TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO «Ciencia es verdad, técnica es libertad»

Instituto Tecnológico de La Paz Enero – Junio 2020 (S1)

Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica [REPORTE DE PRÁCTICA]

Factores que afectan la velocidad de una reacción enzimática

[Sánchez Osuna Raúl] [15310856], [raulsanchezosuna@gmail.com],

[Equipo #4]

[M.C. Mauricio Salvador Rodríguez Ojeda]

[Bioquímica]

Fecha: 2020-03-11

Resumen

Las enzimas son proteínas especializadas en la catálisis de las reacciones biológicas, aceleran las reacciones

químicas. Son caracterizados por su poder catalítico y especificidad. El poder catalítico que tienen las enzimas representas

grandes factores que afectan la velocidad de una reacción enzimática. La velocidad de una reacción catalizada por una

enzima puede medirse con las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores. El estudio de la cinética y

de la dinámica química de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo,

cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo

de moléculas. La α-amilasa es una enzima que hidroliza el almidón, glucógeno y otros oligosacáridos y polisacáridos

semejantes. En la práctica desarrollada se determinaron los factores que afectan la velocidad de una reacción enzimática por

medio de la prueba del yodo, gracias al reactivo lugol. Con base en los resultados obtenidos, se comprobó de que forma

diferentes aspectos afectan la velocidad de acción enzimática, es decir se observó a concentraciones de enzima diferentes y

que tan rápida se da la reacción, por otra parte, también se hicieron pruebas para actividad a diferentes temperaturas donde

la temperatura óptima se encontró a los 37°C y que, a la presencia de temperatura elevada o baja, la enzima actúa mucho

más lento o se desnaturaliza.

Palabras clave:

Enzima, Catálisis, Reacción, Temperatura, pH, Concentración.

Introducción y objetivos transformación de diferentes tipos de energía. Estas

proteínas están caracterizadas por su poder catalítico y

Los enzimas son proteínas especializadas en la catálisis de
especificidad. Por otra parte, pueden actuar como
las reacciones biológicas (Nelson & Cox, 2015) es decir;
interruptores moleculares que regulan la actividad
aceleran las reacciones químicas, además intervienen en la

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catalítica y transforman energía debido a su capacidad para concentraciones saturadas de sustratos (Nelson & Cox,

acoplar la actividad de centros de unión separados 2015).

(Tymoczko, Berg & Stryer, 2011). En la concentración de sustrato es considerado como un

El poder catalítico de los enzimas, representado tanto por factor que afecta la velocidad de las reacciones catalizadas

la notable capacidad de aumentar la velocidad de una por enzima, debido a que la concentración de sustrato

reacción especifica como por la increíble habilidad para cambia durante el transcurso de una reacción in vitro a

escoger entre sustratos alternativos, justifican medida que el sustrato se convierte en producto (Nelson y

adecuadamente las conjeturas clásicas de Haldane y Cox, 2015). Dentro de este terminó se presenta el

Pauling; donde Haldane justifica que los enzimas concepto de velocidad máxima (Vmax), la cual refleja la

deforman la estructura de sus sustratos hasta que sea igual concentración de sustrato relativamente bajas, la velocidad

a los productos, mientras que para Pauling la eficiencia inicial (Vo) aumenta casi linealmente con el incremento de

enzimática se debe a la complementariedad de los enzimas la concentración de sustrato. Por otra parte, a mayores

con el estado de transición de la reacción que catalizan, es concentraciones de sustrato, la velocidad inicial aumenta a

decir, la estructura inestable y transitoria a través de la incrementos cada vez menores en respuesta a incrementos

cual se pasa para ir de los sustratos a los productos (Pretó, de concentración de sustrato. Dicho lo anterior, se alcanza

Sendra, Pamblanco & Bañó, 2007). un punto más allá del cual se da incrementos pequeñísimos

La catálisis enzimática de las reacciones es esencial para de velocidad inicial a medida que aumenta la

los sistemas vivos. En condiciones biológicas, las concentración del sustrato (Nelson & Cox, 2015).

reacciones no catalizadas tienden a ser lentos (Nelson & En cuestiones del pH, los enzimas tienen un pH óptimo o

Cox, 2015). un intervalo de pH en el que su actividad es máxima, a

La cinética enzimática estudia la velocidad de las valores superiores o inferiores de pH la actividad

reacciones catalizadas por los enzimas (Tymoczko, Berg disminuye (Nelson & Cox, 2015). Los valores de pH de

& Stryer, 2011). La velocidad de una reacción catalizada los enzimas caen en el espectro de 6 a 8, pero hay

por una enzima puede medirse con facilidad, ya que en excepciones. La sustancia que se utiliza para mantener el

muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. pH de la mezcla de reacción debe tener un pKa cercano al

La medición se realiza siempre en las condiciones óptimas pH óptimo de la enzima y su concentración debe ser lo

de pH, temperatura, presencia de cofactores. Y se utilizan suficientemente elevada para que ejerza un efecto

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amortiguador (tampón) de pH adecuado. En algunos casos, temperaturas bajas, pasando a temperaturas intermedias y

la sustancia tampón inhibe o activa a la enzima objeto de posteriormente a altas. El aumento de energía cinética de

medición, aspecto que debe tenerse en cuenta cuando se moléculas también aumenta la rapidez de movimiento y,

selecciona una u otra sustancia como tampón, y a la hora por ende, la frecuencia con la cual chocan. Esta

de fijar su concentración (Hernández, 2014). El efecto del combinación de choques más frecuentes y más energéticos

pH se presenta en la ionización del sitio activo, donde la y productivos, aumenta el índice de reacción (Robert K.

concentración de H+ afecta la velocidad de la reacción en Murray, 2013).

muchas formas. Primero el proceso catalítico usualmente La α-amilasa (E.C.3.2.1.1) son enzimas que hidrolizan el

requiere que la enzima y el sustrato tengan químicos en almidón, glucógeno y otros oligosacáridos y polisacáridos

una forma iónica particular para poder interactuar; para semejantes, dando glucosa y maltosa como productos

efectos del pH para la desnaturalización del enzima; los finales del hidrólisis. El sustrato sobre el que actúa la α-
pH extremos pueden ocasionar la desnaturalización de los amilasa es el almidón. El almidón es un polisacárido

enzimas, debido a que la estructura con estos cambios es compuesto de dos tipos de polímeros: amilosa y

posible modificar las interacciones iónicas que intervienen amilopectina. (BRENDA, 2019).
en la estabilidad de la enzima en su estado nativo.
En la elaboración de la práctica se utilizó la prueba de
También hay presencia de pH óptimo en la variación de
yodo del almidón para la detección de trazas diminutas de
diferentes enzimas donde el pH de las enzimas adquiere su
almidón en solución (MacFaddin, 2003). Esta prueba
máxima actividad y difiere según la enzima, depende de la
consiste en que el almidón se convierte en azúcar, es decir;
secuencia de aminoácidos que las conforman. Sin
en él se efectúa un proceso de hidrolisis donde la
embargo, también está relacionada con el microambiente
conversión puede visualizarse coloraciones de la reacción
celular en el cual desarrollan su catálisis (Contreras,
(Vasudevan, 2011). Si bien la amilosa y la amilopetictina
2003).
tienen un comportamiento distinto a la del yodo; la
Otro efecto que actúa sobre la velocidad de la enzima es la fracción de amilosa de la solución puede combinarse

temperatura. Aumentar la temperatura incrementa la mucho más con yodo, lo que mostrara una tonalidad azul

energía cinética de la molécula. El número total de intenso. Este complejo creado (amilosa-yodo) absorbe las
moléculas cuya energía cinética excede de la barra de moléculas de almidón y yodo. Lo que resulta que las

energía para la formación de productos aumenta desde moléculas de yodo se encuentran atrapadas dentro de la

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hélice no ramificada de unidades de glucosa de la cadena de la prueba en una tabla. Posteriormente para realizar la

de amilosa, en este paso la coloración azul se pierde. Cabe influencia de la temperatura sobre la velocidad de la

mencionar que durante la hidrólisis la reacción reacciona acción enzimática se rotularon cuatro tubos de ensaye del

durante el tiempo, entonces el uso del reactivo lugol es uno al cuatro, posteriormente se les agregó 2.5 ml de

favorecedor para visualizar los colores en donde el yodo almidón al 1% cada uno, también 100 µL de amilasa (10

cambia gradualmente de color azul intenso a púrpura, y en mg/ml) la cual fue la cantidad en la que el punto acrónico

dado caso de una falta de color, esto indica que la (en este caso amarillo) fue percibido en el lapso de 14-18

hidrólisis del almidón se está produciendo (MacFaddin, minutos, se mezclaron perfectamente y se colocaron a

2003). distintas temperaturas las cuales fueron 2°C, 37°C,

El objetivo de la práctica es determinar los factores que temperatura ambiente (24°C) y 70°C, los tubos se

afectan la velocidad de una reacción enzimática. Así incubaron durante 5 minutos en cada temperatura

como, los objetivos específicos son determinar respectivamente, después se les efectuó la prueba del yodo

experimentalmente el efecto de la concentración de la colocando una gota de la muestra y una de reactivo de

enzima, temperatura y pH sobre la velocidad de una lugol en una placa horadada de vidrio, los tubos se dejaron

reacción enzimática. incubados, cada dos minutos se colocó una gota de

reactivo y una de lugol durante 20 minutos, se anotaron los

Materiales y métodos
resultados de la prueba en una tabla, describiendo los
Primeramente para el estudio la influencia de la
colores.
concentración se rotularon cuatro tubos de ensaye con los
Resultados
números de 1 al 4 respectivamente, con una pipeta de 5 ml

se le agregó 2.5 ml de almidón al 1% a todos los tubos, A continuación, se presenta una tabla con las tonalidades

posteriormente con una pipeta de 1 ml se le agregó al tubo obtenidas durante los ensayos de la prueba del yodo en

uno 50 µL de amilasa, al dos se añadió 100 µL, al tres 150 cada factor.

µL y al cuatro 250 µL, se agitaron perfectamente cada Tabla 1. Colores y tonalidades obtenidas durante los ensayos de
la prueba del yodo en cada uno de los factores que afectan a la
tubo de ensaye, luego se les efectuó la prueba del yodo a velocidad.

cada tubo, se colocó una gota de cada tubo y una gota del Color/Signo Tono
Negro (N)
reactivo lugol en una placa horadada, colocando cada Violeta (V)
Café (C)
minuto una gota por 20 minutos, se anotaron los resultados

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Café Claro (CC) 14 C M CC C

Miel (M) 16 V A CC CC
Amarillo (A) 18 N M M C
20 N M CC N

A. Concentración de la enzima
Discusión
Tabla 2. Tonalidades obtenidas en la prueba del yodo a
diferentes concentraciones de amilasa (E) y 2.5 ml de almidón De acuerdo con Vasudevan y colaboradores en 2011, la
(S) en cada tubo.
acción de las amilasas en la hidrólisis del almidón, actúan
Tiempo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
(min) (2.5 ml (2.5 ml (2.5 ml (2.5 al azar sobre enlaces 1,4 y 1,6, con el fin de romper el
S/50 µl S/100 µl S/150 µl ml/250
E) E) E) µl E) almidón en unidades más pequeñas denominadas dextrinas
1 N N C N
2 N N C N y finalmente a α-maltosa; las coloraciones presentes en la
3 N N C N
4 N N C C tabla 1 correspondientes a las tonalidades que se
5 N N C C
6 N N C C observaron en la experimentación, son dadas gracias a que
7 N N C C
8 N N CC C el almidón estando en un periodo de hidrólisis corto,
9 N C CC C
10 N C CC C produce amilo dextrinas que son las que producen un color
11 N C CC C
12 C CC CC CC negro-violeta oscuro con el yodo y es no reductor,
13 C CC CC M
14 C M CC CC posteriormente en una hidrólisis adicional se producen
15 C M CC CC
16 C A CC CC eritrodextrinas, que dan un color café obscuro con el yodo
17 C A CC M
y una ligera reducción, luego la producción de
18 V A M CC
19 V M A CC
acrodextrinas (café claro-oscuro) y después la producción
20 V M M CC
de maltosa (sin color con el yodo, pero potentemente

B. Temperatura reductora).

Tabla 3. Tonalidades obtenidas en la prueba del yodo a Continuando con la idea de Vasudevan y colaboradores en
diferentes temperaturas con 2.5 ml de almidón y 100 µl de
amilasa en cada tubo. 2011 y MacFaddin (2003), en la reacción de hidrólisis que
Tiempo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 se llevó a cabo en el ensayo en 4 tubos a diferentes
(min) (2°C) (37°C) (T.A=24°C) (70°C)
2 N C C V concentraciones de enzima, como se observa en la tabla 2
4 N CC C V
6 N CC C N ocurrió lo siguiente: el tubo 1 no presentó una
8 C M CC C
10 C M CC C concentración suficiente de enzima para degradar el
12 C M CC C

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almidón a maltosa, por la coloración negro-violeta oscuro El tubo 3 con una cantidad de amilasa (10 mg/ml)

que se obtuvo en la mayor parte del lapso de 20 minutos de 150 µl, también presentó una hidrólisis de almidón

de prueba de yodo, comprueba que solo se hizo el completa pues pasó de una coloración café oscura por el

complejo amilosa-yodo, aquí es donde el yodo se queda complejo acrodextrinas-yodo, que en el transcurso del

atrapado dentro de la hélice no ramificada en la cadena de tiempo perdió coloración y se obtuvo un color amarillo

amilosa, por lo tanto la cantidad de 50 µl de amilasa (10 que predice una hidrólisis completa, donde no hay

mg/ml) presente en esta muestra no fue la óptima para una presencia de almidón para hidrolizar, sin embargo, no fue

degradación de almidón, pues la reacción nunca procedió a la cantidad seleccionada de amilasa para el siguiente

la transformación. ensayo, debido a que la finalización de la reacción se dio

En el tubo 2 la cantidad de 100 µl de amilasa (10 hasta el minuto 19, pasándose por 3 minutos a la cantidad

mg/ml) resulto ser la más favorable para la reacción de referente al tubo 2.

hidrólisis de almidón a dos moléculas de glucosa. Al En el tubo 4 con una cantidad de 250 µl de

comienzo de la prueba se presentó un color negro pero a amilasa (10 mg/ml), se presentó un color café después de

partir del minuto 9 la coloración vario pasando desde un los primeros minutos, que demuestra la presencia del

café oscuro a uno claro, esto demostró la presencia del almidón que está siendo hidrolizado por la amilasa

almidón que estaba siendo hidrolizado por la amilasa presente, sin embargo, solo se obtuvo una hidrólisis parcial

presente, obteniendo al transcurso del tiempo un cambio cerca del minuto 13 presentando un color miel, pero

gradual de café claro, pasando por una tonalidad miel y minutos después, al hacer la prueba del yodo se obtuvo

finalmente a amarillo que indicó una hidrolisis completa, una tonalidad de nuevo café-clara, esto pudiendo ser

donde no hay presencia de almidón, sino solo se percibió debido a la diferencia en cuanto a la relación de

el color amarillo proporcionado por el reactivo de lugol. concentraciones enzima/sustrato disponible para la

Esta fue la concentración óptima puesto que la reacción hidrólisis.

completa se dio en menor tiempo en comparación con los Barreiro y Sandoval en 2006, describieron que a medida

otros tubos, la reacción finalizó al minuto 16, después de que la temperatura disminuye, la velocidad de la reacción

este minuto no se presentó ningún cambio en la coloración también lo hace, siendo nula únicamente cuando se
hasta el minuto 19 pero solo variando ligeramente el tono alcanza el cero absoluto, las bajas temperaturas reducen,

a miel. pero nunca detienen la actividad enzimática, por lo tanto,

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un producto puede deteriorarse por vía enzimática durante El tubo 3, presentó actividad enzimática pero no

la congelación por largos periodos, debido a que la la óptima, se obtuvo una actividad después de los 8

actividad es sumamente lenta pero existente. Las enzimas minutos de añadir la amilasa, presentando hidrolisis de

tienen una temperatura óptima para su acción, el almidón hasta el término de la prueba de yodo, con una

enfriamiento, coloca el nivel de temperatura fuera del hidrólisis más avanzada en el minuto 18, debido a que la

óptimo, necesariamente reduce la actividad enzimática, y temperatura ambiente se encontraba en 24°C, a 13 grados

las altas temperaturas arriba de la temperatura óptima, son de diferencia de la temperatura óptima.

capaces de desnaturalizar la parte proteica de las enzimas, En cuanto al tubo número 4 que fue incubado a

inactivándolas. 70°C no presentó hidrolisis de almidón durante el lapso de

En el experimento de influencia de temperatura tiempo de la prueba de yodo, considerando lo descrito por

sobre la velocidad de la acción enzimática, se obtuvo que Barreiro y Sandoval (2006), que al aumentar la

al incubar los 4 tubos con la cantidad de amilasa óptima temperatura por arriba de la óptima es capaz de

para la reacción (100 µl) de acuerdo con la tabla 3 que: El desnaturalizar la enzima, inactivándola.

tubo 1 encubado a 2 °C no presentó hidrólisis después del

periodo de tiempo establecido (20 minutos), y de acuerdo

Conclusiones
con Barreiro y Sandoval (2006) el enfriamiento redujo la
Con base en los análisis de resultados se puede admitir que
actividad enzimática, por lo tanto, la reacción se iba a dar
los objetivos de la practica fueron cumplidos. Cabe
en un tiempo mucho más prolongado.
resaltar que por disponibilidad de tiempo en el laboratorio
El tubo 2 que fue incubado a 37°C, presentó
no se logró obtener resultados para las pruebas a diferentes
actividad enzimática óptima, hidrolizando el almidón,
pH, razón por la que no se ve reflejado su análisis en el
desde los primeros 4 minutos de agregar la amilasa, hasta
presente reporte, pero sin lugar a dudas se considera el
el término de la prueba, presentando hidrólisis completa al
objetivo alcanzado, ya que se pudieron analizar los dos
minuto 16, que de acuerdo a MacFaddin (2003), la
primeros factores, lo cual aporto una visión más clara bajo
hidrólisis de almidón por la α-amilasa presenta una
qué condiciones se lleva a cabo la catálisis enzimática.
temperatura optima satisfactoria a los 37°C, comprobando

lo obtenido experimentalmente.

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Referencias bibliográficas 10. Vasudevan, D. M., Screekumari, S. y Kannan, V.

(2011). Teexbook of biochemistry for dental

1. Barreiro, M. J. y Sandoval, B. A. (2006).
students, Panamá: JAYPEE.
Operaciones de conservación de los alimentos por

bajas temperaturas, Venezuela: EQUINOCCIO.

2. BRENDA (2019). Information on EC3.2.1.1-

alpha-amylase. Recuperado de: www.brenda-

enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.2.1.1

3. Contreras Vázquez, E. (2003). Bioquímica y

biología molecular en línea. Recuperado de:

http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/ci

cicine%20enzimatica.html

4. Hernández, A. G. (2014). Principios de

bioquímica clínica y patología molecular.

Barcelona: ELSEVIER.

5. MacFaddin, J. F. (2003). Prueba bioquímica para

la identificación de bacterias de importancia

clínica. Argentina: Panamericana.

6. Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2015). Lehninger:

principios de bioquímica. Barcelona. Omega.

7. Pretó, J., Sendra, R., Pamblanco, M., & Bañó, C.

(2007). Fundamentos de bioquímica. Valéncia:

Universidad de valéncia.

8. Robert K. Murray, D. A. (2013). Bioquímica

ilustrada. México: MCGRAW-HILL.

9. Tymoczko, J. L., Berg, J. M., & Stryer, L. (2011).

Biochemistry: a short course. Macmillan.

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