AISLAMIENTO DE MIELINA

LABORATORIO Y TRABAJO DE CAMPO III

CATALINA BASALDUA

OBJETIVOS
Extracción y cuantificación de proteínas básicas de mielina presentes en un tejido cerebral del
sistema nervioso central, a partir de técnicas de centrifugación para su observación y análisis.

INTRODUCCION
La centrifugación es una técnica de separación que se utiliza para aislar o concentrar partículas
suspendidas en un liquido aprovechando la diferente velocidad de desplazamiento según su forma,
tamaño o peso al ser sometidas a una fuerza centrífuga. La fuerza centrifuga es la que se ejerce
sobre un cuerpo cuando esta gira alrededor de un eje. Puede acelerar el proceso de sedimentación
de partículas que tienen tendencia a hacerlo espontáneamente, como también en aquellas que
tienden a flotar.
La fuerza centrifuga o fuerza g (RCF) es la cantidad de aceleración que se aplicara a la muestra,
dependiendo de las revoluciones por minuto (rpm) y del radio del rotor.
Hay rotores basculantes donde los tubos están vertical en posición de parada y, al momento del
giro, se posicionan horizontalmente. En cambio, los rotores de ángulo fijo, los tubos se posicionan
en un ángulo de 45° con una leve inclinación.
Las centrifugas suelen venir en diferentes presentaciones, algunas de ellas son:
- Centrifugas de sobremesa: son de tamaño reducido, sin refrigeración. Alcanzan
velocidades máximas de 4000-5000 rpm. Utilizadas en separación de partículas grandes
(células, plasma, suero).
- Mini centrifuga: similares a las de sobremesa. Alcanzan los 10000 rpm. Se usan en biología
molecular.
- Centrifugas de alta velocidad: alcanzan los 18000 y 25000 rpm. Cuentan con sistema de
vacío para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire. Se utilizan
en la separación de fracciones celulares.
- Ultracentrífugas: superan los 50000 rpm. Tienen sistemas auxiliares de refrigeración para
la cámara del rotor y el motor. Alcanzan un alto nivel de vacío, generando 600.000 g, apto
para separar proteínas pequeñas.
La centrifugación preparativa se utiliza para separar partículas según diferentes factores que se
relacionan con el tipo de centrifugación a trabajar:
- Centrifugación diferencial: según el tamaño y la velocidad de sedimentación, que depende
de la masa y la forma, se obtiene sobrenadante y material sedimentado o pallet. El
componente más rápido se localizará en el fondo del tubo y el mas lento, mas cerca de la
superficie. Se utiliza un rotor angular. Aplicado en tipos celulares, orgánulos, etc.
Existen dos tipos de centrifugación mediante gradientes de densidades:

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 - Centrifugación zonal: la muestra a analizar se deposita en la parte superior de un
gradiente de densidades previamente formado. A causa de la fuerza centrífuga las
partículas se mueven a velocidades que dependen de la masa y sedimentan en diferentes
zonas del gradiente. Se detiene la centrifugación antes de alcanzar el equilibrio. Se usa el
rotor basculante. Se aplica para separación de macromoléculas, orgánulos, etc.
- Centrifugación isopicnica: separa las partículas en un gradiente de densidades en función
de la densidad de las mismas. Se llega a un punto donde la densidad de las partículas y de
la del gradiente son idénticas. Por lo que la densidad máxima del gradiente final debe
exceder la de las particular. Se utiliza el rotor basculante. Se usa para separar ácidos
nucleicos u orgánulos celulares.

Mielina
La mielina es un sistema de bicapas fosfolipídicas formadas por esfingofosfolípidos. Se encuentra
en el sistema nervioso, en concreto formando vainas alrededor de los axones de las neuronas en
seres vertebrados y permite la transmisión de los impulsos nerviosos entre distintas partes del
cuerpo gracias a su efecto aislante. La mielina actúa como aislante electroquímico, permitiendo el
transporte saltatorio del impulso nervioso, causando la transmisión rápida del mensaje.
La mielina es de color blanco, por lo que los axones mielinizados de las neuronas forman la materia
blanca. Por otro lado, los cuerpos neuronales, que no están mielinizados, constituyen la materia
gris.

Reactivo
Para realizar el proceso de aislamiento de mielina se utilizo el reactivo de Bradford, el cual de
acuerdo a las instrucciones dadas por el ensayo de proteínas Bio-rad, si se quiere hacer el
procedimiento de microensayo para placas microtiter, el rango lineal del mismo es 8.0 µg/µl a
aproximadamente 80 µg/µl. Por eso se puede afirmar que el reactivo posee un amplio rango de
absorbancia en comparación a otros reactivos, en consecuencia su sensibilidad será mayor.
Además propone medir la absorbancia a 595nm.

PROCEDIMIENTO
El procedimiento total fue realizado en dos días. En el día 1 se realizó lo siguiente:

Preparación del tejido cerebral

Se pesaron 0,4 g de tejido cerebral, el cual se homogenizo con 6 ml de sacarosa 0,32 M obteniendo
el homogenato de cerebro. Por otro lado, en un tubo se cargaron 6 ml de sacarosa 0,88 M para
rotor SW41 Ti. Se formo un gradiente entre el colchón de sacarosa 0,88 M y los 6 ml del
homogenato de cerebro. Se equilibraron los tubos con sacarosa 0,32 M y se cargaron en un rotor
SW41 Ti para centrifugar por 1 hora a 23.700 rpm (70.000 G). Se utilizo la centrifugación zonal en la
cual se obtiene un gradiente preformado discontinuo para varias soluciones.
Luego, para recuperar la capa media, se retiro con una pipeta automática la capa superior. Y se
trasvaso a un falcon de 15 ml llevándolo a 12 ml con agua.
Se guardo en freezer de -70 grados.
Luego, en el día 2 se continuo de la siguiente manera:

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Formación del pellet
Se descongelaron los tubos en agua caliente hasta estar completamente líquidos. Se trasvasaron a
tubos de UCF y, con una balanza, se llevo a 12 ml. Se centrifugo en un rotor SW41 Ti durante 20’ a
17.700 rpm (25.000 G) para que se forme un pellet. El cual, descartando el sobrenadante, se
resuspendio en 5 ml de sacarosa 0,32 M.
En un tubo (rotor SW41 Ti) se cargaron 6 ml de sacarosa 0,88 M y se formo un gradiente con el
volumen total de mielina resuspendida. Se equilibraron los tubos en balanza con sacarosa 0,32 M.
se cargaron en un rotor SW41 Ti y se centrifugo 35’ a 36.000 rpm.
Se recupero la capa media y se trasvaso a un tubo nuevo agregándole agua fría hasta 12 ml.
Se volvió a centrifugar en un rotor SW41 Ti 20 min a 17.700 RPM (25.000 G). Se descarto el
sobrenadante dejando el pellet resuspendido en 5 ml de agua. Nuevamente, se centrifugo en un
rotor SW41 Ti 20 min a 17.700 RPM (25.000 G) y se descartó el sobrenadante. Se resuspendio el
pellet en 1 ml de agua destilada.

Cuantificación de proteínas
Para la cuantificación de proteínas se utilizo el reactivo de Bradford. Se llevo a cabo la realización
de muestras patrón para realizar una curva de calibración. En mi caso, realizamos las soluciones de
los tubos 1,0 y 1,5. Además de las dos muestras de mielina. Se realizo mediante los datos de la
siguiente tabla:

Concentración de BSA (μg/μl)

Reactivo Bco 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 5,0
160
Agua μl 160 μl 160 μl 160 μl 160 μl 160 μl 160 μl 160 μl
BSA (1 mg/ml) 0 μl 0,5 μl 1,0 μl 1,5 μl 2,0 μl 3 μl 4 μl 5 μl
Rvo de Bradford 5X 40 μl 40 μl 40 μl 40 μl 40 μl 40 μl 40 μl 40 μl
Incubar en agitación 5 min
Leer absorbancia a 595 nm
Para preparar las soluciones 1,0 y 1,5 tomamos los datos tales como se muestran en la tabla y los
colocamos en la gradilla del espectrofotómetro.
En el caso de la preparación de las muestras, se realizaron diluciones para que entren en el rango
de absorbancia que indica la curva (informados por Bio-Rad).
Para una de las muestras realizamos una dilución 1/5, llamándola T9. Donde se agregaron 128 ul de
agua a 32 ul de muestra. La cantidad de reactivo de Bradford se mantuvo en 40 ul.
Para la otra muestra, denominada T10, se realizó una dilución 1/10. Agregando 144 ul de agua en
16 ul de muestra, también con 40 ul de reactivo de Bradford.
Una vez listos los 8 tubos con las muestras de mielina, se incubo en agitación durante 5’ y se llevó
al espectrofotómetro con lectura de absorbancia a 595 nm.

RESULTADOS EXPERIMENTALES
Los resultados del espectrofotómetro a simple vista fueron los siguientes:

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Tubo 1,0: 3D
Tubo 1,5:4D
Tubo 9: 4F
Tubo 10: 5F

Los resultados que se obtuvieron de absorbancia del espectrofotómetro fueron los siguientes:

En base a los resultados obtenidos, se realizo la siguiente curva de calibración:

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 Curva de calibracion
1
0.9 f(x) = 23.153216374269 x + 0.22387134502924
0.8 R² = 0.951661630762573
0.7
Absorbancia

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035
Concentracion (mg/ml)

A partir de la ecuación de la curva, calculamos las concentraciones de las muestras incógnitas:

Para la muestra T9:
0,953 = 23,153x + 0,2239  x = 0,0315 mg/mL
Para la muestra T10:
0,678 = 23,153x + 0,2239  x = 0,0196 mg/mL
Luego, asumiendo que toda la mielina del tejido se encuentra en la muestra, se calculó la masa de
mielina obtenida en gramos, para luego averiguar el contenido de mielina por gramo de tejido:
Para la muestra T9:
0,0315 mg . 1 mL . 1/5 = 6,3x10^(-3) mg
6,3x10^(-3) mg / 400 mg = 1,57x10^(-5) mg
Para la muestra T10:
0,0196 mg . 1 mL . 1/10 = 1,96x10^(-3) mg
1,96x10^(-3) mg / 400 mg = 4,9x10^(-6) mg

Por otro lado, evaluamos los valores de absorbancias medidas en el espectrofotómetro. El plástico
vacío tenía 0,049 de absorbancia, mientras que el tubo blanco obtuvo 0,248. Significa entonces que
a los demás valores obtenidos se les debe restar 0,248 que corresponde a 0,049 del plástico y 0,199
del tubo blanco. Si bien luego de realizar los cálculos y construir una nueva curva de calibración, los
valores de la R fueron idénticos, lo cual tiene sentido ya que el restarle el blanco y el plástico no
influye en el valor final de la concentración.
Adjunto hoja de calculo Excel:

Continuando con las muestras incógnitas, se les calculo su concentración y fueron separadas de
acuerdo a sus características, como sustancia gris y sustancia blanca. A partir de allí, se construyo

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un grafico de columnas el cual se ve reflejado el valor de la media y el desvío estándar. También
puede verse mínimos y máximos, como la normalidad.
Adjunto hoja de Prisma:

CONCLUSIONES
En el caso de las muestras que nos tocaron en mi grupo, ambos valores de absorbancia fueron
encontrados en la curva de calibración, tanto el tubo T9 como el T10. Las diluciones fueron
realizadas correctamente.
Como nos toco trabajar con materia blanca esperábamos niveles más altos de concentración ya
que, la materia blanca es mucho mas concentrada que la materia gris. Esta falta de concentración
se debe a que, al momento de realizar la extracción de materia blanca, no se disponía de mucha
cantidad por lo que debimos mezclarla con materia gris para llegar a la masa solicitada en el
protocolo. De igual manera, nuestras soluciones para construir la curva fueron correctas ya que se
pudo evaluar las concentraciones solicitadas.
Además, de acuerdo al grafico realizado por Prisma, se encontró mayor concentración de mielina
en la sustancia blanca que en la gris con una media de 25,31 y 3,51 respectivamente. Lo cual tiene
sentido, ya que de acuerdo a la hipótesis planteada al principio del ensayo se informó la
composición de ambas sustancias.
En cuanto a su Normalidad, los valores también son correctos con 48,0 para la sustancia blanca y
60,4 para la sustancia gris, ya que como su definición lo dice, hay mayor cantidad de soluto por litro
de solución en la sustancia blanca que en la gris.
Para finalizar, se puede afirmar entonces que, si bien no hay grandes diferencias de absorbancia
entre ambas sustancias, se comprobó mayor concentración en la sustancia blanca contra la
sustancia gris, en consecuencia hay mayor cantidad de mielina. Lo cual era lo que se esperaba de
tal experimento.

OBSERVACIONES Y COMENTARIOS
Para las muestras incógnitas que nos correspondió evaluar, se le realizó una dilución de 1/5, para el
tubo T9, donde se podría haber diluido aún más ya que la diferencia entre el límite superior y la
muestra de absorbancia fue de -0,047. De tal forma que una dilución 1/6 hubiese sido útil.
En cuanto a la muestra T10, la dilución de 1/10 fue realizada correctamente ya que entro en los
rangos deseados de absorbancia en la curva, asemejándose al tubo 1,5, con una absorbancia de
0,678.
Según la lectura realizada por el espectrofotómetro, los resultados no fueron del todo los
esperados. El tubo vacío, es decir, solo el plástico, arrojo un valor de 0,046 de absorbancia. El tubo
blanco expreso un valor de 0,248 abs. Por lo tanto, para los demás valores se les debe restar los
0,046 del plástico y los 0,202 del tubo blanco.

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Una vez planteado dicho patrón, se observó que tanto el tubo 0,5 y 1,0 arrojaron valores muy
similares, casi idénticos, al tubo blanco. 0,261 y 0,267 respectivamente. Esto se debe a un problema
de sensibilidad en el método de reactivo utilizado. Según el protocolo dado por Bio-Rad, el rango
lineal para medir concentración en microensayo para placas microtitles es de 8 a 80 µg/µl. En este
caso, el limite inferior de Bradford debe ser mayor al limite inferior de la curva de calibración
propia. Por lo cual, las concentraciones menores a 8 µg/µl no pueden ser medidas, de manera que
las absorbancias de los tubos 0,5 y 1,0 no fueron medidas correctamente. Por consiguiente, la
solución debe ser cambiar el reactivo y utilizar uno con mayor sensibilidad, con un mayor rango de
absorbancia.

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