TRANSPORTE DE GLUCOSA Y BOMBEO DE PROTONES

EN Saccharomyces cerevisiae

INTRODUCCIÓN
La molécula de glucosa representa la principal fuente de carbono y energía para la
mayoría de las células. El ingreso del azúcar a la célula, que marca el inicio del catabolismo, es
un proceso altamente regulado que varía de una célula a otra, dependiendo de sus funciones.
En Saccharomyces cerevisiae, una levadura que requiere del aporte constante de glucosa para
procesarla por las vías aeróbica o anaeróbica, la captación de azúcares es un proceso complejo
en el que participan numerosos transportadores pertenecientes a una familia multigénica,
compuesta por al menos 20 genes diferentes (Bisson y Coons, 1993; Conde et al., 2010). Los
mecanismos y la cinética de este transporte han sido motivo de discusión durante años, sin
embargo, hasta el momento, únicamente se sabe que se trata de una captación multifásica
compleja, pero se desconoce el número y tipo preciso de sistemas de transporte participantes
(Conde et al., 2010).
Además de ser una excelente fuente de carbono para S. cerevisiae, la glucosa actúa
como señal para la regulación génica de diversos procesos celulares (Bisson y Coons, 1993). Una
molécula cuyo gen es inducido por la presencia de este azúcar es la ATPasa de protones (H+-
ATPasa, EC 3.6.3.6) (García-Arranz et al., 1994). Esta enzima se localiza en la membrana
plasmática de S. cerevisiae, en donde participa bombeando protones del citoplasma al exterior
para regular el pH intracelular que disminuye durante el crecimiento celular (Fig. 1). A la par de
que expulsa protones, esta ATPasa genera un gradiente electroquímico necesario para el
ingreso de nutrientes a la célula, entre los que se incluye a la propia glucosa. A nivel
postraduccional, la glucosa también afecta a la H+-ATPasa, promoviendo una modificación
covalente en la proteína que incrementa su actividad transportadora (Malpartida y Serrano,
1981). La acidez citoplásmica y la presencia de azúcares en el exterior de la célula también
suscitan esta activación, pero por mecanismos cinéticos diferentes (Gancedo, 2008 y Pereira et
al., 2008).

Figura 1. Relación entre el transporte y

metabolismo de la glucosa, y la actividad de la H+-
ATPasa en S. cerevisiae (Pardo y Martínez, 2009).
OBJETIVOS
 Determinar por un método colorimétrico el transporte de glucosa en S. cerevisiae.
 Establecer la relación existente entre el consumo de glucosa y la actividad de la H +-
ATPasa membranal.
 Observar el efecto de un inhibidor de la síntesis de ATP mitocondrial sobre la actividad
de la H+-ATPasa membranal.

Material Reactivos
2 vasos de precipitados de 30 mL Suspensión celular de Saccharomyces
Potenciómetro y amortiguadores de cerevisiae en agua (2g/10 mL)
referencia para calibrar Solución de glucosa al 10%
1 parrilla con agitador magnético Solución de azida de sodio (NaN3) 500 mM
1 cronómetro Solución stock de glucosa a una
Micropipetas de 200 y 1000 L concentración de 100 µg/mL
Puntas para micropipeta Reactivo de cobre
Piceta con agua destilada Reactivo de arsenomolibdato
30 tubos de ensayo de vidrio
16 tubos Eppendorf de 1.5 mL
1 microcentrífuga
1 pocillo
1 parrilla
1 espectrofotómetro
guantes de látex

Preparación de las células (a cargo de los técnicos académicos).

1. Disuelva dos gramos de levadura granulada en 10 ml de agua destilada y deje reposar

durante 15 min a temperatura ambiente.
2. Centrifugue la suspensión a 3000 rpm durante 3 min (en una centrífuga clínica) y
resuspenda el precipitado en 10 ml de agua (repita dos veces este paso).
3. Resuspenda el último precipitado en 5 ml de agua.

MÉTODO

A) Actividad de la H+-ATPasa (Pardo y Martínez, 2009)

Control
1. Diluya 2.5 mL de la suspensión de levadura con 20 mL de agua destilada.
 2. Mantenga la suspensión en agitación constante ayudándose de una parrilla con agitador
magnético, mida el pH con el potenciómetro previamente calibrado. Repita la operación
en dos ocasiones más, con intervalos de 3 minutos, hasta obtener un valor basal.

3. Sin retirar el electrodo de la muestra, añada 1.5 mL de glucosa al 10% e inicie de

inmediato el conteo del tiempo. Tome la lectura del pH a los 0, 1.5, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21,
24, 27, 30, 33 y 36 minutos.

Experimento con azida de sodio*

4. Repita los pasos 1 y 2. Posteriormente añada 240 L de una solución de azida de sodio
500 mM , tome la lectura de pH y espere 5 minutos.

5. Repita el paso 3

B) Transporte de glucosa (Perales et al., 2008) (únicamente para el control)**

1. Para determinar el transporte de glucosa retire 500 L de la suspensión celular a los

minutos 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 35, y deposite cada alícuota en un tubo de
microcentrífuga (1.5 mL) etiquetado.

2. Centrifugue de inmediato cada tubo a una velocidad de 14,000 rpm durante 2 min.
Recupere 100 L del sobrenadante en otro tubo de microcentrífuga y mézclelos con 900
L de agua destilada. De estas diluciones utilizará 100 L para cuantificar la glucosa.

3. Prepare los tubos de la curva patrón y de las muestras de acuerdo a la siguiente tabla.
Añada el reactivo de cobre hasta que haya agregado todas las muestras.

*La azida de sodio es un inhibidor de la citocromo oxidasa, que bloquea la cadena respiratoria
mitocondrial entre los citocromos a y a3 (Rikhvanov et al., 2002). Este compuesto debe
manejarse utilizando guantes y con precaución debido a que es un potente veneno.

**La mezcla de azida de sodio y agua origina ácido hidrazoico, que en presencia de metales,
como el cobre, forma azidas metálicas, sumamente explosivas. Por lo anterior, no se
cuantificará la glucosa en las muestras con azida.
 Curva patrón Muestras
Reactivo (mL) 1 2 3 4 5 6 Del tubo 7 al 14
Patrón de glucosa (100 g/mL) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.5 0.7 -----------
Agua destilada 1.0 0.9 0.8 0.7 0.5 0.3 0.9
Muestras problema --- --- --- --- --- --- 0.1
Reactivo de cobre 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

4. Incube los tubos a ebullición en baño María durante 20 minutos.

5. Enfríe los tubos y agregue a cada uno 1 mL del reactivo de arsenomolibdato. Añada
después 7 mL de agua destilada a cada tubo y mida la absorbancia a 590 nm, utilizando
como blanco de reactivos el contenido del tubo número 1.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

1. Grafique los valores de pH extracelular obtenidos a diferente tiempo de exposición a la

glucosa, en ausencia y presencia de azida de sodio.

2. Convierta estos valores de pH en concentraciones de hidrogeniones y grafíquelas en

función del tiempo de exposición a la glucosa.

3. Calcule la concentración de glucosa en el medio de cada una de las muestras y grafique

estos datos en función del tiempo de exposición al azúcar.

4. Discuta sobre relación que existe entre el transporte de glucosa y la actividad de la H +-

ATPasa y la manera en que la azida de sodio podría estar afectándolos.
BIBLIOGRAFÍA
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