BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J.

Chimoy Effio
Manual de Prácticas

I. DETERMINACION DEL pH, pK Y PREPARACION DE

BUFFERS.
I.1 COMPETENCIAS (Dos sesiones, 8 H)
a. El alumno prepara las siguientes soluciones: HCl 20 y 200 mM ; NaOH
20 y 200 mM.
b. El alumno calibra y usa correctamente un pH-metro.
c. El alumno prepara los siguientes buffers: fosfato 0.2M pH 8.2, acetato
200 mM pH 3.8 y Tris-Glicina 25 mM pH 8.3.
d. El alumno haciendo uso de tres indicadores líquidos, determina el pH de
una solución.
e. El alumno determina el pH de diferentes soluciones mediante el uso del
pH metro e indicadores, tiras o varillas.
f. El alumno podrá preparar con tres indicadores líquidos un solo indicador
para medir el pH en un rango de 1-10.
g. El alumno titula los buffers acetato, fosfato y glicina a fin de evaluar su
capacidad de tamponamiento, así como determinar sus pK.

I.2 INTRODUCCIÓN
Dado que la gran mayoría de reacciones en el organismo dependen del pH,
resulta importante medir este valor con gran exactitud.
El pH se define como –Log [H+] = Log 1/ [H+].
En los líquidos corporales el pH se mantiene normalmente dentro de límites
muy estrechos: en el líquido extracelular es aproximadamente de 7.4; y algo
menor en el intracelular.
Otro valor ligado al pH es el pKa cuyo valor se obtiene, en la ecuación de
Herderson – Hasselbach cuando la [Sal]=[Ácido]; la concentración de la sal es
igual a la del acido:

pH = pKa + Log {[Sal]/[ac.]}, si [sal] = [ac.] entonces pH = pka

El pKa se puede obtener experimentalmente al plotear el valor de Log [sal] /

[ac.] vs. pH correspondiendo el valor del intercepto al pKa.
La medición del pH se realiza por indicadores líquidos coloreados / incoloros,
indicadores de papel y con el pH-metro. Sin embargo la forma estricta de medir
el pH es con el pH metro (potenciómetro).
Antes de entrar al detalle de cómo medir el pH, recordemos que en 1909
Sorensen definió que una solución es neutra si el pH es igual a 7. Una solución
es alcalina cuando el pH es mayor que 7 y una solución es ácida si el pH es
menor que 7.
Por otro lado, debemos considerar que un ácido es toda sustancia que dona
protones (H+) mientras que una base aquella que acepta protones. Las bases y
los ácidos pueden ser fuertes (ej. HCl) o débiles (ej. Ac. Acético). La acidez de
una solución está dada por [H+]. La concentración de [H+] se expresa como la
molaridad (M) (mol de H+/ L). Ej. Un acido monoprotónico con 10 -6 M (mol.
H+/L) tendrá un pH de – Log 10-6 = 6.
El método potenciométrico comprende dos tipos de análisis: a) la medición
directa de un potencial de electrodo y b) los cambios en la fuerza electromotriz
que produce la adición de un titulante.

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 1

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Los eléctrodos más empleados en los pH metros son: electrodos de vidrio,

electrodos de estados sólidos y precipitados, electrodos de enzimas y sensores
de gases. El desarrollo de nuevos tipos de electrodos con selectividad iónica
está pasando a ocupar su lugar junto con el electrodo de vidrio. Todos ellos
involucran un proceso de intercambio iónico en el mecanismo de determinación
del potencial; se producen potenciales que pueden describirse adecuadamente
por la ley de Nersnst; en todos los casos se miden las cavidades de los iones,
es decir la concentración iónica libre termodicamente efectiva, mas no
concentraciones.
Bates y Guggehein establecen que:

pH = pHs - {(E - Es)/2.3 RT}xF, donde:

pH = pH a determinarse
pHs = pH del Standard
T= Temperatura en grados kelvin (0K)
F= Constante de Faraday
R= constante de los gases
E= Fuerza electromotriz (fem) de la sustancia por determinante el pH
Es= fem. del standard.
El pH metro mide el voltaje de una solución a través del electrodo de vidrio, el
cual es permeable a H+ pero no a otros cationes o aniones; la magnitud de este
potencial viene dado por la ecuación :

E= (2.303 RTxLog {[H+]i/[H+]e}/F, donde:

[H+] i = concentración de H+ en el interior
[H+] e= concentración de H+ en el exterior
Si la [H+] se fija en uno de ellos, el potencial será determinado por el pH de la
otra solución.

V= E fijo - 2.302 RTxLog{ [H+]i/H+]e}/F (1)

Conociendo que [H+] i = HCL 0.1N, luego

V= E fijo + 2.302 RT – 2.302 RTxpH (2)

F F
V= constante – 2.302 RTxpH
F
Donde el voltaje generado esta directamente relacionado con el pH. La Fig. 1
muestra un esquema general de un pH metro con electrodo de vidrio y uno de
referencia (calomel).

Una estrategia de medir el pH es mediante soluciones o tiras indicadores, estos

por lo general son ácidos o bases débiles cuyos iones tienen distinto color que
las moléculas no disociadas. La disociación depende de pH en que se
encuentre la solución. El cambio de color se debe a la disociación del indicador,
pues sus acido/base conjugada representa colores diferentes (una de ellas es
incolora, la otra coloreada).
Los indicadores líquidos (ej. Fenolftaleina, Rojo de metilo) son utilizados en los
análisis volumétricos para reconocer el punto final de una titulación.

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La ecuación del estado de disociación del indicador es:

[Hind] [H+] + [Ind-]

ac. débil base conjugada
(Color a) (Color b)

Fig.I.1 Esquema General de un pH metro

(Adaptado de D. Freifelder. 1979)

Si consideramos que Hind es la concentración y estado del indicador no

disociado; luego el estado disociado es: [H+] y [Ind-]; luego su constante de
disociación está dada por la ecuación:

K= [H+] [Ind-], despejando [H+] = [Hind] x k, calculando Log:

[Hind] [Ind- ]

- log [H+] = pK + Log {[Hind]/[Ind-]}

La relación [Hind] / [Ind-] es la que determina el color y guarda una relación
directa con el pH. Cada indicador tiene una “zona de viraje” característica del
indicador; así por ejemplo el azul del bromofenol a pH 3 es amarillo mientras
que a pH4.6 es azul violáceo (Púrpura) (ver tabla I.1).
Las tiras de indicadores de pH son tiras de papel impregnadas con un indicador
o una mezcla de indicadores. Las tiras indicadoras permiten saber el pH de una
solución con una aproximación de 0.2 unidades.
Obviamente, la desventaja de los indicadores (aún de las tiras) es que no se
pueden aplicar a soluciones coloreadas. Su utilidad, sin embargo debe
estimarse como preliminar o aproximado.

Los amortiguadores de pH (buffers, tampones, reguladores) son sistemas que

garantizan que el pH de una solución varié muy poco después de agregar un
ácido o una base.
Los buffers generalmente están compuestos de un ácido débil y su sal
conjugada.

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TABLA I.1 INDICADORES DE USO COMUN: pK Y COLOR

INDICADOR pK RANGO DE pH Y VARIACION DE COLOR

Azul de bromofenol 3.86 3.0– 4.6 Amarillo - Azul Violeta (Púrpura)
Azul de bromotimol 7.10 6.0 - 7.6 Amarillo – Azul
Azul de timol 8.90 8.0 – 9.6 Amarillo – Azul
Fenolftaleina 9.40 8.2 – 9.8 Incoloro - Grososella
Naranja de metilo 3.40 3.1 – 4.4 Rojo Anaranjado
Púrpura de bromocresol 6.30 5.2 – 6.8 Amarillo- Purpura
Púrpura de cresol (ácido) 1.15 1.2 – 2.8 Rojo - Amarillo
Púrpura de cresol (básico) 8.32 7.4 – 9.0 Amarillo – Purpura
Rojo de clorofenol 5.98 5.0 – 7.0 Amarillo Rojo
Rojo de cresol 8.20 7.0 – 8.8 Amarillo Purpura
Rojo de metilo 4.95 4.4 – 6.2 Grocella Anaranjado
Timolftaleina 7.76 7.0 - 8.2 Incoloro –Azul
Verde de bromocresol 4.68 3.8 – 5.4 Amarillo Azul
Amarillo de alizarina 11.20 10 – 12.1 Amarillo – Rojo Naranja

En los organismos vivos, sobre todo a los valores de pH en que se realizan la

mayor parte de sus funciones, los sistemas amortiguadores presentes en la
célula y algunos líquidos extracelulares garantizan la constancia de esta
característica.
Los sistemas amortiguadores de pH, conocidos como buffers que tienen
incidencia en los organismos son:
(a) fosfato acido / fosfato básico
(b) ac. carbónico / bicarbonato
(c) Proteína acida / proteína Básica

Analicemos el buffer acetato:

(98.68%) (1.32%)
-
[CH3COOH] [CH3COO ] + [H+]
(1.32%) (98.68%)
[CH3COONa] [CH3COO-] + [Na+]

Cuando se añade un ácido o una base:

[CH3COOH] + [CH3COO-] + [Na+] + [H+]  sube [CH3 COOH]

+
+H
- +
Ka= [CH3COO ][H ]
[CH3COOH]

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[CH3COOH] + [CH3COO-] + [Na+] + [OH-] sube [CH3 COOH-]

-
+OH
- +
Ka= [CH3COO ][H ]
[CH3COOH]

El pH de un buffer esta dado por la ecuación de Henderson – hasselbach:

pH = pK+ log[sal]
[ac.]

La relación [sal]/[ac.] da la concentración del buffer ejemplo 100mL de una

solución 0.2 M fosfato monobásico de sodio se mezcla con 100 mL de una
solución 0.2 M de fosfato bibásico de potasio; luego el pH de la solución
resultante será: (pKa del H2PO4-=6.86).

pH =6.86 + log 100 = 6.86

100

A continuación se muestra la Tabla I.2 con los pKs de los sistemas más usados
en bioquímica.

Tabla I.2 pKas de algunos ácidos importantes (250C)

SUSTANCIA pK1 pk2 pk3 pk4

Ac. Acetico 4.76
Ac. Ascorbico 4.30 11.82
Ac. Carbónico 4.68 10.25
Ac. Citrico 3.13 4.76 6.40
EDTA 2.00 2.67 6.27 10.95
Ac. Fomico 3.15
Ac. Ortofosforico 2.15 6.86 12.36
Ac. Parafosforico 1.58 2.36 6.60 9.25
Ac.-2-(N morfolino) 6.15
etano sulfonico
Ac. N-2-hidroxietilpipe-razina-
N’2-etanosulfóni-co 7.55
AC. oxálico 1.27 4.27
AC. Succínico 4.21 5.64
Glicina [H+] 2.35 9.78
Tris –(hidroximetil)
Glicina TRS [H+] 8.08
veronal 7.43

Es importante señalar que para calibrar un potenciómetro son necesarios

buffers standares proporcionados generalmente por el fabricante.

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Tabla I.3 Buffers Estándares

pH
25ºC 37ºC
Fosfato mono básico-K 50 mM
4.01 4.02
Fosfato mono básico-K 25 mM +
Fosfato dibásico-Na 25 mM 6.86 6.84

Tetraborato sódico 10 mM 9.18 9.06

Los rangos de tamponamiento de los buffers más usados son:

Rango pH
Buffer acetato 3 --- 6
Buffer fosfato 6 --- 9
Buffer Amonio / Borato 8 --- 11

Finalmente consideramos las curvas de titulación, obtenidas al graficar, en las

ordenadas, los valores de pH de una solución y en el eje de las abcisas los meq
(volumen x normalidad) del titulante. Las gráficas son diferentes, dependiendo
si se trata de un ácido o a una base (fuerte o débil).

I.3 MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Material de vidrio: Fiolas de 100 mL, Beackers de 50/100 mL, Pipetas de
1/5/10 mL
Reactivos: HCl 38%, NaOH anhidro, Azul de Bromotimol 0.1%, Verde de
bromocresol 0.04%, Rojo de fenol 0.1%. Ac. Acético glacial, Acetato de
sodio. Fosfato dibasico de sodio, Fosfato monobásico de potasio. Trizma
base, Glicina. (Merck o SIGMA)
Solución RKS, indicador universal de pH rango 1-10
Soluciones standares de pH 4.01/6.86/9.18
Equipos: pH Metro / cocina eléctrica.
Otros: Tiras Indicadores de pH SIGMA (0-14), Varillas de pH (0-14). Placas
de porcelana con pozos.

PROCEDIMIENTOS
A. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES: (En todos los casos usar fiolas)
HCl 200 mM
0.73g* de ac. Clorhídrico fumante 38% ( =1.19)
Agua destilada cantidad suficiente para (csp) 100 mL
* Gramos de HCl/mL= (% del ácido) (densidad del ácido)= 0.38x1.19= 0.4522.
1 mL de ácido acético 38% contiene 0.4522 g y 1.614 mL, 0.73g.

HCL 20 mM
Tomar 10mL de HCL 200 mM y agregar agua destilada csp 100ML.

NaOH 200 mM
0.8 g de hidróxido de sólido (pesar rápidamente porque esta sustancia es
higroscópica) y añadir agua destilada csp 100 mL.

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 6

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NaOH 20 mM
Tomar exactamente 10mL de Na0H 200 mM y agregar agua destilada csp 100
mL.

B. DETERMINACIÓN DEL pH
B.1 Método potenciométrico
Primero hay que standarizar al equipo: (ver Fig.I.2). El conmutador de función
debe estar en posición (). Colocar las pilas (parte posterior). Verificar la caída
de potencial, haciendo que el conmutador de función (B) esté en la posición .
Luego observar que la aguja se ubique en la zona negra. Si no ocurre esto
cambiar de pilas.
En un beacker de 50 mL, colocar 25 mL un buffer pH 6.86; introducir
cuidadosamente el electrodo de vidrio (ES UNA MEMBRANA MUY DELICADA)
y asegúrese que:
El potenciómetro de sensibilidad (A) esté en posición 60 mV/ pH y el rango del
conmutador (C) en 0 - 14.
Ahora cambie el conmutador de función a posición (I). Con el potenciómetro de
punto cero (D) ajuste el valor de pH a 6.86. Retorne a la posición ().
Lave el electrodo, séquelo, a continuación calibre con un buffer pH 9.08; si la
aguja no marca 9.18 ajustar con A. EL pH METRO YA ESTÁ LISTO PARA
MEDIR pH de cualquier solución.
Después de medir el pH lave bien los electrodos y deje el aparato en la posición
().

B.2 Método de los indicadores líquidos:

Sobre una placa de porcelana con pozos, poner una gota pequeñísima del
indicador mixto (Merck 5). Luego una gota de los standares para el pH:

4.01 6.36 9.18

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 7

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Electrodo

A B C D
Fig.I.2 pH metro

Indique que pH corresponde al patrón de colores del indicador. Asimismo

discuta su sensibilidad y exactitud.

B.3 Método de las tiras de papel o varillas indicadoras de pH

Considerar las mismas soluciones standares de pH 4.01, 6.86, 9.18, tomar un
centímetro de papel indicador de pH o una varilla, de rango 0-14; humedecerlas
con cada una de las soluciones por separado, es decir use un centímetro de
papel o una varilla por muestra. Analizar el viraje del color con el patrón de
colores que viene en la caja de la tira.

B.4 Medir el pH de soluciones diluidas de HCl e NaOH: El alumno prepara

una solución de HCl 1N y NaOH 1N. Luego con cada una de ellas preparará
soluciones diluidas seriadas de HCl y NaOH 10-1.10-2,10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7
de la siguiente manera: de una solución 1N tomará 1 mL y en una fiola
completará a 10 mL con agua destilada para obtener la dilución 10 -1, de esta
dilución tomamos 1 mL y completamos a 10 mL con agua destilada para
obtener la dilución 10-2. De manera similar se obtendrán las siguientes
diluciones. Medir con el pH metro, tiras de pH y solución universal el pH del
agua destilada y de todas las soluciones.

C. PREPARACIÓN DE BUFFERS
Buffer acetato 1M pH 3.8
Pesar 6.88 g de ac. Acético glacial ( = 1.42) y agregar agua destilada 80 ml,
ajustar, con el pH metro, a pH 4.00 con acetato de sodio (sólido). Finalmente
agregar agua destilada csp 100 mL.

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Buffer acetato 100 mM pH 3.8

Tomar 10 mL de buffer acetato pH 3.8 1M y diluir con agua destilada csp 100
mL.

Buffer fosfato 1M pH 8.2

Pesar 14.2g de fosfato dibasico de sodio y agregar 80 ml de agua destilada,
luego ajustar a pH 8.2 con fosfato monobásico de potasio (sólido) hasta obtener
pH 8.2. Finalmente completar con agua destilada csp 100 ml

Buffer Tris-glicina 25 mM pH 8.3

En una fiola de un litro, colocar 3g de Trizma base y 14.4g de glicina agregar
agua csp 1L. Verificar el pH con el pH metro.
En general para preparar un buffer se tiene en cuenta la ecuación de
Henderson-Hasselbach y de ésta extrapolar la concentración del ácido y de la
sal:

pH = pK + Log {[sal]/[ácido]}
Ej. El pK del Ac. Acético es 4.76. Para preparar 100 mL de un buffer acetato
100 mM pH 4.00, preparamos 100 de una solución de Ac. Acético 100 mM y
una solución de Acetato-Na 100 mM. En la ecuación de Henderson-Hasselbach
remplazamos valores pH= 4.00 y pK= 4.76  4 – 4.76= log [Sal/Acido]= - 0.76
 antilog (-0.76)= Sal/Acido  0.17= Sal/Acido  0.17 (Acido)= Sal. Por lo
tanto debemos mezclar 50 mL de Acido Acético + 8.5 mL de Acetato-Na.
Verificar el pH con el pH metro. Si el pH es mayor ajustar con gotas (25 µL) de
HCl 5M y si es menor con NaOH 5M, luego completar a 100 mL con agua
destilada. En la siguiente tabla damos los volúmenes de sal y ácido para
obtener los buffers acetato 100 mM pH 4,50, 5.00 y 5.50.

mL, Acético 100 mM mL, Acetato-Na 100 mM pH

50 8.5 4.00
50 38.5 4.50
30 52.2 5.00
15 82.5 5.50

D. PRODUCCIÓN DE UN INDICADOR LÍQUIDO.

El alumno dispondrá de 3 indicadores líquidos: azul de bromotimol + rojo fenol +
verde de bromocresol, preparará las mezclas a) 1:1:1 b) 1:2:1 y c) 1:1:2. En un
beacker con 25 mL de HCl 0.1 M adicionará 2 gotas de la mezcla –a- y medirá
el pH con el pH metro registrando el color correspondiente. Luego adicionará,
de 100 en 100 L, NaOH 50 mM anotando los colores correspondientes a los
pHs 1, 2,3…10. Repetirá este procedimiento para las mezclas –b, c-. Después
de confrontar los colores obtenidos con las tres mezclas el alumno deberá
indicar cual es la mezcla ideal que permita determinar el pH para cada color.

E .CAPACIDAD TAMPONANTE Y DETERMINANTE DE PKA

E.1 Del buffer fosfato pH 6.86: En un beacker de 50 mL colocar 25 mL de una
solución buffer fosfato pH 6.86 100 mM medir el pH inicial con un pH metro.
Titular, de 100 en 100 µL, con HCL 500 mM. Registrar el pH después de añadir

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 9

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cada 100 µL. Añadir HCl hasta pH aprox. 5. Realizar lo mismo con otros 25 mL
de buffer pero titulando con NaOH 500 mM hasta aprox. pH 9.

E.2 BUFFER ACETATO pH 4.76: preparar 100 mL de un buffer acetato-Na pH

4.76 100 mM. Titular como para el buffer fosfato (E.1) con HCl 500 mM Y NaOH
500 mM hasta aprox. pH 3 y 7 respectivamente. Registrar el pH después de
añadir cada100 µL.

E.3 BUFFER GLICINA: preparar 100 mL de una solución 100 mM del

aminoácido glicina (0.75g de glicina y agua csp 100 mL) titular con HCl y NaOH,
como se ha procedido con los buffers acetato y fosfato. Titular en los rangos de
pH 1-4 y 8-11.

E.4 Determinación del pKa: con los valores obtenidos y registrados en E.1 y
E.2 se puede obtener directamente los puntos de inflexión correspondiente al
pK. Graficando ∆pH /∆ volumen vs. meq. De ácido o base añadidos. El pK
corresponde al pH donde se produce un máximo.

I.4 RESULTADOS

I.5 DISCUSION Y CONCLUCIONES

I.6 CUESTIONARIO
1. ¿Qué otros procedimientos conoce para determinar el pK a de una
solución? Explique.
2. ¿Qué problemas experimentales ocurren para medir pH con el electrodo
de vidrio?
3. ¿Cuál es el pH del ac. Acético 100 mM y del fosfato mono básico-K 250
mM?
4. ¿Explique como se preparan las varillas para medir pH (Merck o SIGMA)?
5. ¿Qué otros procedimientos sugiere usted para realizar esta práctica?

I.7 REFERENCIAS
Chimoy E,PJ., López L, C., Monteghirfo G, M.1989. Manual de Prácticas de
Bioquímica y Biología Molecular. CONCYTEC. Fac. Cs. Biológicas. UNPRG.
Lambayeque.
NELSON, D.L. & M.M. COX. 2000. Principles of Biochemistry. Worths
Publishers.
D. Freifelder.1979, Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Ed.
Reverte. Cáp. 4.
FIELD K & W REAN. (1999). Molecular Biology Techniques: An intensive
laboratory course. Acad Press
Manual del manejo del pH-meter TM-5 Forschungsins Titutd Meinsberg.
Rendina, G. 1974. Técnicas de Bioquímica Aplicada Ed. Internacional.
México Cáp.1
Tablas de Merck. Tablas auxiliares para el Laboratorio Químico.
Walton HF & Reyes J. 1978. Análisis químico e instrumental Moderno. Ed
Reverte. España.españa.Cap .1.

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 10