PRACTICAS DE ENZIMOLOGÍA Zoila F.

Honorio Durand

PRACTICA 02

TAMPONES FISIOLÓGICOS: FOSFATOS

I.- GENERALIDADES. -

En el organismo mayormente está acompañado de reacciones de óxido reducción,

producción de H+ e hidroxilos como producto del metabolismo.
La concentración de los H+ debe de ser constante que asegure el valor de pH óptimo
para mantener los procesos vitales normales.

Los valores de pH compatibles con la vida saludable del organismo humano fluctúan
entre 6,8 y 7,8 siendo las variaciones muy estrechas en el sistema sanguíneo (7,35
sangre venosa y 7,45 sangre arterial) que corresponden a la concentración normal de H+
de 40 – 35 nEq/litro

El organismo humano regula el pH dentro de los límites adecuados a través de tres

sistemas:
1. Sistema buffer fisiológicos,
2. Los pulmones a través de la respiración con la eliminación de CO2 y
3. Los riñones con la eliminación de H+ y electrolitos como el sodio y
potasio y bicarbonato.

Analicemos el primero.

Las soluciones buffer también reciben el nombre de amortiguadoras o tampones son los
que evitan los cambios de pH cuando se les añaden ácidos o bases.

Es una solución formada por la mezcla de un ácido o base débil y su sal (ácido débil) y
base conjugada o base débil y ácido conjugado.
Son de naturaleza orgánica o inorgánica.
Buffer orgánico: Proteínas; aminoácidos; hemoglobina
Buffer inorgánico: Bicarbonato; Fosfatos

Entre los principales pares amortiguadores plasmáticos están a una concentración de:

NaHCO3/H2CO3 = 27 mM
Na2HPO4/NaH2PO4 = 2 mM
Na,proteína/H,proteína = 16 mM.
Hemoglobina (HbO2 / HHb) y aminoácidos

Un ácido débil se representa como

Es una reacción reversible, A - es la base conjugada la que se une a los iones H + añadidos
neutralizándolos como AH. Por otro lado, si se añade un OH - éste será neutralizado por
el
H+ formando H2O, evitando el incremento de H+ o de OH- libres y por ende los valores de

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pH, recuerda que el valor de:

pH = - log de [H+] y pOH = - log[OH-]

Ejemplos: La reacción que se producen al agregar iones de hidrógeno en forma de un

ácido fuerte a una solución amortiguadora sería, por ejemplo

Na+ + CH3COO- + H+ + Cl- Na+ + Cl- + CH3COOH

Se forma una sal pero ionizada por acción del agua y el ácido débil.

Si se le añade una base fuerte por ejemplo NaOH la reacción sería:

H+ + CH3COO- + Na+ + OH- CH3COONa + H2O

Cada ácido o alcalino tiene una capacidad para liberar H + o de OH- (capacidad de
disociación ) respectivamente representado como Ka y Kb.

El log negativo de los valores de Ka o Kb da lugar a los valores pK

En el siguiente cuadro se muestran los valores de Ka y Kb de ácidos y alcalinos

Acidos Ka -log Ka= pKa Básicos Kb pKb

Acético 1,86 x 10-5 ( a 25°) Amoniaco 1,75 x 10-5 (18°)
Láctico 1,38 x 10-4 ( a 25°) Etilamina 5,6 x 10-4 (25°)
Butírico 1,5 x 10-5 (a 18°) Urea 1,5 x 10-14 (25°)
β - oxibutírico 3,38 x 10-5 (a 18°) Creatinina 2,7 x 10-9 (40°)
Fosforico H3 8,0 x 10-3 Guanina 8,4 x 10-12 (40°)
Fosfato H2 7,5 x 10-8 Xantina 4,8 x 10-14 (40°)
Fosfato H 5,0 x 10-13
Carbonico H2 3,0 x 10-7
Bicarbonato H 4,5 x 10-11
Citrico H3 8,0 x 10-4
Citrico H2 1,77 x 10-5
Citrico H 3,9 x 10-7
Oxálico H2 5,7 x 10-2
Oxalico H 6,1 x 10-5
Tartárico H2 9,7 x 10-4
Tartárico H 2,8 x 10-5

La relación de pH con los pK y el cociente de base conjugada con el ácido se hace a través
de la fórmula de Henderson-Hasselbalch.

pH = pKa + log [base conj]/ [ácido]

La eficacia del amortiguador depende de las concentraciones de la base conjugada y del

ácido y del pH del medio. Es máxima cuando la concentración de la base conjugada ([base
conjugada] es igual a la concentración del ácido [ácido] por lo que el log de 1 es cero

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concluyendo en que.
pH = pKa

Es por ello que se asegura que el buffer es más efectivo como protector de los cambios
del pH es cuando los valores son próximos a los de pK.

Cada ácido tiene una capacidad o fuerza para desprender H+ por ejemplo del ácido láctico
es 1.37 x 10-3 cuyo valor de pKa (- log 1.37 x 10-4 ) es 3.863

PROCESO DE LA ACCIÓN AMORTIGUADORA:

1.- Hemoglobina

La hemoglobina es una proteína conjugada, de masa molecular 64.000 g/mol (64 kDa),

de color rojo característico. Se encuentra en los eritrocitos, transporta el oxígeno a través
de la sangre arterial hacia los tejidos, transporta mediante la sangre venosa el dióxido de
carbono desde los tejidos hasta los pulmones para eliminarlo a través de la espiración.
También participa en la regulación de pH de la sangre como amortiguador por la
presencia de la histidina quien presenta el grupo imidazol con capacidad de disociación de
pKa de 7,0, este valor varía cuando la hemoglobina está con el oxígeno o no.

La sangre se encuentra en dos estados (tenso) como HbH, la disociación del grupo
imidazol tiene un pKa de 7,71 y el estado (relajado) como HbO2H cuyo imidazol tiene un
pKa de 7,16 es decir más ácido que la forma HbH. Dentro del eritrocito el pH es de 7,3 y la
oxihemoglobina se encuentra disociada en un 80% y el 20% como HbH no disociada. Ver
la siguiente ecuación química:

HbO2H H + + HbO2 –
H+
O2
Cuando se libera 100
Moléculas de O2 se forma: HbH

Por ejemplo si se le añade 60 moléculas de HCl estará, ingresando H+ libres extras, éstos
serán captados por la base conjugada transformándose en la forma ácida HbO2H, cuando
baja el pH a 6,1 es que se ha liberado 100 moléculas de el O2, pero no cambiaba el pH 7,3
mientras captaba 60% de los H+ extras, demostrando su poder amortiguador. Solo
cuando baja el pH, cuando libera el 100% de moléculas de O2, se transforma en HbH.

Otra forma de explicar la acción amortiguadora de la hemoglobina es que a pH 7, los

residuos de histidina de la superficie de la hemoglobina pueden aceptar un protón
adicional, ayudando así a mantener el pH sanguíneo; la His queda cargada positivamente.
Dicha His+1 puede interaccionar con los grupos carboxilato de aminoácidos adyacentes,
formando un puente salino.

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2. Bicarbonato

El sistema bicarbonato (HCO3-/H2CO3) se usa en el diagnóstico y tratamiento de los

estados patológicos porque es el amortiguador que se encuentra en mayor cantidad en el
líquido extracelular. El pH de la saliva se encuentra en el rango de 5,5 a 6,4 su
regulación principalmente es por la presencia de iones sodio y bicarbonato.
El pK funcional del sistema de bicarbonato es 6.
El origen del CO2 es de los procesos de oxidación de los nutrientes. El CO 2 disuelto es
hidratado a H2CO3 en una reacción reversible y muy eficiente catalizada por la anhidrasa
carbónica:

CO2 + H2O AC H2CO3

H2CO3 AC HCO3 - + H+
_____________________________
CO2 + H2O AC HCO3 - + H+

Todo el CO2 disuelto es considerado como H2CO3

La concentración de CO 2 disuelto de penderá de su constante de solubilidad y de la
presión parcial de CO2 . La Constante de solubilidad del CO2 es 0,0301

Aplicando la ecuación de Henderson-Hasselbalch al tampón bicarbonato:

pH = pKa + log [base conj]/ [ácido]

pH = pK + log [HCO3- ]/CO2diluido o

pH = 6,1 + log [HCO3 -] / (0,0301x PCO2

El PCO2 es 40 mmHg.

El contenido total de CO2 sería igual al CO2 disuelto más el HCO3 - , esto es:
CO2Total = CO2 diluido + HCO3-

La relación NaHCO3-:H2CO3 en sangre a pH 7,4 es 20:1

pH = 6,1 + log 20/1

pH = 7,4

El organismo puede reducir la concentración de H 2CO3 por medio de la reacción catalizada

por la anhidrasa carbónica:
H2CO3 CO2 + H2O. El CO2 es expulsado por los pulmones.
3. Fosfato:

En el organismo humano el par Na2HPO4/NaH2PO4 es el amortiguador cuyo pKa es del

ácido H2PO4- es 7,21.
La relación de los componentes es de 3,55:1, la concentración es 2mEq/L a nível de
plasma sin embargo en el líquido intracelular es mayor, calificado como el amortiguador
de las células y de los huesos.

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En la orina el rango de pH puede estar entre 4,6 a 7,9 siendo el principal sistema
amortiguador el fosfato HPO4 -2 aunque también se forma el sistema amoniaco
NH3/amonioNH4, producido a partir del amoniaco liberado en el riñón a partir de la
Glutamina.

II.- CAPACIDADES
 Prepara soluciones buffer de fosfatos para mantener el pH en un trabajo
biológico in vitro

III. MATERIALES Y REACTIVOS

1. Reactivos
Soluciones molares de ácidos y bases adecuadas para preparar una solución buffer
con el pH de 7,4 para trabajar la acción catalítica de enzimas transaminasas; buffer
de pH 2,5 para comprobar la acción catalítica de la peptidasa y otro de pH 6,5 para
aislar una enzima amilasa.

IV. PROCEDIMIENTO:

Use usted el link: https://phet.colorado.edu/sims/html/ph-scale/latest/ph-scale_en.html

Prepara de cada buffer un volumen total de 500ml.

V.- RESULTADOS:

1.- Qué cantidad de ácido y base requieres para cada buffer, hágalo mediante un cuadro
2.- Cuál es la función del ácido y de la base?
3.- Qué tipo de amilasa se trata?
4.- Cómo probaría la catálisis de cada una de ellas?
5.- Qué necesita para graficar la catálisis de estas enzimas según Michaeles Menten

vI. Escriba la bibliografía consultada según normas APA, ultima versión