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DIAGNÓSTICO
2021
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APUNTE SOBRE TECNICAS DE LABORATORIO
Objetivo de la sección
• Aprender a utilizar correctamente el microscopio óptico
1) Observen el microscopio óptico y completen el siguiente esquema colocando en cada caso cual es el
nombre del objeto señalado. Se pueden ayudar observando el video ‘Cómo se maneja el sistema óptico
del microscopio compuesto’.
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3.-Colocar en primera instancia el objetivo de menor aumento para lograr un enfoque correcto. Este
paso en muy importante y se debe realizar siempre, ya que permitirá la observación de una
panorámica del preparado y la ubicación de áreas de interés para su análisis posterior.
4.-Subir el condensador utilizando el tornillo correspondiente.
5.-Colocar el preparado sobre la platina, con el cubre-objetos hacia arriba y sujetándola con las
pinzas/guías.
6.-Enfoque el preparado mirando a través del ocular y lentamente mueva el tornillo macrométrico.
7.-Recorra todo el preparado y haga sus observaciones. Elija el sitio donde debe seguir observando
a mayor aumento.
8.-Cambie al objetivo de mediano aumento (10 X) y para lograr el enfoque siga moviendo
lentamente el tormillo macrométrico. Al cambiar de objetivo, la imagen debe estar ligeramente
enfocada gracias a que la mayoría de microscopios son parafocales, es decir, una vez logrado el
primer enfoque, al pasar al objetivo de aumento inmediato superior la imagen queda en un foco
aproximado y solo se debe realizar un ajuste.
9.-Realice la observación y haga sus anotaciones. Determine cuál es la estructura que va a observar
a mayor aumento y colóquela en el centro del campo.
10.-Cambie al objetivo de mayor aumento. Si realizó el enfoque de manera correcta con el objetivo
anterior, al colocar el objetivo de mayor aumento la imagen solo se debe enfocar girando única y
lentamente el tornillo MICROMÉTRICO.
NUNCA se debe utilizar el tornillo macrométrico con los objetivos de mayor aumento, pues al estar
éste muy cerca del preparado, se corre el riesgo de partirlo.
11.-Al lograr el enfoque con el objetivo de mayor aumento debe realizar la observación moviendo
constantemente el tornillo micrométrico para variar los planos de enfoque. De igual manera, abra o
cierre el diafragma para regular la intensidad de la luz y mejorar el contraste. Haga sus
observaciones.
12.-Una vez finalizada la observación, aleje la platina y coloque nuevamente el objetivo de menor
aumento
Objetivos de la sección
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La técnica histológica es la serie de pasos ordenados que permiten preparar al tejido para su
observación a través del microscopio. El tejido se prepara para su observación de acuerdo con el
tipo de microscopio que será utilizado. En el caso de la microscopía de campo claro, la técnica más
común para preparar las muestras es la técnica histológica ordinaria o de inclusión en parafina. En
este proceso, las muestras se infiltran en parafina, con el fin de que tengan la consistencia adecuada
para obtener los bloques con las muestras o especímenes. Una vez que se tienen los bloques
(inclusión), éstos se cortan en un equipo que se llama micrótomo y con el que se obtienen cortes
muy delgados (micrómetros de espesor) lo que permite observar las estructuras celulares y
tisulares. Un paso más allá que ofrece la información más detallada corresponde al momento de
aplicar la tinción, que da colores a la muestra y gracias a ello es posible identificar diversas
estructuras mediante la observación de estas preparaciones con el microscopio de campo claro.
Recordemos que las muestras que son objeto de esta técnica, proceden de:
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La fijación se utiliza para abolir el metabolismo celular, impedir la degradación enzimática
de las células y los tejidos por autólisis (autodigestión), destruir los microorganismos patógenos
como las bacterias, los hongos o los virus y endurecer el tejido como consecuencia de la formación
de enlaces cruzados o la desnaturalización de las moléculas proteicas.El fijador de uso más común
es la formalina, una solución acuosa de formaldehído al 37%, en diluciones variadas y en
combinación con otras sustancias químicas y amortiguadores (buffers). El formaldehído preserva la
estructura general de la célula y de los componentes extracelulares al reaccionar con los grupos
amino de las proteínas (con mucha frecuencia forma enlaces cruzados entre residuos de lisina).
Dado que el formaldehído no altera en forma significativa su estructura tridimensional, las
proteínas mantienen su capacidad de reaccionar con anticuerpos específicos.
Otra posibilidad es en esta etapa el empleo de Nitrógeno líquido para crio-congelar los
tejidos. Este procedimiento vuelve al tejido rígido y susceptible de ser cortado sin necesidad de
recurrir a la inclusión en parafina. El taco de tejido deberá luego ser cortado por un aparato
especial denominado Criostato.
❖ Segundo paso: Inclusión con el fin de permitir su corte en materiales dotados de cierta
consistencia (ej. Parafina) Para poder examinar la muestra hay que infiltrarla con un medio de
inclusión que permita realizar cortes muy delgados, típicamente de 5 a 15 μm . Luego de la fijación
la muestra se lava y se deshidrata en una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente
hasta alcanzar alcohol al 100%.
En el paso siguiente, el aclarado, se utilizan solventes orgánicos como xileno o tolueno, que
son miscibles tanto en alcohol como en parafina, para extraer el alcohol al 100% antes de la
infiltración de la muestra con parafina fundida. Cuando la parafina fundida se ha enfriado y
endurecido se empareja para formar un bloque de tamaño adecuado. Este bloque, llamado taco, se
coloca entonces en una máquina cortadora especial, el micrótomo, que lo corta en rebanadas finas
con una cuchilla de acero. Luego los cortes obtenidos se montan sobre portaobjetos de vidrio a los
que antes se les habrá añadido una pequeña cantidad de albúmina para que sirva de adhesivo.
❖ Tercer paso Coloración: Se tiñen los tejidos para permitir su examen. Dado que los cortes
en parafina son incoloros, la muestra todavía no está lista para su examen bajo el microscopio
óptico. Para colorear o teñir los cortes histológicos la parafina debe disolverse y extraerse, de nuevo
con xileno o tolueno, y los tejidos deben rehidratarse mediante el uso de una serie de alcoholes de
concentración decreciente. Luego el tejido colocado sobre los portaobjetos se tiñe con hematoxilina
en agua. Como el colorante de contraste, eosina, es más soluble en alcohol que en agua, se vuelve a
deshidratar la muestra en soluciones alcohólicas de concentración creciente y después se tiñe con
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eosina en alcohol. Luego de la coloración la muestra se hace pasar por xileno o tolueno y se le
coloca un medio de montaje no acuoso antes de cubrirla con un cubreobjetos para lograr un
preparado permanente.
Son los colorantes de uso más frecuente en la histología. Un colorante ácido, como la eosina,
tiene una carga neta negativa en su parte coloreada y se describe con la fórmula general (Na+
anilina−). Un colorante básico tiene una carga neta positiva en su parte coloreada y se describe con
la fórmula general (anilina+Cl−). Desde el punto de vista estructural la hematoxilina no es un
colorante básico, pero tiene propiedades tintoriales muy semejantes a las de las anilinas
básicas. Los colorantes básicos reaccionan con los componentes aniónicos de las células y los
tejidos (componentes que tienen una carga neta negativa). Entre los componentes aniónicos se
encuentran los grupos fosfato de los ácidos nucleicos, los grupos sulfato de los
glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de las proteínas. La reacción de los grupos aniónicos
varía según el pH.
Los colorantes ácidos reaccionan con los grupos catiónicos de las células y los tejidos, en
particular con los grupos amino ionizados de las proteínas. La reacción de los grupos catiónicos con
un colorante ácido recibe el nombre de acidofilia (lat. acidus + gr. philein, amar, o sea que tiene
afinidad por lo ácido). Las reacciones de los componentes celulares e hísticos con los colorantes
ácidos no son tan específicas ni tan precisas como las reacciones con los colorantes básicos.
Porta objetos
Cubre objetos
Tubo de ensayo con sangre anti coagulada
Guantes de látex
Metanol
Gotero con solución May-Grünwald
Gotero con agua
Para tinción de Frotis de sangre: Esparcir el material sanguíneo que le suministre el docente de
modo que quede distribuido uniformemente en una delgada capa. Para ello se utiliza otro
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portaobjetos de borde muy parejo que se desliza sobre el primero desde un extremo al opuesto. Se
procede del siguiente modo:
1. Se coloca una gota de sangre sobre un extremo del portaobjetos limpio y seco.
2. Se apoya sobre la gota un borde del otro portaobjetos formando un ángulo agudo.
3. Cuando la gota se extienda por capilaridad a todo el ancho del portaobjetos, se desliza hacia
el otro extremo con un movimiento suave, rápido y uniforme.
• Colocar varias gotas de la solución de May Grünwald cubriendo todo el preparado y dejar
actuar durante 2 ó 3 minutos. Si se te ha terminado la solución de May Grünwald la puedes
reemplazar por alcohol medicinal obteniendo un resultado similar.
• Lavar con abundante agua estabilizada (agua destilada con pH de 7) eliminando toda la
solución anterior, y dejar el preparado bien cubierto de agua durante 1 minuto.
• Lavar con abundante agua removiendo el colorante remanente y luego dejar secar.
Objetivos de la sección
• Conocer las distintas técnicas de tinción para agentes microbiológicos
El examen de las muestras debe iniciarse con la inspección visual ordinaria y proceder al examen
microscópico para visualizar el patógeno o determinar la ausencia del mismo. Las muestras pueden
prepararse de diferentes formas para hacer a los microorganismos más fácilmente visibles y
mostrar sus características estructurales. Las suspensiones en fresco permiten valorar algunos
elementos, como motilidad bacteriana, recuento de leucocitos, detección de parásitos o protozoos o
visualización de estructuras fúngicas; por otra parte, las tinciones microbiológicas permiten
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observar a los microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener, o no,
determinados colorantes.
Las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos, siendo las más usadas las tinciones
diferenciales, que permiten distinguir a los microorganismos por alguna de sus características
tintoriales.
Esta técnica es, casi siempre, la primera prueba que se lleva a cabo en la identificación de un
microorganismo causante de una enfermedad, aislado de un paciente. Con sólo un microscopio y un
par de colorante podemos averiguar si un organismo es Gram positivo o Gram negativo, su
morfología celular y su agrupación típica. Esto, a veces, es suficiente para determinar con qué tipo
de bacteria estamos trabajando. El tratamiento de una infección depende de que el agente sea Gram
positivo o Gram negativo, ya que algunos antibióticos actúan sólo sobre los primeros, y otros sobre
los segundos. La penicilina, por ejemplo, es más efectiva contra bacterias Gram positivas; mientras
que la estreptomicina y la tetraciclina actúan sobre ambas.
Las bacterias se tiñen diferencialmente por diferencias físicas y químicas en sus paredes celulares.
Estas paredes en las Gram + son gruesas y químicamente simples, compuestas principalmente de
proteínas y mucopeptidos (peptidoglicano o mureína). El alcohol causa la deshidratación de la
pared celular Gram+ reduciendo la perdida de sustancias tales como el cristal violeta. La pared en
las Gram – es fina y compleja conteniendo proteínas, mucopeptidos y lípidos. Cuando es tratada con
alcohol se disuelven los lípidos y la coloración primaria es eliminada. Si la integridad de la pared
celular está dañada o si se decolora en exceso pueden aparecer Gram – las Gram +.
Materiales
Procedimiento
Colocarse los guantes. Encender el mechero y quemar el ansa hasta que ésta se torne roja.
Dejarla enfriar y tocar con la misma una de las colonias de la placa.
Colocar una gota de (suero fetal estéril) SFE sobre un portaobjetos y extender la colonia sobre
el portaobjetos. Volver a quemar el ansa en el mechero.
Fijar el extendido a la llama pasándolo lentamente por la llama, con el preparado hacia arriba
3 veces
Teñir por el método de Gram (Figura 3)
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b) Lavar con agua y cubrir la preparación con la solución de Lugol. Dejar actuar durante 2
minutos.
c) Decolorar manteniendo inclinado el preparado y vertiendo sobre él la solución del
decolorante. Este es el paso más delicado de la coloración. Se debe mantener goteando
despacio sobre la preparación hasta que no arrastre más colorante.
d) Lavar de inmediato con agua y cubrir con la solución de safranina. Dejar actuar durante 1
minuto.
e) Lavar con bastante agua y dejar escurrir en posición vertical. Puede también secarse entre
dos hojas de papel de filtro
Actualmente se utiliza una modificación de la técnica de Ehrlich que recibe el nombre de tinción de
Ziehl-Neelsen. Esta tinción sirve para teñir micobacterias y otras bacterias ácido-alcohol resistente.
Estas bacterias poseen en su pared celular lípidos de ácidos grasos complejos que forman un
material de tipo céreo resistente a la decoloración por una mezcla de ácido y alcohol, si han sido
previamente teñidos con fucsina fenicada.
Procedimiento
Los microorganismos se tiñen con carbolfucsina básica y resisten a la descoloración con soluciones
de ácido-alcohol. Se realiza contratinción del fondo con azul de metileno. Los microorganismos
aparecen de color rojo sobre un fondo azul claro. La captación de carbolfucsina precisa el
calentamiento de la muestra (tinción acidorresistente caliente).
Esta tinción muestra mayor sensibilidad para la detección de hongos y otros microorganismos
en tejidos preparados en secciones de parafina. La tinción de Grocott es probablemente la más
conocida para la tinción de organismos micóticos. Los hongos son en general relativamente grandes
y morfológicamente diversos, y pueden presentarse en los tejidos en diversas formas: como hifas,
esporas, levaduras, endosporas, o una combinación de estas formas.
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Procedimiento
El paso inicial de la tinción Grocott utiliza el ácido crómico como un agente fijador y oxidante.
En el primer paso el ácido crómico produce la oxidación de los grupos hidroxilos a aldehídos a
partir de componentes mucopolisacáridos de la pared celular de los hongos. Después de ser
tratadas con ácido crómico en los tejidos se emplea la solución de nitrato-plata, en este caso los
aldehídos reaccionan con la mezcla de nitrato-plata para producir un depósito de color negro, es
decir, una reacción argentafin. Las estructuras de los hongos que se tiñen de negro pueden ser:
micelios con hifas, esporas, y estructuras reproductivas como ascos. Cuando se usa un colorante de
contraste de solución de color verde claro, los elementos fúngicos se tiñen de color negro con
márgenes afilados y un centro aclarado, en un fondo de tejido de color verde claro.
Los resultados de la Tinción Grocott son basados en la descripción del “AFIP” utilizado en el
laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital de Especialidades Eugenio Espejo (2015).
Hongos…………………………………………………………………….…….Claramente delineados de color negro
Mucina…………………………………………………………………………..gris oscuro Micelios
hifas…………………………………………………..…………………………..rosado grisáceo
Fondo………………………………………………………………………..……verde
Tinción con tinta china (carbon coloidal) ¿qué es y para qué sirve?
Esta tinción se usa principalmente para detectar Cryptococcus neoformans y otros hongos
encapsulados en una suspensión de células (por ej. en una suspensión de líquido cefalorraquídeo
LCR).
Procedimiento
Se añade tinta china a la suspensión de células. La cápsula polisacárida del género Cryptococcus
excluye la tinta, lo que crea un halo alrededor de la célula de la levadura. Se observa el fondo del
campo teñido, en lugar del microorganismo en sí mismo. En el LCR, la prueba no es tan sensible
como la detección de antígenos del criptococo. La especificidad también es limitada; los leucocitos
pueden parecer encapsulados.
La tinción ácido peryódico de Schiff (PAS) es una de las técnicas de tinción especial más
comúnmente realizada en el laboratorio de histopatología, que se utiliza para poner de relieve las
moléculas con alto porcentaje de contenido de carbohidratos tales como mucina, glucógeno,
microorganismos micóticos, parasitarios y para delimitar la membrana basal en la piel y en otros
tejidos.
Procedimiento
A continuación la Hematoxilina se utiliza típicamente como una tinción de contraste para visualizar
otros elementos en el tejido. En ésta tinción se demuestra compuestos como los mucopolisacáridos
y glucógeno para delimitar las membranas basales y poder evidenciar a la mayoría de parásitos y
hongos.
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Los resultados de la Tinción PAS son basados en la descripción del “AFIP” utilizado en el del
laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital de Especialidades Eugenio Espejo
Fundamentación
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Figura 3: El suero contiene anticuerpos dirigidos contra los
diferentes epítopes.
Los anticuerpos generados en un animal por inmunización activa, (natural o artificial), son
heterogéneos ya que tienen diferentes especificidades y afinidades. Proceden de distintos clones de
linfocitos B estimulados, por lo que constituyen un conjunto policlonal de anticuerpos. Esta
respuesta policlonal representa una ventaja adaptativa, permitiendo disponer de Ac capaces de
unirse a una gran variedad de antígenos, de expresar diferentes funciones biológicas y de
evolucionar adaptándose al curso de la respuesta inmunitaria. Para algunos usos, sin embargo, la
heterogeneidad de los Ac de un suero puede ser una desventaja. Estas desventajas pueden ser
salvadas por los anticuerpos monoclonales, que, como su nombre lo indica, derivan de un único
clon de linfocitos B y son por lo tanto específicos para un epitope determinado e idénticos entre sí,
constituyendo una población homogénea.
Investigación
Diagnóstico de
enfermedades
Estudios de
histocompatibilidad
Detección de antígenos
tumorales
Fines terapéuticos
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Las pruebas serológicas pueden clasificarse en dos categorías principales: de interacción
primaria y de interacción secundaria.
Inmunohistoquímica e
Inmunocitoquímica
Enzimoinmunoensayo (EIA):
ELISA (Enzyme linked
immunosorbent assay),
Microscopio de
Inmunofluorescencia Fluorocromo
fluorescencia
Espectrofotómetro o a
ELISA
simple vista.
EIA
Enzima Microscopio óptico
Inmunohistoquímica
Microscopio óptico
Inmunocitoquímica
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Inmunocromatografía Nanopartículas coloreadas A simple vista
Tabla: Marcadores utilizados en algunas de las pruebas de interacción primaria más importantes
Aglutinación
Precipitación
Cuando los Ac se combinan con Ag solubles (toxinas, proteínas, extractos de pared bacteriana)
en soluciones con condiciones apropiadas, los complejos precipitan (REACCIÓN DE
PRECIPITACIÓN). Si los Ag son particulados (bacterias, eritrocitos) y están en suspensión,
entonces se aglutinan al unirse a los Ac específicos en condiciones adecuadas (REACCIÓN DE
AGLUTINACIÓN).
Es una técnica utilizada para la detección de Ag y Ac usando reactivos con colorantes fluorescentes,
como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), la rhodamina o la ficoeritrina (PE). Estas sustancias al
ser excitadas con luz de longitud de onda del rango ultravioleta emiten luz visible de longitud de
onda mayor que se observa como una fluorescencia amarillo-verdosa (FITC) o anaranjado-rojiza
(PE y rhodamina). Existen dos variantes de esta técnica: la IF directa y la IF indirecta.
Procedimientos
Figura 6B:
Inmunofluorescencia
indirecta.
CITOMETRÍA DE FLUJO ó FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting): ¿qué es y para qué
sirve?
La citometría de flujo es una técnica que permite analizar ciertas propiedades físicas y químicas de
células o partículas a las que se les ha unido uno o más Ac monoclonales marcados con colorantes
fluorescentes, capaces de reconocer epítopes sobre antígenos de superficie celular (por ejemplo
CD4, CD8 y CD3) (Figura 7).
Procedimiento
Las células o partículas se encuentran en suspensión y fluyen, una a una, frente a un rayo láser. A su
paso frente al rayo, la luz es desviada en un ángulo determinado, el cual es proporcional al tamaño
de esa célula. A su vez, los fluorocromos (colorantes fluorescentes) de los anticuerpos unidos a la
célula son activados por la luz del rayo láser, emitiendo fluorescencia, que es colectada por
sensores, filtrada y almacenada en una computadora.
Figura 7: Esquema del funcionamiento del
citómetro de flujo y gráficos de resultados.
Los resultados obtenidos de este análisis pueden graficarse de diferentes formas, entre ellas en
forma de histograma y en forma de diagrama de puntos. En el histograma se representa la cantidad
de células con una alta intensidad de fluorescencia (curva verde) debida a la unión del conjugado
con moléculas de la superficie celular comparada con una población control negativa (curva negra).
En el ejemplo presentado para el diagrama de puntos se analizan, mediante el uso de dos
conjugados (Ac anti CD8 marcados con Phicoeritrina (PE), y Ac anti CD4 marcados con fluoresceína
(FITC), las subpoblaciones de linfocitos T colaboradores (CD4+), citolíticos (CD8+) e inmaduros
(CD4+CD8+) de una suspensión de timocitos.
El enzimoinmunoensayo es una técnica muy sensible, que puede utilizarse para detectar y medir en
una muestra tanto Ag como Ac. Los conjugados que se emplean tienen como marcadores a diversas
enzimas. Las enzimas más utilizadas son la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y la ß-galactosidasa.
Esta técnica recibe diferentes nombres de acuerdo al soporte sobre el que se realiza: cuando es en
placa se denomina ELISA; sobre tejidos, inmunohistoquímica y sobre células, inmunocitoquímica.
ELISA (en placa): Existen muchas variantes del ELISA y su diseño depende de lo que se quiera
determinar. La más utilizada es el ELISA indirecto que se usa para determinar la presencia de Ac en
una muestra problema, utilizando como conjugado un Ac anti-Ig marcado con una enzima.
Procedimiento
Figura 9: ELISA
indirecto.
Es un tipo de prueba de interacción primaria que se utiliza para detectar antígenos o anticuerpos en
una muestra problema a través de ensayos sencillos y de lectura rápida sobre una membrana de
nylon o nitrocelulosa (tiras reactivas). En esta prueba los componentes embebidos en la membrana
están marcados con nanopartículas coloreadas, por ejemplo con metales pesados (oro o selenio
coloidal) generando bandas de color rosa o azul respectivamente.
Procedimiento
3. Zona de detección
4. Zona de control
5. Región absorbente
En la parte superior se esquematiza la prueba positiva, dando una banda en la zona de detección y
una segunda banda en la zona de control. En la parte inferior, se esquematiza la prueba negativa,
donde sólo se observa reacción en la zona de control.
Son pruebas de interacción secundaria Ag-Ac que indican que estos elementos están presentes en la
reacción en proporciones óptimas, a través de la formación de aglutinado o grumos (reacción
positiva). Se pueden leer a simple vista o a bajo aumento (microscopio óptico o lupa). La figura 13
muestra un esquema de los resultados obtenidos en dos pruebas de aglutinación en tubo. La
primera (Figura 13a) se realizó con suero del primer muestreo de un animal, ensayando las
diluciones 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640. Se ve que la reacción es positiva sólo en los 2
primeros tubos (1/20 y 1/40). La segunda prueba (Figura 13b), realizada con suero de un
muestreo del mismo animal a los 40 días del primero, muestra reacción positiva hasta una dilución
1/320. Esto indica que hubo seroconversión (conversión serológica), ya que el título del suero en el
primer muestreo fue 40 y en el segundo fue 320. El título de un suero se expresa como la inversa de
la máxima dilución del suero que dio reacción positiva.
Aplicaciones:
TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN
En los métodos de flotación, las muestras fecales se mezclan con una solución de alta densidad de
modo tal que las estructuras parasitarias floten y puedan recogerse de la superficie. En los métodos
de sedimentación, las muestras se mezclan con soluciones de baja densidad y utilizando la fuerza
centrífuga, las estructuras parasitarias quedarán concentradas en el pellet (material depositado en
el fondo del tubo).
Procedimientos
1. Realizar la toma de muestra por la mañana al despertar el paciente previo a que defeque o
efectúe su higiene.
2. Despegar la cinta adhesiva transparente del portaobjetos y enrollarla en el extremo del mango de
la cuchara o en el depresor lingual con la parte engomada hacia afuera.
3. Separar las nalgas del paciente y hacer presión con el extremo de la cuchara cubierto con la cinta
en la zona perianal.
4. Colocar nuevamente la cinta con la parte adhesiva sobre el portaobjetos.
5. Repetir esta operación durante 4 o 5 días más con los portaobjetos restantes.
6. Una vez efectuada la recolección enviar las muestras al laboratorio para su examen.
NOTA: Este método de recolección se realiza en pacientes de edad pediátrica.
Examen: se realiza por observación directa de cada uno de los preparados (portaobjetos con cinta
adhesiva transparente de material recolectado en zona perianal) con microscopio óptico y en bajo
aumento (10X) recorriendo todo el preparado.
Si es necesario se puede despegar la cinta adhesiva y colocar 1 gota de aceite de inmersión o NaOH
y colocarla nuevamente (esto mejora la transparencia de la misma) sobre el portaobjeto.
Técnicas para la identificación de parásitos hemáticos: ¿qué son y para qué sirven?
Son técnicas que permiten recuperar o concentrar parásitos protozoos hemáticos, es decir aquellos
parásitos que en algún momento de su ciclo de vida se encuentran en la sangre debido a que son
transmitidos por vectores que se alimentan de este fluido. Se utilizan para diagnóstico en la etapa
aguda de las infecciones, ya que es el momento en el que se pueden detectar con mayor facilidad los
protozoos en la sangre.
Las técnicas que se emplean comúnmente son el Strout, Microhematocrito, Microtubo, la Gota
fresca, la Gota gruesa. Estos cuatro últimos son apropiados para emplear en niños y neonatos por el
bajo volumen de sangre que emplean (0.3 ml).
Procedimientos
- Examen microscópico directo de sangre al fresco: es el método de elección para el
diagnóstico rápido de las formas congénitas. Una gota de sangre recién obtenida, se observa entre
porta y cubreobjetos directamente al microscopio, en búsqueda de las formas tripomastigotes
móviles de T. cruzi. La preparación también puede ser efectuada en una muestra de sangre recibida
con citrato de sodio, anticoagulante útil para recibir sangre de cordón de recién nacido en el cual se
investiga transmisión vertical del parásito.
- Frotis sanguíneo: Esta técnica es un complemento de la anterior, y permite realizar
preparaciones permanentes. Con una gota de sangre se hace un extendido delgado en portaobjetos
que se deja secar a temperatura ambiente. Después se tiñe con colorante May-Grünwald, Giemsa o
de Wright y se observa al microscopio.
- Examen de gota gruesa: Es también un procedimiento indicado en la fase aguda de la
infección y en el cual se examina una mayor cantidad de sangre, lo que aumenta el rendimiento al
comparar el método con el examen microscópico de sangre al fresco. Se colocan tres gotas de
sangre en un portaobjetos y, con una aguja o el vértice de un cubreobjetos, se mezclan las gotas con
movimientos circulares durante 2 a 3 minutos, con el fin de desfibrinar la muestra, después de lo
cual se deja secar a temperatura ambiente. La tinción se realiza utilizando colorante de Giemsa
diluido al 1:10 durante 30 minutos, con lo que se consigue, además de la coloración, la
deshemoglobinización de la muestra, lo cual facilita la observación de las formas tripomastigotes de
T. cruzi.
- Método de Strout: Es una técnica de concentración de los tripomastigotes de T. cruzi.
Consiste en centrifugar sangre citratada por 10 minutos a 1000 rpm. El sobrenadante se centrifuga
a 1500 rpm durante 10 minutos y, finalmente, el último sobrenadante se centrifuga a 2500 rpm por
el mismo tiempo. El sedimento final se examina al fresco o en un frotis teñido con Giemsa.
- Método de microhematócrito o microstrout: Se utiliza sangre venosa total o suero que se
recoge en capilares de microhematócrito heparinizados. Se tapa con masilla al extremo inferior y se
centrifuga a 1000 rpm durante tres minutos. Se fractura al capilar en el límite de la capa
leucocitaria. Se deposita la capa de leucocitos y plasma sobre un portaobjetos; se recorre y revisa
en forma cuidadosa la preparación al microscopio. Es necesario realizar al menos tres
microhematócritos por paciente. Es un método para uso especialmente en la fase final de la etapa
aguda, cuando los parásitos ya no son tan abundantes en la sangre.
Técnicas para la identificación de parásitos tisulares: ¿qué son y para qué sirven?
Son técnicas que buscan demostrar la presencia de parásitos protozoos como Leishmania sp.
(leishmaniasis visceral y tegumentaria) mediante la observación directa del líquido aspirado de
ganglios linfáticos y bazo, o biopsia de piel, previa coloración de Giemsa; o a través de cultivos in
vitro, ya sea en medios NNN, Schneider o RPMI, los que tienen una sensibilidad superior a la
búsqueda directa.