeróbicas) y relacionarlas con los posibles contaminantes. ya que el calentamiento puede destruir a la bacteria pero no a la toxina.P. aún si los cultivos resultan negativos. Parte B. evitar exposición en embarazo 13 . Pierson M. La presencia de bacilos Gramnegativos se debe relacionar con los síntomas y periodos de incubación. A continuación se describe el método para el examen microscópico de alimentos en general: Equipo Microscopio óptico Material y muestras Alimento homogenizado o dilución 10-1. 66-80.

enjuagar y secar al aire. EVITAR LA INHALACIÓN.fda. Aplique las muestras con pipeta Pasteur. sumergiendo en xilol por 2 minutos.ilo.Procedimiento 0.org/public/english/protection/safework/cis/products/icsc/dtasht/_icsc00/i csc0086. Se deben examinar al menos 10 campos de cada preparación. Referencias CFSAN. con 1000x y aceite de inmersión.html International Labour Organisation. 2006. 2002. Disponible a través de Internet en: http://www.gov/~ebam/bam-2. así como de leche bronca. PRECAUCIÓN: El xileno es muy flamable y es tóxico. escurrir y secar. buscando los tipos predominantes de microorganismos.htm 14 . aplicando una cantidad conocida de muestra en una superficie definida. Bacteriological Analytical Manual (online). (ILO). Disponible a través de Internet en: http://www. Teñir las preparaciones con el método de Gram 4. Examinar al microscopio. Desengrasar las muestras de alimentos (que lo requieran). cocos Grampositivos y bacilos Gramnegativos. En esta práctica NO SE UTILIZA MECHERO por el xilol. Para el examen microscópico de huevo congelado y en polvo. USFDA. 3. que es muy volátil y flamable. ya que es insoluble en agua. escurrir. International Occupational Safety and Health Information Centre. escurrir. EMPLEAR LENTES DE PROTECCIÓN. 2. International Chemical Safety Cards (ICSC).cfsan. P-xylene. NO USAR MECHEROS CUANDO SE USA XILOL. 1. secar al aire y fijar con metanol durante 1 a 2 minutos. Hacer preparaciones fijas. en particular costridia. lavar en metanol para eliminar el exceso de xilol. el método se aplica de manera cuantitativa. EVITAR LA EXPOSICIÓN EN EL EMBARAZO.

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