Bioquímica de procesos

Ampliación de un bioproceso de producción y purificación de B-

ficoeritrina que involucra sistemas acuosos de dos fases: experiencias
prácticas

Resumen

Uno de los segmentos más atractivos en las industrias de alimentos y cosméticos es el de

los pigmentos naturales. Ya que Se ha informado que algunos pigmentos sintéticos son
peligrosos para los humanos, obteniéndose pigmentos naturales a través de procesos
biotecnológicos representan una alternativa atractiva. Nuestro grupo de investigación ha
previamente trabajó en el desarrollo de un proceso prototipo basado en un sistema
acuoso de dos fases (ATPS) para recuperación de B-ficoeritrina (BPE), un pigmento
natural de alto valor obtenido de Porphyridium cruentum.

Los estudios detallados que describen la ampliación de los procesos ATPS desde la escala
de banco hasta las instalaciones de la planta piloto son no es común. En este artículo, las
experiencias derivadas de la ampliación de un proceso previamente desarrollado para La
producción y recuperación de BPE altamente purificado (pureza definida como la relación
de absorbancia A545 /A280> 4) son descrito, donde se implementó un factor de escala de
850 ×. Caracterización de la disrupción celular con un el molino de bolas a escala piloto
permitió una liberación eficiente de BPE a 2900 rpm, carga de muestra del 10% (p / v),
cuenta del 60% (v / v) carga y perlas de vidrio de 0,5 mm y 22 minutos de tiempo de
residencia con un rendimiento de 1,35 mg de BPE / g de biomasa húmeda.

El BPE se recuperó y se purificó utilizando una estrategia que comprende precipitación

isoeléctrica, dos fases acuosas fraccionamiento y ultrafiltración. Se logró un rendimiento
global de recuperación de BPE del 54%, con una pureza final de 4.1.

bajo condiciones de proceso óptimas. Considerando los costos totales de materias primas
y gastos de energía para un lote, se determinó que el costo de producción de BPE era de $
1.17 USD / mg, que está debajo El precio comercial de un estándar BPE (> $ 30 USD /
mg).

1. Introducción pigmentos artificiales se ha planteado en

informes anteriores [1, 2, 5]. En este
La industria biotecnológica ha crecido contexto, la producción a gran escala de
exponencialmente en los últimos años, y pigmentos naturales ha llamado la
uno de los segmentos más atractivos es atención de varios grupos de
el de los pigmentos naturales con investigación para satisfacer su demanda
aplicación en alimentos, cosméticos y en todo el mundo.
biología molecular [1,2]. Por otro lado, la
industria del mercado de los pigmentos Las ficobiliproteínas son una familia de
sintéticos ha experimentado un estricto proteínas coloreadas que pueden usarse
régimen de regulación debido a los como pigmentos naturales. Estas
riesgos y los efectos perjudiciales que moléculas son proteínas con grupos
varios de estos pigmentos ejercen sobre protésicos lineales (bilinas) que están
la salud humana [3,4]. El desarrollo de unidos a residuos de cisteína específicos.
enfermedades mentales, alergias y Estos compuestos se encuentran
diversos tipos de cáncer asociados con principalmente en algas eucariotas
biflageladas, cianobacterias (algas azul-
verdes) y rodophyta (algas rojas). Las
ficobiliproteínas están presentes en un
complejo fotosintético llamado
ficobilisoma y funcionan como pigmentos
accesorios para permitir la absorción de
la luz. En función de sus patrones de
absorción, estas proteínas se clasifican
en: (i) ficoeritrinas (PE con λ máx = 540–
570 nm), (ii) ficoeritrocianinas (PEC con
λ máx = 570 nm), (iii) ficocianinas (PC λ
máx = 610– 620 nm) y (iv) aloficocianinas
(APC λ máx. = 650–655 nm) [2]

Estos pigmentos a base de proteínas se

han utilizado en la industria alimentaria
y cosmética como colorantes naturales.
Sin embargo, su aplicación principal se
encuentra en la biología molecular y la
biomedicina como biomarcadores
fluorescentes [1,2,6,7]. En consecuencia,
el diseño de bioprocesos novedosos y
eficientes para la recuperación y
purificación de ficobiliproteínas,
particularmente B-ficoeritrina (BPE), es
de gran interés. El BPE en su nivel de
pureza más alto tiene un valor comercial
considerablemente alto (> 30 USD / mg
dependiendo de la naturaleza de la
presentación final del producto) [8,9]. En
términos de sistemas de expresión
utilizados para la producción de BPE, el
alga roja Porphyridium cruentum
constituye uno de los mejores caballos
de batalla, ya que su ficobilisoma está
constituido principalmente por BPE [10].
Estructuralmente, la molécula de BPE de
P. cruentum presenta 3 subunidades
molares α , β y γ con una relación molar
de 6:6:1 (un total de 13 subunidades)
con pesos moleculares de 18,18 y 29
kDa respectivamente [7], con una masa
molecular total de 245 kDa.
El diseño y aplicación de bioprocesos
para la recuperación y purificación de
RPE y BPE se ha informado
anteriormente [7, 11, 12]. Sin embargo,
esos protocolos implicaron una gran
cantidad de pasos
Fig. 1. Representación simplificada del
proceso a escala propuesto usando
precipitación isoeléctrica y sistemas acuosos
de dos fases como técnicas primarias de
recuperación y purificación para obtener BPE.
Después de la fermentación de P. cruentum,
se utiliza una etapa de recuperación para
eliminar el sobrenadante. El concentrado de
biomasa se resuspende y luego se agrega al
molino de bolas para la interrupción celular.
La precipitación isoeléctrica se realiza
mediante la adición de HCl hasta que se
alcanza un nivel de pH de 4. El sedimento
precipitado se resuspende con tampón fosfato
dibásico y se mezcla con sales de fosfato de
potasio y PEG 1000 para formar el ATPS
propuesto. Finalmente, la fase superior se
procesa a través de una unidad de
ultrafiltración para obtener BPE altamente
purificado (pureza = 4.2) y una recuperación
total del 54%. Las corrientes involucradas en
el bioproceso están numeradas de S1 a S15.
que obstaculizó el potencial escalable
industrial del diseño metodologías La
viabilidad de escalamiento de un
proceso depende de la naturaleza de
las operaciones unitarias [13, 18]. Además, la filtración de flujo
involucradas [13]. El diseño de un cruzado es infinita Los pasos de
prototipo novedoso y eficiente para la pulido proporcionan ventajas
recuperación y purificación de BPE importantes a los procesos
ha sido informado previamente por diseñados, ya que la polarización de
nuestro grupo de investigación a la membrana se reduce en
escala atlab [13-15]. El proceso comparación con la filtración de flujo
desarrollado comprendió pocas de tapón. La presión transmembrana
operaciones unitarias para es relativamente constante y las
maximizar el rendimiento de operaciones de alto rendimiento
recuperación general (∼72%) sin pueden implementarse con el equipo
comprometer la pureza del BPE industrial adecuado [19]. Aunque las
(definido como una relación de técnicas antes mencionadas son bien
absorbancia A545/A280> 4). Del conocidas por su ampliación, es
proceso prototipo desarrollado a crucial caracterizar y optimizar el
escala de banco se define un proceso a nivel de planta piloto antes
bioproceso de planta piloto. Este de alcanzar la escala comercial. Por
bioproceso está compuesto por cinco lo tanto, es necesaria una
operaciones de unidades principales caracterización adecuada de la
(Fig. 1): (1) fotobiorreactor, (2) ampliación de los bioprocesos de
disrupción celular con un molino de laboratorio diseñados para la
cuentas, (3) precipitación producción, recuperación y
isoeléctrica, (4) sistemas acuosos de purificación de BPE de P. cruentum.
dos fases (ATPS) y ( 5) ultrafiltración El presente trabajo de investigación
de flujo cruzado. presenta las experiencias prácticas
derivadas de la ampliación de un
Los molinos de bolas constituyen
bioproceso de producción y
una opción atractiva para la
purificación de BPE utilizando P.
disrupción celular a nivel industrial,
cruentum como sistema de expresión
ya que se han estudiado y
a escala de planta piloto. Se
caracterizado adecuadamente, lo que
implementó un factor de escala de
permite un mayor rendimiento en la
850X al comparar nuestro proceso
implementación de bioprocesos
prototipo anterior a escala de
[16,17]. Las técnicas de precipitación
laboratorio y la estrategia propuesta
isoeléctrica son fácilmente escalables
a escala de planta piloto. Se discuten
y no requieren instrumentación
los resultados obtenidos, las
compleja.
experiencias prácticas y los
a nivel industrial [15]. Los sistemas principales desafíos para establecer
de extracción líquido-líquido, como el primer paso para la
ATPS, permiten la recuperación y implementación comercial del
purificación rápidas de productos bioproceso optimizado.
biológicos, la integración e
2. Materiales y métodos
intensificación de bioprocesos, el
desarrollo de un medio biocompatible 2.1. Material biologico
para compuestos biológicos y la
P. cruentum (UTEX 161) se obtuvo
posibilidad de aumentar la escala
del Centro de Investigaciones
Biológicas del Noroeste (CIBNOR),
México.
2.2. Sustancias químicas y reactivos
El polietilenglicol 1000 (PEG 1000
grado industrial) se adquirió de
Polioles S.A. de C.V. (Lerma, México).
El fosfato de potasio monobásico y
dibásico y todas las sales utilizadas
para los medios de cultivo se
obtuvieron de Desarrollo de
Especialidades Químicas (Monterrey,
México).
2.3. Medio de cultivo y condiciones de
cultivo.
P. cruentum was cultivated in
artificial seawater culture medium as
described before [7,20]. For 1 L of
culture media the following
components were added to bidistilled
water: 24.53 g NaCl, 5.20 g MgCl2,
4.09 g Na2SO4, 1.16 g CaCl2, 0.70 g
KCl, 0.20 g NaHCO3, 0.10 g KBr,
0.03 g H3BO3, 170 mg NaNO3,
13.80 mg NaH2PO4, 0.14 mg
ZnCl2, 0.20 mg MnCl2, 0.24 mg
Na2MoO4, 0.01 mg CoCl2, 0.03 mg
CuSO4, 9.90 mg EDTA disodium salt
and 4.50 mg Fe3(C6H5O7)2. Briefly,
cells were grown in batch mode in a
250 L (maximum capacity) acrylic
photobioreactor (length 100 cm,
depth 50 cm and height 50 cm) at
23–25 ◦C under artificial light
conditions (wide spectra JBL Solar
Marine Blue 35W UV lamps) with a
24 h photoperiod. Agitation and
aeration were provided with an air
flow rate of 83 cm3/s enriched with
20 cm3/s of CO2 (HAGEN, Optima
Pumps). Biomass was allowed to
grow for 30 days and later harvested
by centrifugation at 3100 × g for 10
min. Biomass yield achieved under
such conditions was 6.0 ± 0.7 g of
wet biomass per L (Thermo Scientific
IEC CL40R, WaltHam, USA).
2.4. Disrupción celular
La ruptura celular de P. cruentum se
realizó usando un molino de cuentas
(Dyno MillMulti Lab, Muttenz, Suiza)
equipado con una camisa de
enfriamiento que permitió mantener
constante la temperatura a 14 ° C a
través del procesamiento. La
liberación de BPE de P. cruentum
usando el dispositivo de molienda de
cuentas no se ha informado en la
literatura, y por lo tanto, fue
necesaria una caracterización del
efecto de diferentes parámetros del
proceso sobre la liberación de BPE.
La suspensión de células cargadas
consistió en tampón fosfato dibásico
50 mM de potasio con 20% (p / p) de
células de P. cruentum. La
suspensión celular se alimentó al
molino de bolas utilizando una
bomba peristáltica de velocidad
variable (Bomba Manostat Vera,
Thermo Scientific) a un caudal
constante de 6 cm3 / s. La cámara
de molienda se llenó inicialmente con
una carga de bolas de 70% (v / v).
Con el fin de caracterizar y optimizar
la interrupción de P. cruentum
usando un molino de bolas, primero
se realizaron experimentos para
determinar el efecto de la velocidad
de rotación y el tamaño de las
cuentas en el rendimiento de
liberación de BPE. Se emplearon
velocidades de rotación de 2300,
2900 y 4000 rpm. Para determinar el
efecto del tamaño del cordón en la
eficacia de liberación de BPE, se
probaron dos diámetros de cordón
diferentes (0,5 y 1,2 mm). Una vez
que se determinaron la velocidad de
rotación óptima y el tamaño del
cordón, se estudió el efecto de la
carga del cordón (60–80%, v / v) y la
carga de biomasa (10–30%, p / p). El
homogenado obtenido de la etapa de
disrupción celular (incluidos los
restos celulares) se denominó
extracto crudo de BPE. La constante
de liberación de BPE (k) en
condiciones de proceso óptimas se
calculó utilizando la ecuación. (1)
[21], donde t es el tiempo de
interrupción, R es la liberación de
BPE en el momento t, y Rm es la
liberación máxima alcanzable de BPE
(1,5 mg de BPE / g de biomasa
húmeda, considerando que después
de 25 minutos de la interrupción
celular se libera BPE fue constante
en este valor, por lo tanto, es el
rendimiento máximo observado).
2.5. Precipitación isoeléctrica
El extracto crudo de BPE se
centrifugó a 3100 (o 18,000) × g
durante 15 minutos (Thermo
Scientific IEC CL40R, WaltHam, EE.
UU.) Para eliminar los restos
celulares y obtener un extracto crudo
clarificado con BPE. La precipitación
isoeléctrica del extracto clarificado se
realizó de acuerdo con un informe
anterior [22]. Brevemente, el extracto
clarificado se diluyó 1: 2 con tampón
fosfato dibásico 50 mM en un tanque
de precipitación de acero inoxidable
(capacidad máxima de 25 L, radio 20
cm y altura 20 cm) equipado con una
válvula de descarga inferior. La
mezcla se acidificó con ácido
clorhídrico (HCl 0.1 N) para ajustar el
pH a 4. La temperatura se mantuvo
constante a 4 ° C usando una camisa
de enfriamiento con agua como fluido
refrigerante. La muestra se mezcló a
50 rpm usando un impulsor Rushton
(diámetro de 12 cm) durante 20 min
y luego se dejó sedimentar durante
15 h. El precipitado se recogió a
través de la válvula de liberación del
fondo y se centrifugó durante 1 hora
a 4 ° C a 3100 o (18,000) × g para
obtener una pastilla enriquecida con
BPE.
2.6. Extracción acuosa en dos
fases.
El precipitado precipitado se
resuspendió (50%, v / v) usando
tampón fosfato dibásico 50 mM y
luego se cargó en un polietilenglicol
(PEG) -fosfato de potasio ATPS. Por
conveniencia, los ATPS se prepararon
sobre una base de masa fija. Se
seleccionó la composición del sistema
que proporcionó una recuperación
óptima de BPE en la fase superior, en
base a informes anteriores [6,14,15]:
29% (p / p) PEG 1000 g / gmol, 9%
(p / p) fosfato de potasio, empate
-longitud de línea (TLL) 45% (p / p),
relación de volumen de 3.0 (VR,
definida como la relación entre el
volumen de la fase superior e
inferior), pH 7 y 40% (p / p) de carga
de muestra. Cantidades
predeterminadas de soluciones
madre de PEG y fosfato de potasio se
mezclaron con 40% (p / p) de la
muestra (precipitado resuspendido).
El peso total de ATPS fue de 8,55 kg.
Los componentes ATPS se mezclaron
en un tanque agitado de acero
inoxidable (altura 50 cm y radio 20
cm) durante 2 ha 200 rpm. Luego se
permitió que el sistema se asentara
durante 16 h para promover la
formación de fases y asegurar el 2.8. SDS-PAGE
equilibrio termodinámico. Una vez
Se usó SDS-PAGE para controlar,
que se alcanzó el equilibrio, la fase
junto con la relación de absorbancia
inferior (rica en sal) se eliminó a
A545/A280, la pureza de BPE a lo largo
través de una válvula inferior. Luego,
del proceso. Las muestras tomadas
la fase superior (rica en polímero) y la
del extracto crudo clarificado con
interfaz (que contiene el producto de
BPE, el sedimento de precipitación
interés) se recogieron en un depósito
isoeléctrico resuspendido, las fases
limpio. Se determinó el volumen de
superior e inferior de ATPS y la
cada fase y se usó para estimar la VR
solución final de BPE ultrafiltrada se
experimental. Se tomaron muestras
analizaron mediante SDS-PAGE de
de cada fase para determinar la
acuerdo con una metodología
concentración de BPE. El
informada en otro lugar [16,23]. Las
rendimiento de recuperación del
muestras se concentraron 5
producto se estimó en función de la
volúmenes usando unidades de filtro
cantidad inicial de BPE cargado en el
centrífugo Millipore de 3 kDa. Las
sistema.
muestras de proteínas se diluyeron
2.7. Ultrafiltración con tampón de muestra SDS-PAGE
(Tris – HCl 0,125 M pH 6,8, SDS 4%,
La fase / interfaz superior de la
glicerol 20%, azul de bromofenol
mezcla se pasó a través de una
0,02% y DTT 0,2 M), se hirvieron
unidad de ultrafiltración (sistema
durante 10 minutos y se cargaron a
piloto de sobremesa FlexStand de GE
15% (p/v) gel de poliacrilamida SDS.
Healthcare) con una membrana de
La electroforesis se realizó con
fibra hueca de 100 kDa (UFP-100-E-
tampón Tris-glicina a 150 V durante
6A, GE Healthcare). Antes del
2,0 h en una cámara de electroforesis
procesamiento, la muestra se diluyó
con sistema Mini-PROTEAN® Tetra
1: 2 con tampón de fosfato dibásico
(Biorad). Los geles se retiraron del
50 mM en un depósito limpio y se
casete y se visualizaron por tinción
mezcló manualmente por inmersión
de plata. Cuando se revelaron las
hasta lograr la homogeneidad. Luego
bandas de gel, se agregó la solución
se alimentó homogeneizado al
de parada y se escanearon los geles
sistema FlexStand a través de la
usando un escáner de imagen de
bomba de desplazamiento positivo
superficie plana (GE Healthcare) a
acoplada al equipo a un caudal
300 ppp en modo transmisivo.
constante de 410 cm3 / min. La
solución se colocó en un depósito 2.9. Procedimientos analíticos
refrigerado para mantener la
La pureza del BPE se determinó en
temperatura de la solución por
función de la relación de absorbancia
debajo de 10 ° C durante el
(A545nm / A280nm), que
procesamiento. El proceso de
corresponde a un valor igual o
ultrafiltración se llevó a cabo durante
superior a 4 a un BPE altamente
12 h para eliminar la mayor parte del
purificado, adecuado para
PEG y, al mismo tiempo, concentrar
aplicaciones de biología molecular
el BPE hasta su concentración final
[2,7,15]. La concentración de BPE en
(∼50 g / L).
cada paso del proceso se estimó con
un sistema de ecuaciones
previamente informado que se basa
en los coeficientes de extinción
constantes de R-ficocianina (RPC),
Alophycocyanin (APC) y BPE a 565,
620 y 650 nm respectivamente [24 ]
Todas las lecturas de absorbancia se
realizaron en un espectrofotómetro
de barrido Thermo Scientific Genesys
10W.
2.10. análisis estadístico
Cada procedimiento se repitió al
menos por triplicado. Los resultados
presentados son el valor medio de las
réplicas. El error estándar informado
se calculó como la desviación
estándar de cada muestra dividida
por la raíz cuadrada del número de
repeticiones.
3. Resultados y discusión
3.1. Cultivo de Porphyridium
cruentum
P. cruentum es una microalga de
agua de mar conocida por su
capacidad de producir BPE en
grandes cantidades [15]. Se ha
determinado que las condiciones de
cultivo como la salinidad, el pH, la
temperatura, la intensidad de la luz y
la concentración de gases disueltos
tienen un efecto significativo sobre el
crecimiento de P. cruentum [20,25].
En el presente estudio se utilizaron
condiciones de crecimiento típicas
para P. cruentum [2,6,7]. Después de
30 días de cultivo, la biomasa
alcanzada fue de 6 g de biomasa
húmeda por L en un fotobiorreactor
de 250 L (200 volúmenes de trabajo).
Los informes de diferentes autores
han declarado que los rendimientos
de producción de biomasa de P.
cruentum varían de 5 a 40 gL −1
usando diferentes configuraciones de
biorreactor [6,26,27]. Aunque el
rendimiento de biomasa alcanzado
está dentro de este rango,
Está claro que la optimización puede
realizarse ajustando parámetros
como la exposición a la luz natural
[6] (en lugar de la luz artificial),
profundidad de cultivo [14],
geometría de biorreactor [2] entre
otros.
3.2. Disrupción celular
La etapa de disrupción celular (Fig.
1) constituye el primer crítico
paso de recuperación en el proceso
desarrollado. En informes anteriores
de nuestro grupo de investigación
[6,14,15], las metodologías preferidas
para la disrupción celular de P.
cruentum incluyeron sonicación y
maceración manual. Sin embargo, a
escala de planta piloto e industrial, la
aplicación de estas técnicas no es
factible debido a limitaciones
tecnológicas y de tiempo. Los
informes de la literatura indican que
los métodos de interrupción
mecánica, como la homogeneización
a alta presión y el molido de cuentas,
a menudo se prefieren a escala de
planta piloto e industrial [16,17,28].
En este contexto, el uso de molinos
de cuentas para la disrupción celular
se ha informado adecuadamente
para organismos como levadura [17],
bacterias [29], hongos filamentosos
[30] e incluso microalgas tales como
Spirulina platensis [31]. Sin
embargo, la caracterización de la
cinética de liberación de BPE de P.
cruentum utilizando tecnología piloto
basada en molino de bolas a escala
piloto no se ha informado
previamente. Por lo tanto, como parte
de este estudio, se realizó una
caracterización de los parámetros del
proceso (velocidad de rotación,
tamaño del cordón, carga del cordón,
concentración de biomasa y tiempo
de residencia) para determinar las
condiciones óptimas para lograr la
liberación de BPE.
El efecto de la velocidad de rotación y
el tamaño del cordón en la liberación
de BPE fue
Primero estudiado. Durante la
primera etapa experimental de
optimización de la disrupción celular,
la carga de microesferas, la biomasa
húmeda y el pH se mantuvieron
constantes al 70% (v/v), 10% (p/v) y
7.4 respectivamente. Los
rendimientos de liberación de BPE
(mg BPE / g de biomasa húmeda:
Yp /x) alcanzados para todos los
tratamientos se presentan en la Fig.
2. Los mayores rendimientos de
liberación se lograron cuando 2300
rpm con perlas de 1.2 mm (Yp/x de
0.87 ± 0.049 mg BPE / g de biomasa
húmeda) y 2900 rpm con perlas de
0,5 mm (Yp/x de 0.85 ± 0.029 mg de
BPE /g de biomasa húmeda). En el
caso de 4000 rpm, los resultados
obtenidos son significativamente más
bajos que los dos tratamientos
mencionados anteriormente. Esto
puede deberse a la presencia de un
entorno oxidativo que puede ejercer
un efecto perjudicial sobre los
cromóforos presentes en BPE [32].
Además, se ha dicho que trabajar a
velocidades de rotación más altas
(más de 3000 rpm para la alteración
de microorganismos) induce la
desnaturalización de proteínas [21].
A medida que aumenta la velocidad
de rotación, el estrés por
cizallamiento también aumenta, lo
que puede afectar la estructura de la
proteína durante la disrupción
celular [21,25]. Al comparar los
tiempos de procesamiento en los que
se alcanzó la liberación máxima
(número entre paréntesis en la Fig. 2)
se determinó que las velocidades de
rotación de 2900 rpm con bolas de
0,5 mm favorecían la liberación de
BPE (22 minutos frente a 28 minutos
cuando se usaron bolas de 2300 rpm
y 1,2 mm).
Posteriormente, el efecto de la carga
de cuentas (60%, 70% y 80%,v/v) y
la carga de biomasa húmeda (10% y
20%, p / v) se estudiaron.
Como se muestra en la Fig. 3, el uso
de concentraciones de biomasa
húmeda del 10% (p/v) y cargas de
perlas del 60% (v/v) favoreció la
cinética de liberación de BPE. Esto
puede explicarse en términos de
energía cinética. Cuando cuenta baja
se utilizan cargas (es decir, 60%, v /
v), la energía cinética involucrada en
cada colisión individual aumenta
debido a los patrones de movilidad de
las células y las perlas dentro de la
cámara [17,29,33]. Con respecto a la
carga de biomasa, el 10% (v / v)
resultó en una mejor liberación de
BPE. P. cruentum es una microalga
bien estudiada que desarrolla un
mecanismo de autodefensa conocido
como adaptación osmótica [20,26].
Esto implica una fuerte reordenación
de ácidos grasos y polisacáridos en la
membrana celular para proteger a la
célula de una posible etapa de
alteración osmótica [26]. Cuando las
células de P. cruentum se tratan en
un molino de bolas, estos
componentes estructurales se liberan
aumentando significativamente la
viscosidad del sistema [20, 26, 34]. implementadas en nuestro grupo de
Este incremento en la viscosidad investigación [14, 15] para la
produce un rendimiento de liberación liberación de BPE, se puede concluir
de BPE reducido. La constante de que la estrategia propuesta en esta
liberación de BPE calculada, en investigación brinda un rendimiento
condiciones de procesamiento y pureza mejorados. Los resultados
óptimas, fue de 0,203 min-1, siendo presentados para la liberación de
el rendimiento de BPE de 1,5 mg / g BPE de P. cruentum tienen el
de biomasa húmeda. Los parámetros potencial de ser extrapolados a otros
de molienda de cuentas propuestos productos biotecnológicos expresados
para las células de P. cruentum para esta y otras microalgas. En las
presentan semejanza con las condiciones de disrupción celular
condiciones experimentales mencionadas anteriormente, después
empleadas para otras especies de de la interrupción de 200 g de
algas como Chlorella spp. [34], biomasa húmeda resuspendida en
Spirulina platensis [31] y 2000 ml de tampón de fosfato
Scenedesmmus obliquus [31]. dibásico 50 mM atpH 7.4, se logró un
Doucha y Lívansky´ [34] rendimiento de liberación de aBPE de
establecieron que las cuentas de 223 ± 15 mgBPE con una pureza
vidrio (0,5 mm de diámetro) con una (A545 / A280) de 0.98 .
carga del 60–80% (v / v) en la
cámara de molienda, una carga de
biomasa del 15% (v / v) y 2600 rpm
produjeron más del 75% de
liberación del producto en 30 min.
Para la interrupción de Spirulina
platensis, se empleó un molino de
bolas a escala piloto con cuentas de
vidrio (0,7 mm de diámetro), una
carga de biomasa del 10% (v / v) y 25
minutos de tiempo de procesamiento
para obtener> 80% de liberación del
producto. Debido a que las
microalgas tienen potencial
industrial y se necesitan
comúnmente cultivos de alto
volumen, para la interrupción celular
a gran escala de algas (macro y
microalgas), la interrupción mecánica
en los molinos de cuentas parece ser
la estrategia más adecuada, ya que
esta tecnología se implementa
fácilmente y confiere escalabilidad
del proceso [34] Al comparar la
estrategia de molienda de cuentas
con las metodologías de sonicación
Fig. 2. Resultados de disrupción celular con perlas de vidrio de 1.2 y 0.5 mm. Además, se
estudiaron velocidades de rotación de 2300, 2900 y 4000 rpm para determinar la eficiencia
de liberación de BPE con una operación de molino de bolas. La carga de muestra y la carga
de bolas dentro de la cámara de molienda se mantuvieron constantes al 20% (p/v) y 70% (v
/ v) respectivamente. El rendimiento de BPE se expresa como los miligramos totales de
proteína recuperada divididos por la biomasa húmeda total empleada en el experimento de
disrupción. Los intervalos de tiempo presentados en cada barra representan el tiempo de
residencia total dentro del molino en el que se obtuvo la máxima liberación de BPE.
Fig. 3. Liberación de BPE a 2900 rpm, perlas de vidrio de 0,5 mm y carga variable de
perlas y muestras. Para ahorrar biomasa durante cada lote, se estudió una carga de
muestra del 10% (p / v). Además, se investigó la carga de bolas dentro de la cámara de
molienda para determinar su efecto en la liberación cinética de BPE. El rendimiento de BPE
se expresa como los miligramos totales de proteína recuperada divididos por la biomasa
húmeda total empleada en el experimento de disrupción. El tiempo total de procesamiento
fue de 30 min. Los intervalos de tiempo presentados en cada barra representan el tiempo
de residencia total dentro del molino en el que se obtuvo la máxima liberación de BPE.

3.3. Precipitación isoeléctrica disrupción celular es la generación

Se realizó una etapa de eliminación
de restos celulares antes de la
isoeléctrica
precipitación. Inicialmente,
clarificación se realizó utilizando una
fuerza centrífuga de 3100 × g
durante 15 minutos. Sin embargo,
bajo tales condiciones de
clarificación, se detectó la presencia
de restos celulares restantes, lo que
afecta negativamente la eficiencia de
las operaciones posteriores de la
unidad (particularmente
precipitación isoeléctrica y ATPS). Por
lo tanto, se realizó una optimización
de la etapa de clarificación
aumentando la fuerza centrífuga de
3100 a 18,000 × g. Una desventaja
de la molienda de cuentas para la
de partículas pequeñas de desechos
celulares, que son particularmente
difíciles de eliminar [21,34,35]. Sin
embargo, el uso de 18,000 × gy 15
la min resultó efectivo para la
eliminación de restos celulares.
Basado en el tamaño promedio de las
partículas de desechos celulares
generadas durante el molido de
cuentas, una etapa de microfiltración
(0.1–0.22 m) también puede ser
efectiva para la clarificación del
extracto crudo de BPE [21,35]. El
extracto de BPE clarificado se
procesó utilizando precipitación
isoeléctrica para eliminar
contaminantes (incluidas proteínas,
polisacáridos y compuestos de bajo
peso molecular) y concentrar BPE. La
precipitación isoeléctrica es una
operación atractiva, ya que se adapta
fácilmente a gran escala, utiliza un
equipo simple y puede llevarse a cabo
sin desnaturalización de compuestos
biológicos [22].
Nuestro grupo de investigación
determinó previamente que la
precipitación isoeléctrica de BPE de
P. cruentum fue favorecida a pH 4
[15]. los
El balance de masa para BPE en el
bioproceso implementado se presenta
en la Tabla 1. Se logró un
rendimiento de recuperación del 48%
(a 3100 × g) del BPE total en
precipitación isoeléctrica con una
pureza (A545nm / A280nm) de 1.65,
que representa un 1.5 Aumento de la
purificación. Sin embargo, este
rendimiento es más bajo que el
obtenido a escala de laboratorio.
experimentos (78%). Esta variación
se atribuyó a las diferencias en las
fuerzas centrífugas aplicadas en el
laboratorio (17,000 × g) [15] y la
escala de la planta piloto (3100 × g).
Las técnicas de sedimentación y
precipitación acelerada se han
descrito a través de un modelo de
Stokes que considera la fuerza
centrífuga como un aspecto crítico en
la eficiencia de recuperación de
partículas [36]. Por lo tanto, la fuerza
centrífuga se incrementó de 3100 a
18,000 × g durante 1 h. Esto produjo
un rendimiento mejorado de
recuperación de BPE del 65%, que es
significativamente mayor que el
alcanzado a 3100 × g. Dado que los
pasos de precipitación isoeléctrica
deben dejarse varias horas para
favorecer la formación de complejos
de proteínas, otra posible estrategia
para mejorar la recuperación del
producto sería aumentar el tiempo de
sedimentación. Además, las
moléculas floculantes o las sales
tradicionales como NaCl podrían
agregarse al sistema favoreciendo
cambios de solubilidad que podrían
mejorar la recuperación de BPE.
Un aspecto importante que debe
considerarse dentro de la
precipitación isoeléctrica y la
molienda de cuentas es la
implementación de altas fuerzas
centrífugas para la eliminación de
restos celulares y la concentración de
BPE. En términos de factibilidad
técnica, existen centrifugadoras a
escala industrial y de planta piloto
que igualan e incluso superan las
fuerzas centrífugas relativas
presentadas en esta investigación.
Por lo tanto, la ampliación futura de
esta estrategia debería ser posible. Se
podrían emplear estrategias de
microfiltración para mejorar la
clarificación de la corriente. Sin
embargo, las altas cargas de material
biológico generalmente generan un
ensuciamiento excesivo de la
membrana, lo que conduce a la
sustitución de la membrana y a los
tratamientos constantes de
desincrustación. En términos de
precipitación isoeléctrica a escala
piloto o industrial, esta técnica
podría presentar algunos
inconvenientes en las instalaciones a
gran escala. A pesar de esto, Castel
et al. [37] ha informado sobre el uso
exitoso de esta técnica simple para la
recuperación de concentrados de
proteínas de Amaranth
mantegazzianus. Se lograron
eficiencias de recuperación> 50% de
las proteínas de amaranto, lo que
ayudó a los autores a concluir que
esta estrategia podría emplearse en
procesos biológicos. Se enfatizan los
beneficios de la precipitación
isoeléctrica, ya que presenta facilidad
de escala y su simplicidad general
supera los inconvenientes
relacionados con otras técnicas de
recuperación y purificación de alto
mantenimiento.

3.4. Sistemas de extracción La extracción acuosa en dos fases es

acuosa de dos fases. una tecnología bien conocida que se
ha estudiado ampliamente a escala
de laboratorio para el selección de geometría adecuada de
fraccionamiento y la recuperación los tanques donde se forman ATPS.
primaria de productos biológicos Para operaciones a escala piloto, se
(particularmente proteínas y otras podrían recomendar valores de altura
moléculas de alto peso molecular) / diámetro (H / D) <1, ya que las
[15,38–40]. Sin embargo, los estudios bajas relaciones H / D permiten un
que abordan la ampliación de esta rápido equilibrio y formación de fase
tecnología a escala piloto e industrial en ATPS [18]. Sin embargo, en esta
no son comunes [41-43]. Como parte investigación en particular se utilizó
del presente estudio, se utilizaron un H / D mayor que uno, sin
PEG-fosfato de potasio ATPS para cambios importantes en el
recuperar y purificar BPE. Según lo rendimiento del proceso, para
descrito previamente por nuestro facilitar el manejo de las fases
grupo de investigación, BPE mostró separadas.
una clara preferencia por la fase
Aunque los rendimientos obtenidos
superior (rica en PEG) y la interfaz
para BPE en la extracción de ATPS
bajo los parámetros del sistema
son más bajos (84%) en comparación
seleccionados (29%, p / p PEG 1000
con los resultados a escala atlab
g / gmol, 9%, p / p de fosfato de
(92%), en términos de pureza, el
potasio, TLL 45%, w / w, VR 3, pH 7
objetivo se logra ya que se logró un
y 40%, w / w carga de muestra). El
nivel de pureza de 4.1 ± 0.08. Esto
uso de ATPS produjo un rendimiento
significa que el BPE obtenido con el
de recuperación del 84% y un pliegue
proceso propuesto podría incluso
de purificación de 2.3 (Tabla 1, Fig.
usarse para aplicaciones dentro de
4). En cuanto al caso de precipitación
áreas de biología molecular y
isoeléctrica, el rendimiento de
biomedicina, que requieren alta
recuperación alcanzado a escala
pureza.
piloto fue menor que el obtenido a
escala de laboratorio (92%, Tabla 1).
El uso de la centrifugación a escala
de laboratorio, para acelerar el
equilibrio del sistema y la formación
de fases, generalmente tiene un
efecto positivo en el rendimiento de
recuperación. Se ha informado que
en el lote de ATPS, la centrifugación
favorece la partición del producto a
una fase específica, dependiendo de
la afinidad biológica de la molécula Fig. 4. Gel de SDS-poliacrilamida con
hacia dicha fase [44]. Sin embargo, el tinción de plata. De izquierda a derecha,
uso de la centrifugación por lotes a se puede ver el carril marcador molecular,
escala piloto para acelerar el seguido del lisado celular (CL), el
equilibrio del sistema no es posible sedimento de precipitación isoeléctrico
debido a la masa total de ATPS. Una resuspendido (IP-P), la fase superior de la
extracción de ATPS (TP) y la misma fase
estrategia que podría favorecer la
superior después siendo tratado en el
rápida formación de fases es una
módulo de ultrafiltración (UF-TP). Se
puede ver que durante todo el proceso las
subunidades α y β de 18 kDa, junto con
la subunidad de 29 kDa γ se purifican
continuamente hasta que se alcanza la
última fase. Después de que la fase rica
en polímeros se ultrafiltra, solo se aprecia
la presencia de las bandas de interés.

3.5. Ultrafiltración de BPE de estos constituyentes de ATPS (la

mayoría de las aplicaciones
Dado que la fase superior de ATPS
conocidas de BPE no son compatible
contiene PEG (43%, p / p) y fosfato
con altas concentraciones de estos
de potasio (<1%, p / p), se requiere
productos químicos). Además, la
un paso adicional para la eliminación
ultrafiltración permite la
concentración de BPE para alcanzar
su presentación final. La Tabla 1
muestra el balance de masa para la
etapa de ultrafiltración, en la que se
logró una recuperación de BPE al
100% con un aumento de 1.75 veces
en la concentración de BPE (46 mg /
L). Esta concentración fue la máxima
alcanzada en 2500 ml de retenido
puro, ya que el volumen muerto de la
unidad de ultrafiltración es de 2 L y
se decidió trabajar 500 ml por
encima del límite del filtro. Un
aspecto que debe considerarse en las
etapas de ultrafiltración son los
cambios de caída de presión. En esta
investigación, a medida que la
concentración de BPE aumentó con
el tiempo, la caída de presión
disminuyó de 8 psi a 6.8–7 psi
después de 12 h de filtración. Debe
considerarse que las soluciones de
PEG en ATPS son viscosas, por lo
tanto, el comportamiento de
transferencia de masa se vio
obstaculizado al comienzo de la
operación. Sin embargo, dado que la
eliminación de PEG es el objetivo
principal de la etapa de
ultrafiltración, la viscosidad del
retenido disminuyó con el tiempo y,
por lo tanto, facilitó el flujo de la
solución a través del equipo. Otro
tema importante dentro de la
estrategia de ultrafiltración empleada
hace referencia a la temperatura del
proceso. Durante la etapa de UF, la
temperatura de la solución de BPE
puede aumentar significativamente.
Dado que el BPE es un complejo de
proteínas de estructura (13
subunidades), es particularmente
importante evitar la exposición
prolongada a altas temperaturas (>
25 ° C). Por lo tanto, se requiere un
control de temperatura cerrado para
evitar la desnaturalización del
producto. Debe enfatizarse que las
operaciones de ultrafiltración con
membranas de polisulfona tienden a
presentar incrustaciones severas
durante el procesamiento de
soluciones de agua que contienen
proteínas [45]. El factor principal que
mejora la adsorción de proteínas en
la superficie de la membrana es la
interacción hidrofóbica entre los
dominios de proteínas y la estructura
de la membrana [45]. En este tenor,
se ha propuesto que se pueden
emplear modificaciones hidrofóbicas
para reducir el ensuciamiento del
flujo y aumentar así la eficiencia de
la operación [46]. Sin embargo, en el
presente estudio estos efectos se
minimizaron ya que se observó el
100% de la recuperación de BPE
mientras se realizaban las técnicas
de ultrafiltración.
La figura 4 muestra la pureza
obtenida después de esta etapa
(carril UF-TP). La subunidad gamma
de BPE representa, en masa, un
pequeño fragmento de la molécula de
BPE total. Por lo tanto, una
visualización clara de esta subunidad
suele ser complicada, incluso si se
usa tinción con plata (Fig. 4). Con
respecto a la banda relacionada con
las subunidades alfa y beta, se puede
ver que su tamaño aparente es
ligeramente mayor que el de los
carriles CL (lisado celular) e IP-P
(gránulo de precipitación
isoeléctrica). Se ha determinado que
el comportamiento de migración de
las subunidades de BPE puede variar
significativamente según la
preparación y las características de
la muestra [47-49]. Los residuos de
PEG y sal de la etapa ATPS pueden
estar presentes en la muestra,
afectando la migración. Estos
residuos, particularmente PEG,
pueden interactuar inespecíficamente
con subunidades BPE, afectando así
su peso molecular aparente [50].
Esto podría explicar por qué se
observa un comportamiento de
migración ligeramente diferente en
las muestras obtenidas después del
fraccionamiento con ATPS. Por su
parte, se determinó la totalidad del
BPE purificado comparando sus
espectros de absorción con los de un
estándar comercial.
3.6. Análisis económico del
proceso propuesto.
El diseño y la implementación de
protocolos eficientes, escalables y
económicamente viables representan
algunos de los principales desafíos
para la ingeniería de bioprocesos. Se
desarrolló un análisis económico del
proceso de ampliación propuesto
para determinar los costos de
producción de BPE altamente
purificado. Las materias primas, los
reactivos y los requisitos de energía
de cada unidad de operación
constituyen los costos primarios
considerados para esta estimación
económica. Debe enfatizarse que los
costos de mano de obra no se
incluyeron ya que se pueden ver
variaciones importantes de acuerdo
con cada sitio geográfico potencial
para la planta piloto.
La Tabla 2 presenta los costos de
materias primas, reactivos y costo laboral, la comercialización y
requerimientos de energía. La energía
requerida para cada operación de la
unidad (kWh) se estimó considerando
el requerimiento neto de energía (W)
de cada operación de la unidad y el
tiempo total de procesamiento. El
costo por kWh se obtuvo de la página
web de la Agencia Mexicana de
Energía (www.cfe.gob.mx) y puede
ajustarse en función del sitio
potencial para la instalación de la
planta piloto.
La Tabla 2 presenta los costos de
materias primas, reactivos y
requerimientos de energía. La energía
requerida para cada operación de la
unidad (kWh) se estimó considerando
el requerimiento neto de energía (W)
de cada operación de la unidad y el
tiempo total de procesamiento. El
costo por kWh se obtuvo de la página
web de la Agencia Mexicana de
Energía (www.cfe.gob.mx) y se puede
ajustar según el sitio potencial para
la instalación de la planta piloto
Considerando las materias primas,
los reactivos y los gastos de energía,
el costo total de producción para BPE
altamente purificado es $ 1.17 USD /
mg de proteína objetivo. Dado que se
informa que el precio de mercado
actual para BPE altamente purificado
comienza desde $ 30 USD / mg [9] y
hasta $ 100–150 USD / mg
(www.prozyme.com,
www.febico.com.tw), se puede
concluir basado en este análisis
aproximado, el proceso de ampliación
propuesto para la producción y
purificación de BPE es realmente
atractivo desde el punto de vista
económico. Debe enfatizarse que los
costos adicionales podrían
considerarse en una plataforma
establecida industrialmente, como el
distribución de productos. Sin
embargo, la economía del proceso no
se vería afectada significativamente,
por lo tanto, tener un proyecto
técnico y económico en la mano. Los
costos de producción con procesos
tradicionales para BPE no se
informan directamente en la El diseño y la implementación de una
literatura. Una investigación estrategia ampliada para
detallada sobre
producción y purificación de B-
Las ficobiliproteínas establecieron ficoeritrina de P. cruentum
que la mayoría de los procesos
fue desarrollado con éxito. Un
empleados en esta área incluyen
proceso práctico que emplea
técnicas de interrupción como
extracción acuosa en dos fases como
maceración manual, sonicación o
técnica de recuperación y
ciclos de congelación-descongelación,
purificación a escala de planta piloto
extracción de proteínas con solventes
demostró mejorar la concentración y
orgánicos, precipitación de PEG y / o
pureza general de proteínas. Además,
purificación adicional con etapas
la caracterización de un molino de
cromatográficas [9]. Como se discutió
bolas para la disrupción celular de P.
anteriormente, estas técnicas de
cruentum constituye una adición
interrupción no se pueden ampliar
importante a esta investigación, ya
fácilmente y el uso de
que las condiciones de operación
Los solventes orgánicos para la pueden ampliarse fácilmente y
extracción de productos no se transferirse a otros sistemas de
consideran amigables [9,39]. En expresión similares.
términos de purificación, Rosa et al.
En términos de economía de
[51] presentó una comparación
procesos, la estrategia propuesta es
económica de un bioproceso
económicamente atractiva ya que
tradicional para la purificación de
toda su operación, incluidos los
proteínas (en particular, anticuerpos
reactivos y los gastos de energía,
monoclonales) basado en técnicas
representan un costo total de
cromatográficas de vanguardia y
producción de $ 1.17 USD / mg de
estrategias ATPS. Los autores
BPE altamente purificado. Está claro
concluyeron, basándose en la
que puede buscarse una mejora
escalabilidad, los costos anuales de
adicional en el rendimiento del
las materias primas, los costos de
proceso, como ejemplo, la producción
operación, la integración de procesos
de biomasa de P. cruentum puede
y las inversiones en equipos, que un
optimizarse en fotobiorreactores
bioproceso basado en ATPS podría
tubulares o estanques abiertos junto
suponer un 10-15% menos de capital
con enfoques de biología molecular.
requerido para la operación en
En términos de clarificación de
comparación con una estrategia
efluentes, podrían involucrarse
tradicional basada en cromatografía.
operaciones de microfiltración en
Considerando esta información, el
lugar de pasos de centrifugación para
bioproceso propuesto para la
reducir los gastos de energía y
producción y purificación de BPE
mantenimiento. Para ATPS, se deben
presentado aquí podría suponer
estudiar las geometrías mejoradas de
ventajas económicas en comparación
los tanques, ya que si esta estrategia
con las estrategias tradicionales.
se empleara a niveles industriales, se
4. Conclusiones preferirían tiempos de formación de
fase óptimos para reducir el tiempo
de operación del proceso. A pesar de
estas recomendaciones, teniendo en
cuenta que el BPE obtenido en este
proceso cumple con los estándares
de pureza establecidos para los
estándares de biología molecular, se
puede concluir que los hallazgos
informados aquí destacan el
potencial del proyecto propuesto para
la producción comercial y la
purificación de BPE de origen de
microalgas. Se demuestra la
ampliación de un prototipo de
proceso basado en ATPS