CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

EL MICROSCOPIO

1. CONCEPTO

2. HISTORIA.

3. TIPOS DE MICROSCOPIOS

4. DESCRIPCIÓN DE LOS ELEMENTOS DE UN MICROSCOPIO

5. PROPIEDADES ÓPTICAS DEL MICROSCOPIO

6. MANEJO DEL MICROSCOPIO

7. MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO

8. MONTAJE DE PREPARACIONES

9. ACTIVIDADES DE MICROSCOPÍA

1.- CONCEPTO

MICROSCOPIO: Es todo instrumento capaz de

producir imágenes ampliadas de objetos más
pequeños y que permite la observación de
mayores detalles de los posibles a simple
vista. El microscopio más simple es una lente
de aumento o un par de anteojos.

El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos
separados estos deben estar como mínimo a esa distancia.

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2.- HISTORIA
El microscopio se inventó, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por Jansen, en opinión de
los holandeses. La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de la
"Accademiadei Lincei" una sociedad científica a la que pertenecía Galileo y que publicaron un
trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de una abeja.

Sin embargo las primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopia aparecen en

1660 y 1665 cuando Malpighi prueba la teoría de Harvey sobre la circulación sanguínea al observar
al microscopio los capilares sanguíneos y Hooke publica su obra Micrographia.

A mediados del siglo XVII un comerciante holandés, Leeuwenhoek, utilizando microscopios simples
de fabricación propia describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos
rojos.

Durante el siglo XVIII el microscopio sufrió diversos adelantos mecánicos que aumentaron su
estabilidad y su facilidad de uso aunque no se desarrollaron mejoras ópticas.

Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del
microscopio y por encargo de Carl Zeiss mejora la microscopía de inmersión sustituyendo el agua
por aceite de cedro lo que permite obtener mayores aumentos.

A principios de los años 30 se había alcanzado el limite teórico para los microscopios ópticos no
consiguiendo estos, aumentos superiores a 500x o 1000x sin embargo existía un deseo científico de
observar los detalles de estructuras celulares (núcleo, mitocondria... etc.).

El microscopio electrónico de transmisión (TEM) fue el primer tipo de microscopio electrónico

desarrollado, este utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo
aumentos de 100.000x. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931.
Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM).

3.- TIPOS DE MICROSCOPIOS

Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico.

• En el microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes

que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. Los microscopios de este
tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamaño original. El límite lo
tienen en unas 2000 veces.

• El microscopio electrónico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo

electromagnético.

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3.1.- MICROSCOPIOS ÓPTICOS

MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO

• El cono de luz visible enfocado sobre el objeto, es recogido por la lente del objetivo. El campo
aparece intensamente iluminado y los objetos en estudio aparecen más oscuros que el campo.
Por ello también se le llama “microscopio de campo brillante”.

• Como la mayoría de los especímenes biológicos observados son transparentes, el contraste

entre el medio y lo observado es nulo. Esto se soluciona tiñendo la muestra o utilizando las
distintas técnicas microscópicas de contraste que veremos a continuación.

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

• Es un microscopio óptico ordinario cuyo dispersados por los objetos en estudio. A

sistema condensador ha sido modificado causa de esta disposición, la muestra
para dirigir la luz a la preparación desde aparece iluminada sobre un fondo oscuro.
los lados. Esto se consigue con un
diafragma de campo oscuro, que tiene un
disco opaco que obtura la parte central
del disco de luz, de tal modo que sólo la
luz dispersada por la preparación pasa al
ocular y se hace visible.

• Ningún Haz de luz llega directamente al

objetivo desde el condensador, sino que
sólo aquellos haces de luz que son

• La microscopía de campo oscuro hace posible la observación en estado vivo de partículas y

células que de otra manera estarían por debajo de los límites de resolución del microscopio
óptico, aunque resulten visibles pocos detalles estructurales. La microscopia de campo oscuro
ha sido ampliamente usada en el estudio de pequeñas células móviles tales como Treponema
pallidum.

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MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES

• Es un microscopio óptico modificado que permite contrastar sustancias de diferente grosor o

densidad. Pone de manifiesto diferencias en las células y en sus estructuras.

• Mediante un diafragma y un objetivo especial se controla la iluminación de tal manera que vaya
en diferentes rutas a través de las distintas partes de una célula. El resultado es una imagen con
diferentes grados de brillo y oscuridad. Con este método, el material denso aparece brillante,
mientras que las partes de la célula que tienen una densidad cercana al H2O (citoplasma)
aparecen oscuras.
- Se utiliza un diafragma anular que es un diafragma que sólo deja pasar la luz a través de una
línea circular, que produce un cilindro de luz hueca. La preparación es iluminada por este
cilindro de luz hueca.
- El objetivo lleva añadida una lente anular que enlentece los haces de luz procedentes del
condensador

• Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar
microorganismos. Examen de material vivo no teñido y para muestras fijadas. Se aconseja su
utilización para el recuento de plaquetas y el estudio del sedimento urinario.

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MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

• Recibe el nombre de fluorescencia la propiedad que poseen determinadas sustancias

(sustancias fluorescentes) de absorber luz de determinada longitud de onda y remitir luz de
longitud de onda mayor (menor energía). En concreto, absorben luz UV y remiten luz visible
que, a diferencia de la anterior, es captada por el ojo humano, por lo que se observarán puntos
fluorescentes sobre fondo oscuro.

• Sus componentes básicos son una fuente

de luz que emite en una banda de
longitudes de onda desde el ultravioleta al
infrarrojo, a continuación del cual se
encuentra un filtro que delimita la banda
de excitación (selecciona la longitud de
onda que absorbe el compuesto
fluorescente que va a observarse),
seguidamente encontramos la muestra
fluorescente, y después de ella un
segundo filtro (filtro de emisión) que
selecciona la longitud de onda que emite
el compuesto fluorescente y no deja pasar
la radiación ultravioleta no absorbida.

• La microscopía de fluorescencia puede ser:

-Primaria: la propia muestra posee fluorescencia. Vitamina A, la tiamina y la

riboflavina.

-Secundaria: Muestra marcada con colorantes fluorescentes: fluorocromos, como

por ejemplo auramina o naranja de acridina.

• En microscopía de fluorescencia se emplea un tipo especial de líquido de inmersión (glicerina)

cuando se utiliza el objetivo que requiere su uso.

• El principal uso de la microscopía de fluorescencia es la inmunofluorescencia, que tiene como

fin detectar reacciones inmunológicas, es decir, reacciones de anticuerpos con antígenos. En
ella los anticuerpos se hacen fluorescentes por conjugación química con un colorante
fluorescente, y cuando se combinan con el antígeno específico éste se hace también
fluorescente, pudiendo descubrirse la combinación fluorescente al microscopio. Los
fluorocromos más empleados para marcar Ac son la fluoresceína, la rodamina y la ficoeritrina.

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MICROSCOPIO INVERITIDO

 Como su nombre lo dice un microscopio

invertido está al revés comparado con un
microscopio convencional. La fuente de
luz y el condensador están sobre
la plataforma apuntando hacia abajo. Los
objetivos están debajo de la plataforma
apuntando hacia arriba.

 Se utilizan para observar el crecimiento de

los cultivos.

3.2.- MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS

El desarrollo del microscopio electrónico es

uno de los mayores descubrimientos
científicos de este siglo.

El microscopio electrónico tiene la ventaja de

su extraordinaria amplificación, con un poder
de resolución hasta 1000 veces mayor que el
del microscopio óptico; ello es debido a que
emplea, en lugar de un haz de fotones, un haz
de electrones que tiene las propiedades de
una onda electromagnética de muy corta
longitud de onda.

El inconveniente es su alto coste, por lo que

son muy pocos los laboratorios que pueden
aplicar estas técnicas.

Existen dos tipos de microscopio electrónico:

- Microscopio electrónico de transmisión.

- Microscopio electrónico de barrido.

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MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN

• El haz de electrones atraviesa el material que se quiere observar.

• Un campo electromagnético actúa sobre un haz de electrones de forma similar a la acción de

una lente de cristal sobre un haz de fotones, formándose la imagen sobre una pantalla
fluorescente, como la pantalla de un televisor. La fuente de electrones es generalmente un
filamento de tungsteno.

• El haz de electrones se hace pasar a través de la muestra en estudio, como resultado al pasar el
haz emergente a través de unas lentes electromagnéticas se forma una imagen amplificada.
Una lente proyectora lleva la imagen a una pantalla de material fosforescente que brilla al
recibir el impacto de los electrones. Debajo de ésta va situada una cámara para fotografiar la
imagen.

• Las películas de muestra han de ser delgadas y además deben estar libres de materiales que
dispersen o absorban electrones.

• Como la movilidad de los electrones se ve impedida por el aire, es necesario mantener el vacío
en el interior del microscopio, por tanto no pueden estudiarse procesos fisiológicos.

• Las técnicas de preparación más usadas: tinción negativa, microtomía y congelación.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO

• Opera de forma totalmente distinta al microscopio óptico.

• Los electrones inciden desde arriba sobre la superficie de las preparaciones.

• Las técnicas preparatorias son principalmente: secado por congelación y secado por punto
crítico. Después se recubre la muestra con una capa de metal (oro o platino) que emiten
fácilmente electrones secundarios.

• Al irradiar la muestra con un haz muy pequeño de electrones, la muestra desprende electrones
secundarios (de baja energía) que pueden ser recogidos por una placa cargada positivamente.
Las señales emitidas se registran en un monitor de TV.

• Tiene menor resolución que el microscopio electrónico de transmisión pero nos ofrece
imágenes tridimensionales.

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4.- ELEMENTOS DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO

4.1.- DESCRIPCION PARTE MECANICA

 Soporte y Brazo

Pie pesado que sostiene un brazo inclinado del que sale el tubo del microscopio y la platina.

 Tubo

Soporte de la parte óptica. En su parte superior lleva el porta-oculares y en la parte inferior el

revólver (porta-objetivos).

 Portaoculares
 Portaobjetivos
 Platina
• Pieza central donde se colocan las preparaciones a observar.

• Posee una estructura central y circular por donde pasan los rayos luminosos.

• Normalmente las platinas están dotadas de 2 movimientos perpendiculares entre sí. Para
ello dispone de mandos o tornillos para desplazamiento.

• Algunas platinas tienen incorporadas dos escalas graduadas tipo nonius. La lectura de los
nonius permite medir longitudes en las dos dimensiones y determinar, exactamente, la
posición de cualquier punto de la preparación.

Representación de una escala provista de carro móvil graduado:

p = escala principal

s = escala secundaria

En la figura podemos apreciar que el «0» de la escala «s» está situado entre 12 y 13 mm. de
la escala «p». Para realizar la lectura, hay que buscar un valor en el que «s» y «p» estén
totalmente alineados; este valor lo encontramos en la división 20 de la escala «P» que está
alineado con la división 8 de la escala «s» equivalente a 0,8 mm. Por lo tanto, la lectura será:

- escala principal 12 mm.

- escala secundaria 0,8 mm.

Es decir 12,8 mm.

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 Tornillos Macro y Micrométrico

El movimiento relativo de tubo y platina se consigue mediante dos tornillos, uno de movimiento
rápido o macrométrico y otro de movimiento lento o micrométrico, dispuestos generalmente de
forma concéntrica en la parte inferior del brazo.

4.2.- DESCRIPCION PARTE OPTICA

ILUMINACION

 Interruptor y potenciómetro

Suministran la corriente eléctrica y regulan la potencia de la misma, y por tanto la intensidad de

la luz.

 Fuente luminosa

Suele consistir en una lámpara eléctrica incorporada a la base del microscopio. En aparatos muy
simples o antiguos esta fuente puede ser independiente del microscopio, y entonces lleva un
espejo incorporado.

 Condensadores

• Los condensadores concentran la luz sobre el objeto situado en la platina del microscopio.
Suelen construirse con dos lentes que han de estar bien corregidas y poseer la misma
apertura numérica que los objetivos con los que van a usarse.

• Hay distintos tipos de condensadores: condensador de Abbé, acromáticos, de campo

oscuro, etc.

 Diafragma

• Los condensadores generalmente llevan acoplado un diafragma, que es un dispositivo

ajustable que regula el cono de luz que pasa a través del objeto y los filtros.

• El diafragma tiene una palanca que se desplaza para abrirlo o cerrarlo. Este diafragma se
denomina tipo iris porque su apertura y cierre produce un efecto similar al del iris del ojo.

• Diafragma de campo: Es un anillo situado a nivel de la fuente de luz que permite regular el
área de la muestra que es iluminada.

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AMPLIACION

 Objetivos

• Los objetivos son tubos con un sistema de lentes en su interior que generan una imagen
invertida del objeto.

• Según su empleo, los objetivos se clasifican en:

 Objetivos secos: se utilizan directamente y lo único que se interpone entre la

lente y el objeto es el aire.
 Objetivos de inmersión: necesitan un líquido entre la lente y el objeto; el más
utilizado es el aceite de cedro, que posee un índice de refracción igual que el
vidrio.

• Se adaptan al tubo del microscopio mediante una pieza adicional llamada revólver, que
suele llevar 3 o más objetivos intercambiables.

• El aumento que producen se indica por 4x, 10x, 40x, 100x. Los tres primeros son objetivos
secos y el de 100x es de inmersión.

• Los distintos aumentos que podemos encontrar en los objetivos están codificados por un
anillo de color que indica el aumento.

 Oculares

• Los oculares son lentes que amplían más la imagen formada por el objetivo. Su amplificación
es constante, de forma que cuanto mayor es la distancia entre el objetivo y el ocular
(longitud óptica del tubo) mayor es la amplificación.

• El aumento que producen se indica por 10x, 16x

• Los primeros microscopios eran monoculares, pero en la actualidad la mayoría de los

microscopios utilizados en los laboratorios clínicos son binoculares, lo cual requiere un
sistema de prismas que desdoblen los rayos luminosos.

• También existen de doble cabezal, para observar la muestra dos personas a la vez.

Otros accesorios

• Actualmente la informática y la electrónica han entrado de lleno en el mundo de la microscopía

con el uso de accesorios como cámaras fotográficas, monitores (en blanco y negro y en color),
cámaras de video, etc.

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EN LA SIGUIENTE IMAGEN LOCALIZAR LOS DISTINTOS ELEMENTOS DEL

MICROSCOPIO:

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5.- PROPIEDADES OPTICAS DEL MICROSCOPIO

5.1. AUMENTO DEL MICROSCOPIO

 Es la relación entre el tamaño de un objeto y la imagen obtenida en el microscopio.

 Es función del objetivo y del ocular, según la capacidad de amplificación de ambas lentes.

Aumento total = Aumento del objetivo  Aumento del ocular

5.2. CONTRASTE

 Oposición o diferencia notable que existe entre dos cosas.

 El contraste se basa en la absorción diferencial de la luz entre la muestra estudiada y el medio.
 Puede aumentarse, por ejemplo por procedimientos de tinción, mediante el microscopio de
contraste de fases y también disminuyendo el cono de iluminación que proviene del
condensador (ajuste del diafragma)

5.3. PODER DE RESOLUCION

 Es la capacidad de una lente para distinguir dos puntos adyacentes como distintos y separados.
 La distancia mínima entre dos puntos que pueden distinguirse uno de otro se conoce como
límite de resolución.
 El poder de resolución de un microscopio está en función de la longitud de onda de la luz que se
usa y de la apertura numérica, que es una característica del sistema de lentes.
longitud de onda(  )
Limite de resolución =
2 x apertura numérica

 La apertura numérica es una medida de la capacidad del microscopio de agrupar las

refracciones de la luz producidas por los finos detalles del objeto.
El valor de la apertura numérica es igual al producto del índice de refracción existente entre la
lente frontal y el objeto observado, por el seno de la mitad del ángulo máximo formado por los
rayos luminosos que penetran en la lente frontal del objetivo, a partir de un objeto puntiforme
situado en el eje óptico.
A.N. = n sen θ

o n es el índice de refracción del medio entre la muestra y la superficie frontal de la lente

objetivo.
 Con los objetivos secos n =1 (índice de refracción del aire).
 Con objetivo de inmersión n =1,56 (índice de refracción del aceite).

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o El ángulo θ depende del diámetro de la lente del objetivo.

 Se conseguirá mejorar el poder de resolución de un microscopio utilizando luz de longitud de

onda más corta y con un objetivo que tenga la máxima apertura numérica.

5.4. PROFUNDIDAD DE FOCO O DE CAMPO

 Es el espesor máximo de muestra que aparece enfocado a la vez (en una posición determinada
de la muestra)
 Es inversamente proporcional al aumento y a la A.N.

6.- MANEJO DEL MICROSCOPIO

Para la visualización de una preparación en un microscopio seguiremos la siguiente pauta:

1º. COLOCACION DE LA PREPARACION EN LA PLATINA

Bajar la platina del microscopio rotando el tornillo macrométrico y colocar la preparación sobre
la misma, sujetándola con las pinzas existentes para ello.

2º. AJUSTE DE LA ILUMINACION

Abriremos el interruptor y ajustaremos con el mando la intensidad luminosa de la lámpara.

Cuando utilicemos objetivo de inmersión, se colocará el condensador en la parte más alta y el
diafragma abierto.
Para la observación con objetivos secos, deberá bajarse el condensador y cerrarse el diafragma
según la apertura numérica del objetivo.

3º. AJUSTE DE LA DISTANCIA INTERPUPILAR

La ajustaremos moviendo los oculares hasta que se observe un sólo campo visual, al mirar
simultáneamente por ambos oculares.

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4º. ENFOQUE DE LA PREPARACION

 Seleccionar el objetivo. Siempre se empezará con objetivos de menor aumento.
 Con objetivos secos, se colocará con el tornillo macrométrico la preparación lo más próxima
posible al objetivo, pero sin tocar éste.
 Cuando se utiliza objetivo de inmersión se colocará una gota de aceite de cedro sobre la
preparación. Seguidamente, se subirá cuidadosamente la platina con el tornillo
macrométrico hasta tocar el aceite.
 A continuación, en ambos casos, mirando a través del ocular, se bajará muy lentamente la
platina con el macrométrico hasta enfocar, entendiendo por tal, la visualización de la
muestra a través del ocular. El enfoque se ajustará con el tornillo micrométrico.
 Accionando el revólver se puede pasar a la utilización de un objetivo de mayor aumento,
bastando para conseguir su correcto enfoque mover ligeramente el tornillo micrométrico.
 Moviendo la platina recorrer toda la preparación para realizar una correcta observación.

7.- MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO

• El foco de iluminación se mantendrá encendido exclusivamente durante el tiempo de
observación, evitando así el recalentamiento de la lámpara y la posible rotura de los filtros.

• Cuando no se usa el microscopio debe cubrirse con su funda.

• Si el microscopio va a desplazarse, deben quitarse los oculares, porque lo que les mantiene
en su posición es la gravedad.

• En este caso, se guardarán en los recipientes correspondientes y se taparán los huecos

dejados con los tapones existentes para ello, con el fin de evitar que entre polvo en el eje
óptico.

• Limpiar las lentes con papel para lentes, no usar otros materiales porque pueden rayar la
superficie. No es recomendable el uso habitual de disolventes como el xilol porque estos
líquidos pueden disolver el cemento que fija las lentes a la montura.

• Los oculares pueden quitarse y limpiarse, pero sin desarmarlos nunca para ello. El ocular
puede invertirse y usarse como lentes de aumento para examinar la superficie del objetivo,
que a menudo está sucia por retención de aceite de inmersión.

• La limpieza de las partes internas del microscopio debe estar a cargo de un técnico experto
en microscopía.

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8.- MONTAJE DE PREPARACIONES

• Para realizar una preparación microscópica, el material en estudio se coloca generalmente
entre dos láminas de vidrio. Una sirve de soporte, el portaobjetos o simplemente porta, y la
otra lámina sirve para cubrir el material, el cubreobjetos o simplemente cubre.

• Existen portas de muy distintos tamaños, pero los más utilizados son de 76 x 26 mm.Los
portas esmerilados, de bordes redondeados son los mejores, pero resultan caros.

• Los cubres son de vidrio muy delgado, de unos 0,17 mm de grosor; existen también de
distintos tamaños y formas. Los más corrientes son de 18 x 18, 22 x 22 y 22 x 32 mm. El
cubreobjetos se utiliza en las preparaciones húmedas, en las desecadas se coloca una gota
de aceite de inmersión encima de la muestra.

• Las preparaciones adecuadas para el examen microscópico pueden conseguirse mediante

dos técnicas generales:

- Preparaciones húmedas.
- Preparaciones de frotis (películas) desecados.
Preparaciones húmedas

Se obtienen colocando una gota de agua sobre el portaobjetos y realizar una suspensión
con el material a estudiar. A continuación cubrir con el cubre y observar.

Un tipo especial de preparaciones húmedas lo constituyen las preparaciones de gota

pendiente en las cuales se deposita una gota de la suspensión en el centro de un cubre,
sobre él se coloca invertido un porta excavado y se da rápidamente la vuelta a la
preparación.

Este tipo de montajes permiten la observación de organismos vivos suspendidos en un

líquido, también se utilizan para estudios de sedimentos frescos de orina, recuento de m.o.,
recuento de células sanguíneas (utilizando portas adecuados), etc.

• Preparaciones secas

Los pasos esenciales para obtener una de estas preparaciones son:

- Confección del frotis o película.

- Secado.
- Fijación.
- Coloración.
- Lavado y secado de la preparación antes de su observación.

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