CAJA DE HERRAMIENTAS DE

DIAGNÓSTICO

2021

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 APUNTE SOBRE TECNICAS DE LABORATORIO

Objetivo del apunte:

 Conocer las partes del microscopio óptico y aprender a enfocar un preparado.
• Resumir los procesos de preparación de tejidos previos a la observación por microscopía
óptica.
• Definir los procedimientos de tinción de agentes bacterianos y fúngicos
• Definir los procedimientos para el estudio de virus.

Sección 1. Microscopia óptica

Objetivo de la sección
• Aprender a utilizar correctamente el microscopio óptico

1) Observen el microscopio óptico y completen el siguiente esquema colocando en cada caso cual es el
nombre del objeto señalado. Se pueden ayudar observando el video ‘Cómo se maneja el sistema óptico
del microscopio compuesto’.

NORMAS PARA EL USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1.-Quitar la funda protectora del microscopio.
2.-Enchufar/encender el microscopio.

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3.-Colocar en primera instancia el objetivo de menor aumento para lograr un enfoque correcto. Este
paso en muy importante y se debe realizar siempre, ya que permitirá la observación de una
panorámica del preparado y la ubicación de áreas de interés para su análisis posterior.
4.-Subir el condensador utilizando el tornillo correspondiente.
5.-Colocar el preparado sobre la platina, con el cubre-objetos hacia arriba y sujetándola con las
pinzas/guías.
6.-Enfoque el preparado mirando a través del ocular y lentamente mueva el tornillo macrométrico.
7.-Recorra todo el preparado y haga sus observaciones. Elija el sitio donde debe seguir observando
a mayor aumento.
8.-Cambie al objetivo de mediano aumento (10 X) y para lograr el enfoque siga moviendo
lentamente el tormillo macrométrico. Al cambiar de objetivo, la imagen debe estar ligeramente
enfocada gracias a que la mayoría de microscopios son parafocales, es decir, una vez logrado el
primer enfoque, al pasar al objetivo de aumento inmediato superior la imagen queda en un foco
aproximado y solo se debe realizar un ajuste.
9.-Realice la observación y haga sus anotaciones. Determine cuál es la estructura que va a observar
a mayor aumento y colóquela en el centro del campo.
10.-Cambie al objetivo de mayor aumento. Si realizó el enfoque de manera correcta con el objetivo
anterior, al colocar el objetivo de mayor aumento la imagen solo se debe enfocar girando única y
lentamente el tornillo MICROMÉTRICO.
NUNCA se debe utilizar el tornillo macrométrico con los objetivos de mayor aumento, pues al estar
éste muy cerca del preparado, se corre el riesgo de partirlo.
11.-Al lograr el enfoque con el objetivo de mayor aumento debe realizar la observación moviendo
constantemente el tornillo micrométrico para variar los planos de enfoque. De igual manera, abra o
cierre el diafragma para regular la intensidad de la luz y mejorar el contraste. Haga sus
observaciones.
12.-Una vez finalizada la observación, aleje la platina y coloque nuevamente el objetivo de menor
aumento

Sección 2. Técnica de estudio histológico

Objetivos de la sección

• Conocer las distintas técnicas de trabajo con tejidos

¿Qué es una técnica histológica y para qué sirve?

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La técnica histológica es la serie de pasos ordenados que permiten preparar al tejido para su
observación a través del microscopio. El tejido se prepara para su observación de acuerdo con el
tipo de microscopio que será utilizado. En el caso de la microscopía de campo claro, la técnica más
común para preparar las muestras es la técnica histológica ordinaria o de inclusión en parafina. En
este proceso, las muestras se infiltran en parafina, con el fin de que tengan la consistencia adecuada
para obtener los bloques con las muestras o especímenes. Una vez que se tienen los bloques
(inclusión), éstos se cortan en un equipo que se llama micrótomo y con el que se obtienen cortes
muy delgados (micrómetros de espesor) lo que permite observar las estructuras celulares y
tisulares. Un paso más allá que ofrece la información más detallada corresponde al momento de
aplicar la tinción, que da colores a la muestra y gracias a ello es posible identificar diversas
estructuras mediante la observación de estas preparaciones con el microscopio de campo claro.

Recordemos que las muestras que son objeto de esta técnica, proceden de:

❖ Biopsia: La muestra se obtiene de un paciente vivo.

❖ Necropsia: La muestra se obtiene de un cadáver.
❖ Primer paso: La fijación (tejidos muertos por procedimientos que producen la menor
distorsión posible de las células y de la matriz extracelular). Se apunta a conservar la estructura
celular. La fijación, en general obtenida mediante el empleo de sustancias químicas individuales o
mezclas de estas sustancias, conserva la estructura del tejido en forma permanente para permitir el
tratamiento ulterior. Las muestras tienen que sumergirse en el fijador inmediatamente después de
extraerse del organismo.

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 La fijación se utiliza para abolir el metabolismo celular, impedir la degradación enzimática
de las células y los tejidos por autólisis (autodigestión), destruir los microorganismos patógenos
como las bacterias, los hongos o los virus y endurecer el tejido como consecuencia de la formación
de enlaces cruzados o la desnaturalización de las moléculas proteicas.El fijador de uso más común
es la formalina, una solución acuosa de formaldehído al 37%, en diluciones variadas y en
combinación con otras sustancias químicas y amortiguadores (buffers). El formaldehído preserva la
estructura general de la célula y de los componentes extracelulares al reaccionar con los grupos
amino de las proteínas (con mucha frecuencia forma enlaces cruzados entre residuos de lisina).
Dado que el formaldehído no altera en forma significativa su estructura tridimensional, las
proteínas mantienen su capacidad de reaccionar con anticuerpos específicos.

Otra posibilidad es en esta etapa el empleo de Nitrógeno líquido para crio-congelar los
tejidos. Este procedimiento vuelve al tejido rígido y susceptible de ser cortado sin necesidad de
recurrir a la inclusión en parafina. El taco de tejido deberá luego ser cortado por un aparato
especial denominado Criostato.

❖ Segundo paso: Inclusión con el fin de permitir su corte en materiales dotados de cierta
consistencia (ej. Parafina) Para poder examinar la muestra hay que infiltrarla con un medio de
inclusión que permita realizar cortes muy delgados, típicamente de 5 a 15 μm . Luego de la fijación
la muestra se lava y se deshidrata en una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente
hasta alcanzar alcohol al 100%.

En el paso siguiente, el aclarado, se utilizan solventes orgánicos como xileno o tolueno, que
son miscibles tanto en alcohol como en parafina, para extraer el alcohol al 100% antes de la
infiltración de la muestra con parafina fundida. Cuando la parafina fundida se ha enfriado y
endurecido se empareja para formar un bloque de tamaño adecuado. Este bloque, llamado taco, se
coloca entonces en una máquina cortadora especial, el micrótomo, que lo corta en rebanadas finas
con una cuchilla de acero. Luego los cortes obtenidos se montan sobre portaobjetos de vidrio a los
que antes se les habrá añadido una pequeña cantidad de albúmina para que sirva de adhesivo.

❖ Tercer paso Coloración: Se tiñen los tejidos para permitir su examen. Dado que los cortes
en parafina son incoloros, la muestra todavía no está lista para su examen bajo el microscopio
óptico. Para colorear o teñir los cortes histológicos la parafina debe disolverse y extraerse, de nuevo
con xileno o tolueno, y los tejidos deben rehidratarse mediante el uso de una serie de alcoholes de
concentración decreciente. Luego el tejido colocado sobre los portaobjetos se tiñe con hematoxilina
en agua. Como el colorante de contraste, eosina, es más soluble en alcohol que en agua, se vuelve a
deshidratar la muestra en soluciones alcohólicas de concentración creciente y después se tiñe con

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eosina en alcohol. Luego de la coloración la muestra se hace pasar por xileno o tolueno y se le
coloca un medio de montaje no acuoso antes de cubrirla con un cubreobjetos para lograr un
preparado permanente.

 Técnica de coloración con hematoxilina y eosina

Son los colorantes de uso más frecuente en la histología. Un colorante ácido, como la eosina,
tiene una carga neta negativa en su parte coloreada y se describe con la fórmula general (Na+
anilina−). Un colorante básico tiene una carga neta positiva en su parte coloreada y se describe con
la fórmula general (anilina+Cl−). Desde el punto de vista estructural la hematoxilina no es un
colorante básico, pero tiene propiedades tintoriales muy semejantes a las de las anilinas
básicas. Los colorantes básicos reaccionan con los componentes aniónicos de las células y los
tejidos (componentes que tienen una carga neta negativa). Entre los componentes aniónicos se
encuentran los grupos fosfato de los ácidos nucleicos, los grupos sulfato de los
glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de las proteínas. La reacción de los grupos aniónicos
varía según el pH.

Los colorantes ácidos reaccionan con los grupos catiónicos de las células y los tejidos, en
particular con los grupos amino ionizados de las proteínas. La reacción de los grupos catiónicos con
un colorante ácido recibe el nombre de acidofilia (lat. acidus + gr. philein, amar, o sea que tiene
afinidad por lo ácido). Las reacciones de los componentes celulares e hísticos con los colorantes
ácidos no son tan específicas ni tan precisas como las reacciones con los colorantes básicos.

 Técnica de coloración May-Grünwald

Materiales:

 Porta objetos
 Cubre objetos
 Tubo de ensayo con sangre anti coagulada
 Guantes de látex
 Metanol
 Gotero con solución May-Grünwald
 Gotero con agua

Para tinción de Frotis de sangre: Esparcir el material sanguíneo que le suministre el docente de
modo que quede distribuido uniformemente en una delgada capa. Para ello se utiliza otro

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portaobjetos de borde muy parejo que se desliza sobre el primero desde un extremo al opuesto. Se
procede del siguiente modo:

1. Se coloca una gota de sangre sobre un extremo del portaobjetos limpio y seco.

2. Se apoya sobre la gota un borde del otro portaobjetos formando un ángulo agudo.

3. Cuando la gota se extienda por capilaridad a todo el ancho del portaobjetos, se desliza hacia
el otro extremo con un movimiento suave, rápido y uniforme.

Fijación: El primer paso es fijar las células sanguíneas presentes en el frotis.

La fijación la hace el metanol. Para fijar se colocan los vidrios con los frotis
horizontalmente en una parrilla o en una caja de coloración y se vierten unas
20 gotas de solución sobre cada uno hasta que los frotis queden
completamente cubiertos. Se mantienen así durante 2 o 3 minutos para que el
metanol fije las células.

Tinción con May-Grünwald-Giemsa: Para ésta técnica se utilizan las

siguientes soluciones:

• La solución de May-Grünwald, que contiene eosina (como colorante

aniónico) y azul de metileno (como colorante catiónico) disueltos en metanol.

• La solución de Giemsa, que contiene eosina, azul de metileno y

productos de la oxidación del azul de metileno (azur A, azur B, violeta de
metilo y azul de metilo). Los colorantes aniónicos se van a unir a las sustancias catiónicas (básicas)
y los colorantes catiónicos a las sustancias aniónicas (ácidas) formando sales insolubles de
diferentes matices de coloración. La tinción se realiza de la siguiente forma:

• Comprobar que el extendido se encuentre seco.

• Colocar varias gotas de la solución de May Grünwald cubriendo todo el preparado y dejar
actuar durante 2 ó 3 minutos. Si se te ha terminado la solución de May Grünwald la puedes
reemplazar por alcohol medicinal obteniendo un resultado similar.

• Lavar con abundante agua estabilizada (agua destilada con pH de 7) eliminando toda la
solución anterior, y dejar el preparado bien cubierto de agua durante 1 minuto.

• Colocar aproximadamente 12 gotas de Giemsa sobre el extendido cubierto de agua se puede

soplar sobre el extendido para homogeneizar. Dejar actuar la solución durante 10 ó 15 minutos.

• Lavar con abundante agua removiendo el colorante remanente y luego dejar secar.

Sección 3 Coloraciones disponibles para es estudio de Bacterias y Hongos

Objetivos de la sección
• Conocer las distintas técnicas de tinción para agentes microbiológicos

El examen de las muestras debe iniciarse con la inspección visual ordinaria y proceder al examen
microscópico para visualizar el patógeno o determinar la ausencia del mismo. Las muestras pueden
prepararse de diferentes formas para hacer a los microorganismos más fácilmente visibles y
mostrar sus características estructurales. Las suspensiones en fresco permiten valorar algunos
elementos, como motilidad bacteriana, recuento de leucocitos, detección de parásitos o protozoos o
visualización de estructuras fúngicas; por otra parte, las tinciones microbiológicas permiten
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observar a los microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener, o no,
determinados colorantes.
Las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos, siendo las más usadas las tinciones
diferenciales, que permiten distinguir a los microorganismos por alguna de sus características
tintoriales.

Métodos de tinción de bacterias

 Tinción de Gram. ¿Qué es y para qué sirve?

Es de gran importancia en Microbiología, ya que permite hacer diferenciaciones taxonómicas,

separando dos grandes grupos de bacterias (gram-positivas, de color violeta azulado, y gram-
negativas, de color rojo-rosado), según se comporten ante esta tinción.

Esta técnica es, casi siempre, la primera prueba que se lleva a cabo en la identificación de un
microorganismo causante de una enfermedad, aislado de un paciente. Con sólo un microscopio y un
par de colorante podemos averiguar si un organismo es Gram positivo o Gram negativo, su
morfología celular y su agrupación típica. Esto, a veces, es suficiente para determinar con qué tipo
de bacteria estamos trabajando. El tratamiento de una infección depende de que el agente sea Gram
positivo o Gram negativo, ya que algunos antibióticos actúan sólo sobre los primeros, y otros sobre
los segundos. La penicilina, por ejemplo, es más efectiva contra bacterias Gram positivas; mientras
que la estreptomicina y la tetraciclina actúan sobre ambas.

Las bacterias se tiñen diferencialmente por diferencias físicas y químicas en sus paredes celulares.
Estas paredes en las Gram + son gruesas y químicamente simples, compuestas principalmente de
proteínas y mucopeptidos (peptidoglicano o mureína). El alcohol causa la deshidratación de la
pared celular Gram+ reduciendo la perdida de sustancias tales como el cristal violeta. La pared en
las Gram – es fina y compleja conteniendo proteínas, mucopeptidos y lípidos. Cuando es tratada con
alcohol se disuelven los lípidos y la coloración primaria es eliminada. Si la integridad de la pared
celular está dañada o si se decolora en exceso pueden aparecer Gram – las Gram +.

Materiales

- Ansa - Solución fisiológica estéril (SFE)

- Portaobjetos de vidrio - Guantes
- Colorantes para tinción de Gram - Colonias de bacterias
- Aceite de inmersión

Procedimiento

 Colocarse los guantes. Encender el mechero y quemar el ansa hasta que ésta se torne roja.
Dejarla enfriar y tocar con la misma una de las colonias de la placa.
 Colocar una gota de (suero fetal estéril) SFE sobre un portaobjetos y extender la colonia sobre
el portaobjetos. Volver a quemar el ansa en el mechero.
 Fijar el extendido a la llama pasándolo lentamente por la llama, con el preparado hacia arriba
3 veces
 Teñir por el método de Gram (Figura 3)

a) Cubrir la preparación con la solución de cristal violeta. Dejar actuar 2 minutos.

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 b) Lavar con agua y cubrir la preparación con la solución de Lugol. Dejar actuar durante 2
minutos.
c) Decolorar manteniendo inclinado el preparado y vertiendo sobre él la solución del
decolorante. Este es el paso más delicado de la coloración. Se debe mantener goteando
despacio sobre la preparación hasta que no arrastre más colorante.
d) Lavar de inmediato con agua y cubrir con la solución de safranina. Dejar actuar durante 1
minuto.
e) Lavar con bastante agua y dejar escurrir en posición vertical. Puede también secarse entre
dos hojas de papel de filtro

Figura. Procedimiento de tinción Gram de bacterias.

 Tinción ácido-alcohol resistente (Ziehl-Neelsen) ¿qué es y para qué sirve?

Actualmente se utiliza una modificación de la técnica de Ehrlich que recibe el nombre de tinción de
Ziehl-Neelsen. Esta tinción sirve para teñir micobacterias y otras bacterias ácido-alcohol resistente.
Estas bacterias poseen en su pared celular lípidos de ácidos grasos complejos que forman un
material de tipo céreo resistente a la decoloración por una mezcla de ácido y alcohol, si han sido
previamente teñidos con fucsina fenicada.

Las bacterias del género Mycobacterium como M. tuberculosis, causante de la tuberculosis y M.

leprae, causante de la lepra, se identifican mediante esta tinción. El resto de las bacterias se tiñen de
azul por el colorante de contraste.

Procedimiento

Los microorganismos se tiñen con carbolfucsina básica y resisten a la descoloración con soluciones
de ácido-alcohol. Se realiza contratinción del fondo con azul de metileno. Los microorganismos
aparecen de color rojo sobre un fondo azul claro. La captación de carbolfucsina precisa el
calentamiento de la muestra (tinción acidorresistente caliente).

Métodos de tinción de hongos

 La tinción argéntica (Grocott) ¿qué es y para qué sirve?

Esta tinción muestra mayor sensibilidad para la detección de hongos y otros microorganismos
en tejidos preparados en secciones de parafina. La tinción de Grocott es probablemente la más
conocida para la tinción de organismos micóticos. Los hongos son en general relativamente grandes
y morfológicamente diversos, y pueden presentarse en los tejidos en diversas formas: como hifas,
esporas, levaduras, endosporas, o una combinación de estas formas.

El Nitrato plata-metenamina de Gomori y el ácido crómico constituyen los principales reactivos

utilizados en la tinción de Grocott , recalcando que es el nitrato de plata el que actúa como
colorante, dotándoles de un color negro mate o brillante a las estructuras fúngicas.

9
 Procedimiento

El paso inicial de la tinción Grocott utiliza el ácido crómico como un agente fijador y oxidante.
En el primer paso el ácido crómico produce la oxidación de los grupos hidroxilos a aldehídos a
partir de componentes mucopolisacáridos de la pared celular de los hongos. Después de ser
tratadas con ácido crómico en los tejidos se emplea la solución de nitrato-plata, en este caso los
aldehídos reaccionan con la mezcla de nitrato-plata para producir un depósito de color negro, es
decir, una reacción argentafin. Las estructuras de los hongos que se tiñen de negro pueden ser:
micelios con hifas, esporas, y estructuras reproductivas como ascos. Cuando se usa un colorante de
contraste de solución de color verde claro, los elementos fúngicos se tiñen de color negro con
márgenes afilados y un centro aclarado, en un fondo de tejido de color verde claro.
Los resultados de la Tinción Grocott son basados en la descripción del “AFIP” utilizado en el
laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital de Especialidades Eugenio Espejo (2015).
Hongos…………………………………………………………………….…….Claramente delineados de color negro
Mucina…………………………………………………………………………..gris oscuro Micelios
hifas…………………………………………………..…………………………..rosado grisáceo
Fondo………………………………………………………………………..……verde

 Tinción con tinta china (carbon coloidal) ¿qué es y para qué sirve?
Esta tinción se usa principalmente para detectar Cryptococcus neoformans y otros hongos
encapsulados en una suspensión de células (por ej. en una suspensión de líquido cefalorraquídeo
LCR).

Procedimiento

Se añade tinta china a la suspensión de células. La cápsula polisacárida del género Cryptococcus
excluye la tinta, lo que crea un halo alrededor de la célula de la levadura. Se observa el fondo del
campo teñido, en lugar del microorganismo en sí mismo. En el LCR, la prueba no es tan sensible
como la detección de antígenos del criptococo. La especificidad también es limitada; los leucocitos
pueden parecer encapsulados.

 Tinción PAS (ácido peryódico de Schiff) ¿qué es y para qué sirve?

La tinción ácido peryódico de Schiff (PAS) es una de las técnicas de tinción especial más
comúnmente realizada en el laboratorio de histopatología, que se utiliza para poner de relieve las
moléculas con alto porcentaje de contenido de carbohidratos tales como mucina, glucógeno,
microorganismos micóticos, parasitarios y para delimitar la membrana basal en la piel y en otros
tejidos.

Procedimiento

La reacción de la técnica de PAS se basa en la demostración de monosacáridos y glucógeno. La

primera reacción en la tinción implica la acción del ácido peryódico como agente oxidante para
oxidar los enlaces carbono-carbono entre dos grupos hidroxilo adyacente. Se liberan grupos
aldehído que se detectan por el reactivo de Schiff. En la segunda reacción, la sección de tejido
reacciona con el reactivo de Schiff. Éste comprende una mezcla de fucsina básica, ácido clorhídrico,
y meta-bisulfito de sodio dando como resultado un ácido inestable que es incoloro, y en la presencia
de los aldehídos adquiere un color Púrpura.

A continuación la Hematoxilina se utiliza típicamente como una tinción de contraste para visualizar
otros elementos en el tejido. En ésta tinción se demuestra compuestos como los mucopolisacáridos
y glucógeno para delimitar las membranas basales y poder evidenciar a la mayoría de parásitos y
hongos.
10
Los resultados de la Tinción PAS son basados en la descripción del “AFIP” utilizado en el del
laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital de Especialidades Eugenio Espejo

Las mucinas el glucógeno y membranas basales………………….......rojo a purpura

Hongos………………………………………………………………………….……………rojo a purpura
Núcleos………………………………………………………………………..….…………azul

Sección 4. Introducción a la Serología

Objetivos de la sección:
 Comprender los fundamentos de las principales técnicas serológicas de interacción
primaria y secundaria utilizadas en diagnóstico clínico.
 Comprender el valor de la inmunohistoquímica y reconocer las células marcadas con
anticuerpos.

Fundamentación

La respuesta inmune específica difiere de otros mecanismos de defensa en que realiza la

identificación altamente específica del invasor (Antígeno) a través de estructuras de la superficie de
un tipo especial de glóbulos blancos, los linfocitos. Cuando los linfocitos responsables de la
respuesta inmune son los linfocitos B se dice que la respuesta inmune en humoral. En cambio, si los
linfocitos responsables son los linfocitos T la respuesta inmune es celular. Dos propiedades
distinguen la inmunidad específica o adaptativa de las defensas no específicas: la especificidad y la
memoria. Las sustancias extrañas que inducen inmunidad se denominan Antígenos y las partes de
estas moléculas (generalmente proteínas o polisacáridos), activan específicamente a las células del
sistema inmunitario. Según sus características el antígeno estimula diferentes poblaciones de
linfocitos lo que hace que se desarrollen mecanismos apropiados que conducen al a eliminación del
agresor. La memoria se refiere a que el primer contacto del sistema inmune con un Antígeno
origina una respuesta primaria la que no solo lleva a la eliminación del patógeno a través de la
elaboración de Anticuerpos, sino que provoca la diferenciación de células pre adaptadas a un
nuevo contacto con el mismo antígeno.

La serología es la ciencia que estudia la detección de Anticuerpos (Ac). En la figura 1 se

observa un esquema de la estructura de los anticuerpos y en la figura 2, esquemas de los distintos
isotipos de anticuerpos.

Figura 1: Estructura general de Figura 2: Esquema de la estructura de

los anticuerpos los distintos isotipo de anticuerpos

11
 Figura 3: El suero contiene anticuerpos dirigidos contra los
diferentes epítopes.

Los Ac son elaborados por las células plasmáticas en respuesta

a la estimulación producida por una molécula extraña para el
organismo llamada antígeno (Ag). Estos Ag se hallan en las
bacterias, los virus, parásitos, hongos, partículas del polvo
ambiental, células eucarióticas, etc. Los Ag poseen sitios de
unión (epítopes o determinantes antigénicos) a los cuales se
unen los Ac en forma específica. El número de epítopes
constituye la valencia del Ag (Figura 3).

Anticuerpos monoclonales: ¿qué son, cómo se producen y para qué sirven?

Los anticuerpos generados en un animal por inmunización activa, (natural o artificial), son
heterogéneos ya que tienen diferentes especificidades y afinidades. Proceden de distintos clones de
linfocitos B estimulados, por lo que constituyen un conjunto policlonal de anticuerpos. Esta
respuesta policlonal representa una ventaja adaptativa, permitiendo disponer de Ac capaces de
unirse a una gran variedad de antígenos, de expresar diferentes funciones biológicas y de
evolucionar adaptándose al curso de la respuesta inmunitaria. Para algunos usos, sin embargo, la
heterogeneidad de los Ac de un suero puede ser una desventaja. Estas desventajas pueden ser
salvadas por los anticuerpos monoclonales, que, como su nombre lo indica, derivan de un único
clon de linfocitos B y son por lo tanto específicos para un epitope determinado e idénticos entre sí,
constituyendo una población homogénea.

G. Köhler y C. Milstein desarrollaron en 1975 un método para su preparación, que se basa

en la fusión de un linfocito B normal con una célula plasmática tumoral (célula de mieloma). La
célula híbrida resultante (llamada hibridoma) hereda de la célula de mieloma la capacidad de
crecer indefinidamente in vitro, y del linfocito B la de secretar anticuerpos.

Figura 4: Método desarrollado

por Köhler y C. Milstein para
producir anticuerpos
monoclonales.
Entre las aplicaciones clínicas más
importantes de los anticuerpos
monoclonales podemos mencionar:

 Investigación
 Diagnóstico de
enfermedades
 Estudios de
histocompatibilidad
 Detección de antígenos
tumorales
 Fines terapéuticos

12
Las pruebas serológicas pueden clasificarse en dos categorías principales: de interacción
primaria y de interacción secundaria.

 Pruebas de interacción primaria: Detectan la unión directa entre un Ag y un Ac, es decir la

formación del complejo inmune. Estas pruebas pueden ser utilizadas para detectar tanto Ag
como Ac. Uno de los dos componentes (Ag o Ac) está adsorbido (inmovilizado, fijado) en una
fase sólida, como por ejemplo un portaobjetos conteniendo tejidos o células, o una membrana
de nitrocelulosa; y el otro reactivo está "marcado" para facilitar la detección del
inmunocomplejo formado. Luego de producida la interacción entre el Ag y el Ac (para lo cual se
incuba determinado tiempo), se separara el reactivo marcado libre (en exceso) de aquel que
está formando parte de los inmunocomplejos fijos a la fase sólida, para lo cual se realizan
sucesivos lavados. El "marcado" del Ag o del Ac se realiza mediante la unión covalente con
elementos que emiten una señal característica y observable. A este reactivo (Ag o Ac) marcado
se lo denomina conjugado. Las sustancias marcadoras más comúnmente utilizadas para la
fabricación de conjugados son isótopos radiactivos, enzimas o colorantes fluorescentes; siendo
la señal emitida detectada mediante contadores de radiactividad, a simple vista y/o con
espectrofotómetros, fluorocitómetro y/o microscopio de fluorescencia, respectivamente. En
algunas de estas pruebas se utilizan los anticuerpos anti-inmunoglobulinas.

Entre las pruebas de interacción primaria  Inmunocromatografía

más utilizadas en el diagnóstico de
 Western blot
enfermedades se encuentran:
 Citometría de Flujo
 Inmunofluorescencia (IF)

 Inmunohistoquímica e
Inmunocitoquímica

 Enzimoinmunoensayo (EIA):
ELISA (Enzyme linked
immunosorbent assay),

Técnica Marcador del conjugado Lectura de la prueba

Microscopio de
Inmunofluorescencia Fluorocromo
fluorescencia

Espectrofotómetro o a
ELISA
simple vista.
EIA
Enzima Microscopio óptico
Inmunohistoquímica

Microscopio óptico
Inmunocitoquímica

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 Inmunocromatografía Nanopartículas coloreadas A simple vista

Tabla: Marcadores utilizados en algunas de las pruebas de interacción primaria más importantes

y los equipos utilizados para la lectura o visualización de los resultados.

 Pruebas de interacción secundaria: Detectan la consecuencia de la unión Ag-Ac que se

observa como un aglutinado o precipitado de acuerdo a las características físicas del Ag
(particulado o soluble).

 Aglutinación

 Precipitación

Estas pruebas comprenden dos etapas. En la primera se

forman rápidamente los complejos Ag-Ac (complejos
primarios), los cuales no pueden observarse
directamente. Luego, en la segunda etapa o reacción
secundaria, los complejos se van agregando hasta
hacerse visibles como precipitado o aglutinado. Las
uniones entre los complejos primarios dan origen a
estructuras tridimensionales en forma de red. Es
importante que los reactivos estén en proporciones
óptimas, dado que la concentración en exceso tanto del
Ag como del Ac origina complejos solubles (Figura 5).

Figura 5: Curva de precipitación cuantitativa

Cuando los Ac se combinan con Ag solubles (toxinas, proteínas, extractos de pared bacteriana)
en soluciones con condiciones apropiadas, los complejos precipitan (REACCIÓN DE
PRECIPITACIÓN). Si los Ag son particulados (bacterias, eritrocitos) y están en suspensión,
entonces se aglutinan al unirse a los Ac específicos en condiciones adecuadas (REACCIÓN DE
AGLUTINACIÓN).

PRUEBAS DE INTERACCIÓN PRIMARIA

*INMUNOFLUORESCENCIA: ¿qué es y para qué sirve?

Es una técnica utilizada para la detección de Ag y Ac usando reactivos con colorantes fluorescentes,
como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), la rhodamina o la ficoeritrina (PE). Estas sustancias al
ser excitadas con luz de longitud de onda del rango ultravioleta emiten luz visible de longitud de
onda mayor que se observa como una fluorescencia amarillo-verdosa (FITC) o anaranjado-rojiza
(PE y rhodamina). Existen dos variantes de esta técnica: la IF directa y la IF indirecta.

Procedimientos

- Inmunofluorescencia Directa (IFD): En esta técnica se utiliza un Ac marcado con una

sustancia fluorescente para detectar la presencia del Ag en una muestra de tejido o células
o en frotis de cultivos de microorganismos (Figura 6A). La muestra se examina en un
microscopio de fluorescencia con luz azul o verde observándose la fluorescencia generada
por el conjugado en los lugares en que ha quedado unido al Ag de la muestra; el resto del
campo permanece oscuro.
Figura 6A:
Inmunofluorescencia directa

- Inmunofluorescencia indirecta (IFI): Esta variante de la IF utiliza como conjugado un Ac

anti-Ig marcado con sustancias fluorescentes, para detectar la unión entre un Ac no
marcado con su Ag específico (Figura 6B). Luego de los lavados necesarios para la
eliminación del conjugado libre, la muestra se observa con microscopio de fluorescencia.

Figura 6B:
Inmunofluorescencia
indirecta.

CITOMETRÍA DE FLUJO ó FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting): ¿qué es y para qué
sirve?

La citometría de flujo es una técnica que permite analizar ciertas propiedades físicas y químicas de
células o partículas a las que se les ha unido uno o más Ac monoclonales marcados con colorantes
fluorescentes, capaces de reconocer epítopes sobre antígenos de superficie celular (por ejemplo
CD4, CD8 y CD3) (Figura 7).

Procedimiento

Las células o partículas se encuentran en suspensión y fluyen, una a una, frente a un rayo láser. A su
paso frente al rayo, la luz es desviada en un ángulo determinado, el cual es proporcional al tamaño
de esa célula. A su vez, los fluorocromos (colorantes fluorescentes) de los anticuerpos unidos a la
célula son activados por la luz del rayo láser, emitiendo fluorescencia, que es colectada por
sensores, filtrada y almacenada en una computadora.
 Figura 7: Esquema del funcionamiento del
citómetro de flujo y gráficos de resultados.

Los resultados obtenidos de este análisis pueden graficarse de diferentes formas, entre ellas en
forma de histograma y en forma de diagrama de puntos. En el histograma se representa la cantidad
de células con una alta intensidad de fluorescencia (curva verde) debida a la unión del conjugado
con moléculas de la superficie celular comparada con una población control negativa (curva negra).
En el ejemplo presentado para el diagrama de puntos se analizan, mediante el uso de dos
conjugados (Ac anti CD8 marcados con Phicoeritrina (PE), y Ac anti CD4 marcados con fluoresceína
(FITC), las subpoblaciones de linfocitos T colaboradores (CD4+), citolíticos (CD8+) e inmaduros
(CD4+CD8+) de una suspensión de timocitos.

ENZIMOINMUNOENSAYO (EIA): ¿qué es y para qué sirve?

El enzimoinmunoensayo es una técnica muy sensible, que puede utilizarse para detectar y medir en
una muestra tanto Ag como Ac. Los conjugados que se emplean tienen como marcadores a diversas
enzimas. Las enzimas más utilizadas son la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y la ß-galactosidasa.
Esta técnica recibe diferentes nombres de acuerdo al soporte sobre el que se realiza: cuando es en
placa se denomina ELISA; sobre tejidos, inmunohistoquímica y sobre células, inmunocitoquímica.

ELISA (en placa): Existen muchas variantes del ELISA y su diseño depende de lo que se quiera
determinar. La más utilizada es el ELISA indirecto que se usa para determinar la presencia de Ac en
una muestra problema, utilizando como conjugado un Ac anti-Ig marcado con una enzima.

Procedimiento

La prueba se realiza en placas de plástico (poliestireno) de 8 cm x 12 cm que contienen 96 pocillos,

cada uno de aprox. 1 cm de profundidad y 0,7 cm
de diámetro (Figura 8).

Figura 8: Placa de ELISA de 96 pocillos.

En cada pocillo se sembrará la muestra problema y luego se agregará el conjugado marcado con la
enzima. Para detectar la presencia del conjugado, se agrega a la reacción un sustrato específico de
dicha enzima y un cromógeno que permita observar la acción de la enzima sobre su sustrato. Si
luego de la reacción inmunológica y de los posteriores lavados, el reactivo marcado permanece
unido a la fase sólida, al agregar la mezcla de sustrato-cromógeno la enzima actuará sobre su
sustrato, modificándolo, y este producto inducirá un cambio de color en el cromógeno soluble
sobrenadante (Figura 8). La intensidad de color es directamente proporcional a la cantidad de anti-
Ig marcada que se haya captado, y ésta a su vez será proporcional a la cantidad de Ac que se
encuentren en la muestra problema. La intensidad de color se puede estimar a simple vista
(cualitativo), o lo que es más adecuado, mediante espectrofotometría, expresándose como densidad
óptica.

Figura 9: ELISA
indirecto.

Inmunohistoquímica (IHQ) e inmunocitoquímica (ICQ): Cuando el enzimoinmunoensayo se

realiza sobre tejidos o células, hablamos de inmunohistoquímica e inmunocitoquímica,
respectivamente. Estas pruebas se realizan sobre cortes de tejido de un modo similar a las IF,
pudiendo ser directas o indirectas. En este caso, el conjugado es una inmunoglobulina marcada con
una enzima que al actuar sobre su sustrato, lo modifica, y este producto induce un cambio en el
cromógeno, convirtiéndolo en un producto de reacción coloreado. Esta prueba se lee con
microscopio de luz observándose una reacción positiva como un precipitado de color sobre las
estructuras histológicas o las células que contengan el Ag buscado (Figura 10).

Figura 10: Esquema de

una técnica de
hinmunohistoquímica
INMUNOCROMATOGRAFÍA: ¿qué es y para qué sirve?

Es un tipo de prueba de interacción primaria que se utiliza para detectar antígenos o anticuerpos en
una muestra problema a través de ensayos sencillos y de lectura rápida sobre una membrana de
nylon o nitrocelulosa (tiras reactivas). En esta prueba los componentes embebidos en la membrana
están marcados con nanopartículas coloreadas, por ejemplo con metales pesados (oro o selenio
coloidal) generando bandas de color rosa o azul respectivamente.

Procedimiento

En las tiras reactivas se pueden distinguir 5 zonas:

1. Zona de siembra de la muestra

2. Zona del conjugado

3. Zona de detección

4. Zona de control

5. Región absorbente

El procedimiento es muy sencillo: la muestra con el Ag a analizar se coloca en la zona de siembra, y

fluye por capilaridad hasta la zona del conjugado, en donde el Ac específico marcado (conjugado) se
encuentra inmovilizado. Al pasar la muestra solubiliza al conjugado, y en caso de haber Ag en la
muestra forma inmunocomplejos. Estos inmunocomplejos formados siguen migrando lateralmente
hasta la zona de detección, en la cual se hallan fijados a la membrana Acs específicos contra otro
epítope del Ag, de manera que los inmunocomplejos son fijados en esta zona de detección,
formando una banda coloreada, rosa o azul dependiendo del metal utilizado en el conjugado. La
muestra fluye por capilaridad hasta la zona de control. Aquí el exceso de conjugado es capturado
por un Ac anti-conjugado, formándose una banda coloreada tanto si el Ag está presente en la
muestra como si no lo está. Este control indica que la prueba ha sido realizada correctamente y
todos los reactivos funcionan bien. Finalmente el resto de la muestra es absorbida en la región
absorbente (Figura 11). Esta prueba puede ser utilizada también para la detección de Ac. En este
caso, el conjugado es el Ag específico marcado. Una de sus aplicaciones en medicina humana se basa
en la utilización del test para detectar la gonadotrofina coriónica (test de embarazo).
Figura 11: Esquema de una prueba de inmunocromatografía para detección de antígeno.

En la parte superior se esquematiza la prueba positiva, dando una banda en la zona de detección y
una segunda banda en la zona de control. En la parte inferior, se esquematiza la prueba negativa,
donde sólo se observa reacción en la zona de control.

PRUEBAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA

# PRUEBAS DE AGLUTINACION: ¿qué son y para qué sirven?

Son pruebas de interacción secundaria Ag-Ac que indican que estos elementos están presentes en la
reacción en proporciones óptimas, a través de la formación de aglutinado o grumos (reacción
positiva). Se pueden leer a simple vista o a bajo aumento (microscopio óptico o lupa). La figura 13
muestra un esquema de los resultados obtenidos en dos pruebas de aglutinación en tubo. La
primera (Figura 13a) se realizó con suero del primer muestreo de un animal, ensayando las
diluciones 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640. Se ve que la reacción es positiva sólo en los 2
primeros tubos (1/20 y 1/40). La segunda prueba (Figura 13b), realizada con suero de un
muestreo del mismo animal a los 40 días del primero, muestra reacción positiva hasta una dilución
1/320. Esto indica que hubo seroconversión (conversión serológica), ya que el título del suero en el
primer muestreo fue 40 y en el segundo fue 320. El título de un suero se expresa como la inversa de
la máxima dilución del suero que dio reacción positiva.

Figura 13a: Aglutinación en tubo. Reacción positiva en diluciones 1/20 y 1/40.

Figura 13b: Aglutinación en tubo. Reacción positiva en diluciones 1/20 a 1/320.

Aplicaciones:

Diagnóstico serológico de enfermedades infecciosas.

Identificación de serotipos bacterianos.

Tipificaciones de sueros sanguíneos (para determinación de grupos sanguíneos).

 Sección 5. Técnicas de diagnóstico parasitológico

Técnicas coproparasitológicas: ¿qué son y para qué sirven?

Son un conjunto de técnicas qué se emplean en el laboratorio para identificar la presencia de

distintos estadios biológicos de parásitos, como huevos o quistes, etc. que afectan el sistema
digestivo y por lo tanto se encuentran en la materia fecal. Las muestras de materia fecal
generalmente se recolectan en soluciones conservantes y se pueden observar directamente al
microscopio óptico o se utilizan procedimientos de concentración para facilitar la detección de los
parásitos. Estas técnicas se emplean para detectar quistes de protozoos como Giardia lamblia,
Entamoeba histolytica, Cryptosporidium parvum, etc. y huevos de helmintos como Ascaris
lumbricoides, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Taenia sp., Enterovius vermicularis,
Fasciola hepática, etc.

TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN

La aplicación de métodos de concentración permite examinar una mayor cantidad de heces en

menor volumen y de esa manera aumentar la probabilidad de detectar estructuras parasitarias que
estén presentes. Los métodos pueden ser de flotación o sedimentación.

En los métodos de flotación, las muestras fecales se mezclan con una solución de alta densidad de
modo tal que las estructuras parasitarias floten y puedan recogerse de la superficie. En los métodos
de sedimentación, las muestras se mezclan con soluciones de baja densidad y utilizando la fuerza
centrífuga, las estructuras parasitarias quedarán concentradas en el pellet (material depositado en
el fondo del tubo).

Procedimientos

- Método de Telemann Modificado (sedimentación)

Materiales: Solución salina formolada al 5%, gasas, embudos, tubos de centrífuga cónicos (tipo
Falcon 15 ml), pipetas Pasteur, portaobjetos, cubreobjetos, varillas de vidrio, éter, solución de
Lugol.

1. Homogeneizar con varilla de vidrio las heces fijadas en solución formolada.

2. Filtrar 2 ml a través de un embudo con una doble gasa en tubo de centrífuga.
3. Agregar 8 ml de solución formolada y homogeneizar. Centrifugar a 35000 rpm durante 5
minutos.
4. Eliminar con golpe seco el sobrenadante.
5. Resuspender el pellet con 8 ml de solución formolada y volver a centrifugar. Repetir este paso
hasta que la columna de sobrenadante quede más limpia.
6. Eliminar el sobrenadante. Agregar a 2 ml de éter y 6 ml de solución formolada. Agitar
vigorosamente durante unos minutos.
7. Centrifugar nuevamente a 3500 rpm 5 minuntos.
8. Volcar el sobrenadante. Tomar con pipeta Pasteur una pequeña cantidad del sedimento y colocar
en portaobjetos.
9. Agregar una gota de lugol y sellar con un cubreobjetos. Observar al microscopio óptico.

- Método de Sheather modificada (Flotación en azúcar)

Materiales: Tubo de centrífuga, embudos, gasas, varilla de vidrio, solución de Sheather, solución
salina formolada al 5%, pipetas Pasteur, portaobjetos, cubreobjetos.
1. Homogenizar con varilla de vidrio las heces fijadas en solución formolada.
2. Filtrar 2 ml a través de un embudo con una doble gasa en tubo de centrifuga.
3. Agregar 8 ml de solución formolada y homogeneizar.
4. Centrifugar a 3500 rpm durante 5 minutos.
5. Eliminar con golpe seco el sobrenadante.
6. Resuspender el sedimento en 8 ml de solución de azúcar y centrifugar a 1500 rpm 5 minutos.
7. Dejar reposar el tubo en posición vertical durante 3 minutos.
8. Tomar una muestra de la superficie de la solución con pipeta pasteur y realizar un preparado
entre portaobjeto y cubreobjetos y recorrer con aumento de 40X.

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS DE LA ZONA PERIANAL

- Test de Graham Garaguso o Método de la Cinta Adhesiva Transparente
Materiales: 5 o 6 portaobjetos con cinta adhesiva transparente (tipo cinta scotch) de 2 cm de ancho
colocada a lo ancho de los mismos; bajalenguas de madera o cuchara de plástico.

1. Realizar la toma de muestra por la mañana al despertar el paciente previo a que defeque o
efectúe su higiene.
2. Despegar la cinta adhesiva transparente del portaobjetos y enrollarla en el extremo del mango de
la cuchara o en el depresor lingual con la parte engomada hacia afuera.
3. Separar las nalgas del paciente y hacer presión con el extremo de la cuchara cubierto con la cinta
en la zona perianal.
4. Colocar nuevamente la cinta con la parte adhesiva sobre el portaobjetos.
5. Repetir esta operación durante 4 o 5 días más con los portaobjetos restantes.
6. Una vez efectuada la recolección enviar las muestras al laboratorio para su examen.
NOTA: Este método de recolección se realiza en pacientes de edad pediátrica.

Examen: se realiza por observación directa de cada uno de los preparados (portaobjetos con cinta
adhesiva transparente de material recolectado en zona perianal) con microscopio óptico y en bajo
aumento (10X) recorriendo todo el preparado.
Si es necesario se puede despegar la cinta adhesiva y colocar 1 gota de aceite de inmersión o NaOH
y colocarla nuevamente (esto mejora la transparencia de la misma) sobre el portaobjeto.

Resultado: esta técnica es específica para el hallazgo de huevos de Enterobius vermiculares,

pudiéndose hallar en algunos casos huevos de Ascaris lumbricoides y Taenia spp.

Técnicas para la identificación de parásitos hemáticos: ¿qué son y para qué sirven?

Son técnicas que permiten recuperar o concentrar parásitos protozoos hemáticos, es decir aquellos
parásitos que en algún momento de su ciclo de vida se encuentran en la sangre debido a que son
transmitidos por vectores que se alimentan de este fluido. Se utilizan para diagnóstico en la etapa
aguda de las infecciones, ya que es el momento en el que se pueden detectar con mayor facilidad los
protozoos en la sangre.

Diagnóstico de Mal de Chagas-Mazza: Trypanosoma cruzi

Las técnicas que se emplean comúnmente son el Strout, Microhematocrito, Microtubo, la Gota
fresca, la Gota gruesa. Estos cuatro últimos son apropiados para emplear en niños y neonatos por el
bajo volumen de sangre que emplean (0.3 ml).

Procedimientos
 - Examen microscópico directo de sangre al fresco: es el método de elección para el
diagnóstico rápido de las formas congénitas. Una gota de sangre recién obtenida, se observa entre
porta y cubreobjetos directamente al microscopio, en búsqueda de las formas tripomastigotes
móviles de T. cruzi. La preparación también puede ser efectuada en una muestra de sangre recibida
con citrato de sodio, anticoagulante útil para recibir sangre de cordón de recién nacido en el cual se
investiga transmisión vertical del parásito.
- Frotis sanguíneo: Esta técnica es un complemento de la anterior, y permite realizar
preparaciones permanentes. Con una gota de sangre se hace un extendido delgado en portaobjetos
que se deja secar a temperatura ambiente. Después se tiñe con colorante May-Grünwald, Giemsa o
de Wright y se observa al microscopio.
- Examen de gota gruesa: Es también un procedimiento indicado en la fase aguda de la
infección y en el cual se examina una mayor cantidad de sangre, lo que aumenta el rendimiento al
comparar el método con el examen microscópico de sangre al fresco. Se colocan tres gotas de
sangre en un portaobjetos y, con una aguja o el vértice de un cubreobjetos, se mezclan las gotas con
movimientos circulares durante 2 a 3 minutos, con el fin de desfibrinar la muestra, después de lo
cual se deja secar a temperatura ambiente. La tinción se realiza utilizando colorante de Giemsa
diluido al 1:10 durante 30 minutos, con lo que se consigue, además de la coloración, la
deshemoglobinización de la muestra, lo cual facilita la observación de las formas tripomastigotes de
T. cruzi.
- Método de Strout: Es una técnica de concentración de los tripomastigotes de T. cruzi.
Consiste en centrifugar sangre citratada por 10 minutos a 1000 rpm. El sobrenadante se centrifuga
a 1500 rpm durante 10 minutos y, finalmente, el último sobrenadante se centrifuga a 2500 rpm por
el mismo tiempo. El sedimento final se examina al fresco o en un frotis teñido con Giemsa.
- Método de microhematócrito o microstrout: Se utiliza sangre venosa total o suero que se
recoge en capilares de microhematócrito heparinizados. Se tapa con masilla al extremo inferior y se
centrifuga a 1000 rpm durante tres minutos. Se fractura al capilar en el límite de la capa
leucocitaria. Se deposita la capa de leucocitos y plasma sobre un portaobjetos; se recorre y revisa
en forma cuidadosa la preparación al microscopio. Es necesario realizar al menos tres
microhematócritos por paciente. Es un método para uso especialmente en la fase final de la etapa
aguda, cuando los parásitos ya no son tan abundantes en la sangre.

Diagnóstico de Paludismo/Malaria: Plasmodium vivax, P. falciparum, P. ovale

Procedimiento: Los parásitos del paludismo pueden identificarse al examinar al microscopio una
gota de sangre del paciente, extendida como un “frotis de sangre” sobre una laminilla de
microscopio. Antes del examen, se tiñe el espécimen (más a menudo con la tinción de Giemsa) para
dar a los parásitos un aspecto distintivo. Esta técnica persiste como el estándar para la
confirmación de laboratorio de paludismo. Sin embargo, depende de la calidad de los reactivos, del
microscopio, y de la experiencia del laboratorista.

Técnicas para la identificación de parásitos tisulares: ¿qué son y para qué sirven?

Son técnicas que buscan demostrar la presencia de parásitos protozoos como Leishmania sp.
(leishmaniasis visceral y tegumentaria) mediante la observación directa del líquido aspirado de
ganglios linfáticos y bazo, o biopsia de piel, previa coloración de Giemsa; o a través de cultivos in
vitro, ya sea en medios NNN, Schneider o RPMI, los que tienen una sensibilidad superior a la
búsqueda directa.