PRÁCTICA 0.

CITOLOGÍA E HISTOLOGÍA.
CURSO 2021-2022.

INTRODUCCIÓN A LA MICROSCOPÍA
 OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
1. Comprensión del proceso que se desarrolla
desde que se recogen las muestras de un
animal hasta que se visualizan al microscopio.

2. Adquisición de vocabulario correcto:

basófilo, acidófilo, electrodenso,
adielectrónico….

3. Aprender a utilizar y enfocar el

microscopio óptico compuesto.
 INTRODUCCIÓN A LA
MICROSCOPÍA

1. El microscopio y sus tipos: óptico y electrónico

2. Procedencia de las muestras

3. Preparación de las muestras para microscopía óptica

4. Técnicas de tinción para microscopía óptica

5. Preparación de las muestras para microscopía

electrónica
MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

Un haz de luz visible o haz de

fotones atraviesa la muestra
pasando por un conjunto de lentes
que la amplifican y enfocan.
Imagen en colores:
Reacciones químicas específicas con sustancias que tienen color
propio (colorantes).
 INTRODUCCIÓN A LA
MICROSCOPÍA
Microscopio Electrónico
Fuente de “luz”: haz de electrones
1. Resolución: 1 nm (200 veces mayor que el microscopio óptico)
2. Aumentos: 100.000x (100 veces mayor que el microscopio óptico)
3. Superficie de las muestras: 1 mm2

Tipos
1. De transmisión
- el haz de electrones atraviesa la muestra
- cortes ultrafinos (50-80 nm)
2. De barrido
- el haz de electrones no atraviesa la muestra
- imágenes tridimensionales de superficies (contenido oculto)
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN

1988 versus 2013

Las rejillas contrastadas se
introducen en el microscopio
electrónico, que es un tubo de
rayos catódicos en el que se hace
el vacío por aspiración y en cuyos
extremos hay un cátodo y un
ánodo, entre los que se establece
una diferencia de potencial de 80
Kv. Esta diferencia de potencial
produce un haz de electrones que
se dirigen del cátodo al ánodo.
Estos electrones son acelerados
por distintos campos
electromagnéticos y atraviesan la
muestra en distinta medida
dependiendo de la resistencia que
opongan las diferentes
subestructuras. Los electrones son
detectados y proyectados sobre
una pantalla fluorescente en forma
de imagen en blanco y negro.
Imagen en blanco y negro:
Relación entre la cantidad de electrones que absorbe la muestra
y, posteriormente, alcanzan el detector.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO
Imagen en blanco y negro:
Interacción con capa muy fina de metal (oro) aplicada sobre la
superficie de la muestra.
 INTRODUCCIÓN A LA
MICROSCOPÍA

1. El microscopio y sus tipos: óptico y electrónico

2. Procedencia de las muestras

3. Preparación de las muestras para microscopía óptica

4. Técnicas de tinción para microscopía óptica

5. Preparación de las muestras para microscopía

electrónica
-TEJIDOS OBTENIDOS DE ANIMALES MUERTOS: NECROPSIA (ANIMALES
DE PRODUCCIÓN Y COMPAÑÍA)

-TEJIDOS OBTENIDOS DE ANIMALES VIVOS: BIOPSIA

 INTRODUCCIÓN A LA
MICROSCOPÍA

1. El microscopio y sus tipos: óptico y electrónico

2. Procedencia de las muestras

3. Preparación de las muestras para microscopía

óptica

4. Técnicas de tinción para microscopía óptica

5. Preparación de las muestras para microscopía

electrónica
 INTRODUCCIÓN A LA
MICROSCOPÍA
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA
MICROSCOPÍA ÓPTICA

1 FIJACIÓN: impide autolisis, PRESERVA LA ESTRUCTURA

2. INCLUSIÓN EN PARAFINA: consistencia para poder
hacer cortes de 3-4 mm
3. CORTE: permite que pase la luz
4. TINCIÓN: permite visualización de estructuras
 FIJACIÓN
FORMALDEHIDO AL 10% (penetración 0,5 cm y tiempo mínimo
hasta fijación 24 h). Normalmente fijación por inmersión.

FORMALDEHIDO COMERCIAL SOLUCIÓN DE TRABAJO: FORMALDEHIDO 10%

FIJACIÓN DE TEJIDOS DUROS
1º Fijación en formaldehido al 10%
2º Descalcificación
 INCLUSIÓN
 OBJETIVO: dotar a la muestra de CONSISTENCIA para que pueda
ser cortada con el microtomo.
 Para ello el primer paso es deshidratar la muestra mediante inmersión en
determinados líquidos: se suele utilizar una ESCALA ASCENDENTE
DE ALCOHOLES.
 Posteriormente, esas muestras son sumergidas en XILOL, líquido con
las siguientes características: 1. es totalmente HIDRÓFOBO por lo que
elimina cualquier resquicio de H20 que hubiera en la muestra, 2. tiene
como función ABRIR el intersticio para propiciar la penetración de la
parafina y 3. es, además, SOLVENTE de la parafina.
 Después, procedemos a la introducción gradual de PARAFINA en el
intersticio, de tal manera que la muestra una vez incluida adquiere dureza
lo que permite que el corte sea más fino y lo pueda atravesar la luz.
INCLUSIÓN: ESTACIÓN DE TALLADO

FORMALDEHIDO 10%

Hacer fragmentos seleccionados de 1-2 cm por 3 a 5 mm

INCLUSIÓN: PROCESADOR
AUTOMÁTICO DE TEJIDOS
 REALIZACIÓN DEL BLOQUE
 OBJETIVO: tiene como función que la muestra,
ya incluida en parafina pero que es de 2x3 cm
PUEDA SER MANIPULADA para ser cortada.

 Para ello utilizamos el dispensador de parafina.

 REALIZACIÓN DEL BLOQUE:
DISPENSADOR DE PARAFINA

TANQUE DE PARAFINA A 60ºC

PLACA FRÍA

MOLDES
PARAFINA LÍQUIDA (60ºC)
PLACA FRÍA PARA QUE
SOLIDIFIQUE LA PARAFINA
REALIZACIÓN DEL BLOQUE
 CORTE: MICROTOMÍA
 OBJETIVO: REALIZAR CORTES con el microtomo
y que se depositarán en un baño de agua caliente
que estirará totalmente el corte y que permitirá que
puedan ser recogidos con el portaobjetos.

Los bloques han de estar fríos: 4⁰C

CORTES DE TEJIDO DE MUESTRAS
FIJADAS POR CONGELACIÓN

CRIOTOMO O HISTOCRIOTOMO
 INTRODUCCIÓN A LA
MICROSCOPÍA

1. El microscopio y sus tipos: óptico y electrónico

2. Procedencia de las muestras

3. Preparación de las muestras para microscopía óptica

4. Técnicas de tinción para microscopía óptica

5. Preparación de las muestras para microscopía

electrónica
 TINCIÓN

Objetivos
1.Colorear los tejidos (casi siempre son incoloros)
2.Destacar e identificar los diversos componentes de los
tejidos

Tipos de técnicas
1.Histoquímicas
2.Inmunohistoquímicas (se basan en la reacción
antígeno/anticuerpo para la detección de proteínas en
tejidos).
 TINCIÓN
Técnicas histoquímicas más frecuentes

-Hematoxilina y eosina: la técnica de rutina

- Giemsa
- P.A.S.
- Carmín de Best
- Rojo Congo
- Picrofucsina de Van Giesson
- Grimelius
- Impregnación argéntica
 TINCIÓN
HEMATOXILINA EOSINA
La hematoxilina (de color azul/violeta) es un
colorante básico, por tanto, los componentes
ácidos de la célula (entre ellos los ácidos
nucleicos) tienen tropismo por ella, de manera
que todo lo que aparezca teñido de este color se
denomina basófilo. LOS NÚCLEOS SON
BASÓFILOS.
La eosina (de color rosa) es un colorante ácido,
por tanto, los componentes básicos de la célula
(p.ej., las proteínas) tienen tropismo por ella, de
manera que todo lo que aparezca teñido de este
color se denomina acidófilo o eosinófilo.
TINCIÓN: TEÑIDOR AUTOMÁTICO DE TEJIDOS
TINCIÓN: MONTAJE DE LAS MUESTRAS
(DESHIDRATACIÓN)
TINCIÓN: MONTAJE DE LAS MUESTRAS
(ADHESIÓN DEL CUBREOBJETOS E
IDENTIFICACIÓN DEL PORTAOBJETOS)
TINCIÓN: BANDEJA CON CORTES
HISTOLÓGICOS TEÑIDOS CON
HEMATOXILINA EOSINA
HEMATOXILINA EOSINA
GIEMSA (METACROMASIA)
 TÉCNICA
INMUNOHISTOQUÍMICA
 INTRODUCCIÓN A LA
MICROSCOPÍA

1. El microscopio y sus tipos: óptico y electrónico

2. Procedencia de las muestras

3. Preparación de las muestras para microscopía óptica

4. Técnicas de tinción para microscopía óptica

5. Preparación de las muestras para microscopía

electrónica
FIJACIÓN Y TOMA DE MUESTRAS
Glutaraldehído al 4% (penetra 1mm y tiempo de fijación VARIOS
MINUTOS)
Tetróxido de Osmio al 1%
 INCLUSIÓN
 OBJETIVO: dotar a la muestra de CONSISTENCIA para que pueda
ser cortada con el ultramicrotomo.
 Para ello el primer paso es deshidratar la muestra mediante inmersión en
determinados líquidos: se puede utilizar una ESCALA
ASCENDENTE DE ALCOHOLES O DE ACETONAS.
 Posteriormente, esas muestras son sumergidas en ÓXIDO DE
PROPILENO, líquido con las siguientes características: 1. es
totalmente HIDRÓFOBO por lo que elimina cualquier resquicio de H20
que hubiera en la muestra, 2. tiene como función ABRIR el intersticio
para propiciar la penetración de las epoxirresinas y 3. es, además,
SOLVENTE de las epoxirresinas.
 Después, procedemos a la introducción gradual de EPOXIRRESINAS
en el intersticio, de tal manera que la muestra una vez incluida adquiere
una gran dureza lo que permite que el corte sea más fino.
INCLUSIÓN: DESHIDRATACIÓN
 REALIZACIÓN DEL BLOQUE
 OBJETIVO: tiene como función que la muestra, ya
incluida en epoxirresinas, pero que es de 1 mm3 PUEDA
SER MANIPULADA para ser cortada.

 Para ello la muestra se deposita en cápsulas de plástico,

previamente identificadas, que se rellenan con
epoxirrexinas y se dejan endurecer en la estufa a 60ºC:
48 horas.
REALIZACIÓN DEL BLOQUE
 CORTE: ULTRAMICROTOMÍA
 OBJETIVO: REALIZAR CORTES con el
ultramicrotomo y una cuchilla de diamante que se
depositarán en el pocillo con el que cuenta la
cuchilla.
 El pocillo se llenará de H20 bidestilada.
 Los cortes, que flotarán en el H20, tendrán distinto
color dependiendo del grosor de los mismos. Los de
color verde son semifinos (de unos 900 nm-1µm de
grosor) y los de color dorado y plateado son finos
(de unos 50-80 nm de grosor).
CORTE: ULTRAMICROTOMO Y
CUCHILLA DE DIAMANTE

• FOTO ULTRAMICROTOMO
 ULTRAMICROTOMÍA

CORTES SEMIFINOS
Y FINOS FLOTANDO
EN EL POCILLO DE
LA CUCHILLA DE
DIAMANTE
 ULTRAMICROTOMÍA: CORTES DE
DISTINTOS COLORES, SEGÚN EL GROSOR, FLOTANDO
EN EL POCILLO DE LA CUCHILLA DE DIAMANTE
ULTRAMICROTOMÍA: RECOGIDA DE
MUESTRAS EN REJILLAS DE NÍQUEL
 CONTRASTE
 OBJETIVO: permitir la MEJOR VISUALIZACIÓN de las
subestructuras al microscopio electrónico, dándole
“contraste”.
 Para ello, las muestras son expuestas a metales pesados
(acetato de uranilo y citrato de plomo: colorantes
electrónicos). EN MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA NO SE
TIÑE, SE CONTRASTA.
 Como consecuencia, según sea la composición química de la
subestructura, los metales pesados se depositarán en
distinta medida sobre ella, ligándose a la subestructura, lo
que se traduce en que absorban más o menos electrones y en
el microscopio se visualizarán en negro (electrodenso:
proteínas), en gris (de mediana electrodensidad) y en blanco
(adielectrónico).
CONTRASTE
OBSERVACIÓN

SI LAS CRESTAS DE LAS MITOCONDRIAS

SE VEN BIEN: BUENA FIJACIÓN
MODOS DE UNIÓN
 VIRUS PPA
PRIMERA FOTO REALIZADA CON EL JEOL JEM 1400. MARÍA JOSÉ BAUTISTA PÉREZ
VIRUS DE LA PPA (VIRUS ADN). FAMILIA ASFARVIRIDAE
 PRÁCTICA 0

OBJETIVO 3:

-Aprender a utilizar y enfocar el microscopio

óptico compuesto.
MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

Un haz de luz visible o haz de

fotones atraviesa la muestra
pasando por un conjunto de lentes
que la amplifican y enfocan.
VISUALIZACIÓN DEL ÓRGANO O TEJIDO SEGÚN EL
PLANO DE CORTE
ARTEFACTOS
Precipitado de colorante. Cartílago, perro. En
ocasiones las soluciones de colorante forman
precipitados que se adhieren a la superficie
de corte del tejido.

Artefacto de separación (espacio). Piel,

perro. Durante el procesado los tejidos están
sujetos a presiones excesivas, tensiones,
contracciones, que producen estas
separaciones.

Artefacto de ruptura. Timo, caballo. Las

preparaciones de órganos de alta densidad
celular presentan a menudo finas
separaciones en toda su extensión.
ARTEFACTOS
Marcas de cuchilla y pliegues. Esófago,
caballo. Las marcas de cuchilla pueden
deberse a defectos en el filo de la cuchilla
del microtomo o a la acumulación de restos
de corte previos en el filo. Los pliegues
aparecen cuando el corte de tejido no se
estira apropiadamente sobre el
portaobjetos.

Los pliegues son áreas sobreelevadas del

corte que se superponen con otros (el
espesor del corte a ese nivel es, al menos,
el doble que en el resto y esa es la razón
por la cual se observa como una zona de
coloración más intensa).
 PRÁCTICA 0.
CITOLOGÍA E HISTOLOGÍA.
CURSO 2021-2022.

INTRODUCCIÓN A LA MICROSCOPÍA