HISTOLOGÍA Y BIOLOGÍA CELULAR

Profesor: Alejandro Curino

MICROSCOPÍA Y TÉCNICA HISTOLÓGICA

 MICROSCOPIOS
El poder de resolución del ojo humano, es decir la mínima distancia que tiene que haber entre dos puntos
para ser detectados como tales, es de 0.2 mm. El tamaño de la mayoría de las células está por debajo de
ese límite y por lo tanto se necesita el uso de MICROSCOPIOS para poder observarlas. La función de estos
instrumentos es ampliar una imagen de manera que la retina pueda resolver puntos que están a distancia
menores que ese límite.

Resolución del ojo en comparación con la de distintos

tipos de microscopios
Distancia entre dos puntos que puede resolverse con:

Ojo humano 0,2 mm

Microscopio óptico (MO) 0,2 μm

Microscopio electrónico de transmisión (MET) 1 nm

Microscopio de fuerza atómica 50 pm

Los microscopios ópticos (MO) utilizan la luz y pueden ser simples, si tienen un único sistema de lentes
(lupas), o compuestos cuando tiene múltiples sistemas de lentes. En general sistemas ocular y objetivo.
El microscopio óptico más común es llamado de campo claro, sin embargo existen otros tipos de
microscopio con sistemas ópticos distintos como por ejemplo el microscopio de contraste de fase, el
microscopio de interferencia diferencial de Nomarsky , el microscopio de fluorescencia y el microscopio
laser confocal.
 MICROSCOPIO OPTICO

Revolver y
objetivos Ocular

Macrométrico
Portaobjeto Preparado Cubreobjetos Micrométrico

Platina

Fuente de luz
Condensador
 MICROSCOPIO OPTICO

Marcha de los rayos de luz en el

microscopio óptico

Portaobjetos

Fuente
de luz
MICROSCOPIO OPTICO
La preparación de la muestra para su observación al MO de campo claro introduce artefactos, es decir
alteraciones que no estaban presentes en la célula o tejido original. Por eso es importante el
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE que permite observar células y tejidos no teñidos y células
vivas (en cultivo). Este microscopio, y el DE INTERFERENCIA DIFERENCIAL DE NOMARSKY en una
forma más compleja, utilizan el fenómeno de diferencia de fase que se produce cuando la luz
monocromática (un solo color – una única longitud de onda) atraviesa partes de la célula de diferente
grosor y por lo tanto de diferente índice de refracción (como se ve en la figura de abajo a la izquierda).

Luz incidente Fibroblasto vivo (en cultivo) observado con distintos tipos de MO
(verde) MO de campo claro MO de contraste de fase

Ondas en
fase

Célula
viva no Ondas fuera
teñida de fase
MO de interferencia diferencial MO de campo oscuro

En el MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO la muestra es iluminada lateralmente y solo penetran en el

objetivo los rayos de luz refractados por la célula, por eso esta última aparece como un cuerpo brillante
contra un fondo o campo oscuro.
Una molécula fluorescente absorbe la luz a una longitud de onda (color) y la emite a una longitud de onda
distinta. Esta última puede ser detectada por un MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA. Este microscopio
tiene un filtro que deja pasar la luz monocromática (de un solo color) para iluminar la molécula fluorescente
y un espejo que deja pasar solo la luz emitida por la molécula fluorescente de longitud de onda diferente (y
de un color diferente) como se puede observar en la figura. Usualmente las moléculas marcadoras
fluorescentes se utilizan ligadas a anticuerpos que reconocen proteínas y estructuras celulares específicas
(ver más adelante métodos inmunohistoquímicos e inmunocitoquímicos).

Lente
ocular
3 filtro elimina cualquier
fluorescencia distinta
del verde

2 Espejo refleja la luz de

longitud de onda
inferior al verde y deja
pasar solo la luz verde
1 Filtro deja pasar
Lente objetivo
solo luz azul

Esquema simplificado de la marcha de los rayos en un

microscopio de fluorescencia
Fotomicrografía obtenida con el microscopio de
fluorescencia. Se han utilizado tres marcadores
fluorescentes distintos: verde para los microtúbulos;
azul para los cromosomas y rojo para los
centrómeros.
El MICROSCOPIO LASER CONFOCAL también usa una óptica fluorescente como el microscopio de
fluorescencia pero además se caracteriza por iluminar fuertemente la muestra en un solo punto (foco) de
la misma, para lo cual utiliza un rayo laser y luego detecta solo la luz emitida por ese único punto, de allí
el nombre de confocal. El punto de iluminación se va moviendo en el mismo plano focal por lo que la
muestra va siendo barrida y se observa solamente ese plano.

La muestra La fluorescencia La fluorescencia

fluorescente es emitida por ese emitida por otros
Fotomicrografía obtenida con un microscopio laser
iluminada en un único mismo punto puntos de la
punto focal focal llega al muestra no confocal. Celulas de glioma (tumor del sistema
detector puede alcanzar nervioso) en cultivo. Se utilizó un marcador
el detector fluorescente rojo para los filamentos de actina y uno
verde para una proteína nuclear. Foto obtenida en el
Laboratorio de Biología del Cáncer (INIBIBB-
CONICET).
El MICROSCOPIO ELECTRÓNICO (ME) utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz. Como la
longitud de onda del electrón es 2000 veces menor que la longitud de la luz y como el poder de resolución es
proporcional a la longitud de onda, el límite de resolución es aproximadamente 200 veces menor que el de la
microscopia óptica. En lugar de lentes, como en la microscopia óptica, se utilizan electroimanes que guían al
haz de electrones. Ya que los electrones colisionan con las moléculas de aire la muestra debe ser colocada
en el vacío. La imagen se observa en una pantalla o se captura en una placa fotográfica. Existen dos tipos
de microscopios electrónicos, el de transmisión (MET) en el que los electrones atraviesan la muestra y el de
barrido (MEB). Fuente de
Fuente electrones
de luz

Lente o electroimán
condensador

Muestra

Lente o electroimán
objetivo

Lente
ocular Electroimán
proyector

Imagen Imagen vista

vista en pantalla o
directamente placa
fotográfica
Comparación de la marcha de los rayos de luz en un MO Microscopio electrónico de transmisión (MET)
(se muestra invertido) y el haz de electrones en un MET.
Las muestras son fijadas con glutaraldehído y tetróxido de osmio, luego se deshidratan y se incluyen en una resina plástica
especial. El tejido incluido en esta resina se corta con un micrótomo que usa cuchillas de diamante (cortes de
aproximadamente 50 nm). La tinción se realiza con metales pesado que al frenar el paso de los electrones dan un contraste a
la muestra. Las partes de la muestra que han absorbido o dispersado electrones debido a su mayor densidad, o a la adición de
metales pesados, se observan más oscuras ya que hay menos electrones que impriman la placa fotográfica.
Imagen del núcleo y parte del citoplasma de una célula obtenida
con el microscopio electrónico de transmisión (TEM)
En el microscopio electrónico de barrido (MEB) el haz de electrones es enfocado sobre la superficie de
la muestra y se detectan los electrones que son dispersados por dicha superficie. La superficie del
espécimen es cubierta con una capa de material pesado que dispersa mejor los electrones.

Generador o
cañón de
electrones

Electroimán
condensador

Electroimán
objetivo
Microscopio electrónico de barrido MEB
Electrones
dispersados

Espécimen o
muestra

Marcha del haz de electrones en un MEB

Imagen de glóbulos rojos obtenida con el

microscopio electrónico de barrido (MEB)
 Preparación del tejido para su observación con microscopia óptica
Tinción con hematoxilina y eosina de muestras fijadas con formalina
Fijación: La muestra de tejido tiene que sumergirse en el fijador inmediatamente después de extraerse de
un organismo para evitar su degradación (autólisis o autodigestión). El fijador conserva la estructura de los
tejidos de forma permanente para permitir el tratamiento posterior. Puede ser una sustancia química
individual o mezclas de ellas. El fijador mas común es la formalina (solución acuosa de formaldehído al
37% en diluciones variadas). Es importante que el tamaño de la muestra de tejido sea lo suficientemente
pequeña como para permitir la rápida penetración del fijador.

Deshidratación e inclusión Para poder

examinar una muestra al microscopio óptico
deben obtenerse secciones lo suficientemente
fina como para que las atraviese la luz (entre 5 y
10 μm). Para poder obtener estas secciones tan
delgadas el tejido deber ser infiltrado en un
medio de inclusión que le otorgue la rigidez
necesaria. Comúnmente se usa la parafina que al
ser un hidrocarburo no se mezcla con el agua.
Por ello el tejido debe ser primero deshidratado,
lo que se logra sumergiéndolo en una serie de
soluciones de alcoholes cada vez mas
concentrados hasta llegar a alcohol al 100%
(alcohol absoluto). Luego se sumerge la muestra
en xileno o tolueno que son miscibles tanto en
alcohol como en parafina para extraer el alcohol
antes de infiltrar la muestra con parafina fundida
(aproximadamente a 60°C, ver figura de la
derecha).
Formación del taco. la parafina fundida (líquida)
conteniendo la muestra su vuelca en un molde y se deja Molde y
solidificar a temperatura ambiente. El bloque de parafina taco
solida conteniendo el tejido se denomina taco.
Obtención de las secciones: el tejido contenido en el taco
esta listo para ser seccionado con el micrótomo
obteniéndose secciones delgadas que son montadas sobre
un portaobjetos de vidrio al que se ha añadido un adhesivo
(albúmina) que mantenga adherido del tejido.

Brazo móvil del

micrótomo
Taco

Cuchilla de
acero
Tira de
secciones

Secciones
montadas sobre un
portaobjeto
TINCION: el corte o sección en este estado es incoloro
por lo que debe ser teñido con colorantes. En este caso
hematoxilina y eosina. La hematoxilina es una solución
acuosa por lo que el tejido debe ser desparafinado e
hidratado para que el colorante pueda penetrar en él. El
portaobjeto con la sección de tejido adherida es
introducido en baño de xilol que disuelve la parafina y
luego en una serie de alcoholes de concentración
decreciente con lo que queda hidratado y listo para ser
sumergido en hematoxilina. Como la eosina es más
soluble en alcohol que en agua el tejido es deshidratado
nuevamente en una serie creciente de alcoholes y
teñido con la eosina. Finalmente es aclarado con xileno
o tolueno, se agrega un medio de montaje (bálsamo de
Canadá) y se cubre con un cubreobjeto de vidrio muy
delgado.
Los colorantes ácidos como la eosina tiene una carga neta negativa en la parte coloreada de su molécula
por lo que tienen afinidad por moléculas positivas (básicas) de la célula tales como los grupos amino de
las proteínas. Por eso las estructuras celulares que se tiñen con estos colorantes se denominan acidófilas,
es decir que tienen afinidad por los ácidos. En el caso particular de la eosina también se dice que son
eosinófilas.
Los colorante básicos tiene una carga neta positiva en la parte coloreada de sus moléculas por lo que se
unen con moléculas de la célula que tienen carga negativa (ácidas) tal como los grupos fosfato de los
ácidos nucleicos. Por eso las estructuras de la célula que se tiñen con estos colorantes se denominan
basófilas. La hematoxilina si bien no es estructuralmente un colorante básico se comporta como tal.

En la figura se observan tres cortes sucesivos del páncreas. En (a) se ha colorado solo con hematoxilina.
Obsérvese que los núcleos son basófilos. Esto se debe a que contiene ácido desoxirribonucleico (ADN).
El citoplasma, que suele ser acidófilo (eosinófilo), en este caso se ha teñido también con la hematoxilina
debido a que estas células sintetizan proteínas por lo cual tienen muchos ribosomas que a su vez
contienen ácido ribonucleico (ARN). En (b) se ha teñido solamente con eosina. Obsérvese que solo se ha
colorado el citoplasma debido a que contiene proteínas básicas. En (c) se observa una sección de tejido
teñida con ambos colorantes.
Resumen de los pasos necesarios para preparar un tejido para su
observación al microscopio óptico
 Con la misma técnica de preparación de los tejido para ser observados al MO pueden
realizarse otras tinciones con distintos colorantes.

Por ejemplo, durante el cursado veremos tejido tenidos con

el tricrómico de Masson. Como su nombre lo indica se
utilizan tres colorantes: la hematoxilina, que tiñe los núcleos;
el escarlata de Biebrich-fucsina ácida que tiñe de rojo el
citoplasma y el azul de anilina que tiñe de azul al colágeno.

Otra tinción que veremos durante el cursado tiñe tejidos

vegetales y utiliza los colorantes fast green que tiñe la
celulosa de las paredes vegetales y safranina que tiñe de
rojo la lignina de la paredes celulares de los vaso del xilema.

Ciertos colorante reaccionan con componentes celulares y tisulares que hacen que cambie su color
normal del azul al rojo o al purpura. Esta modificación de color se denomina METACROMACIA.
Los métodos INMUNOHISTOQUÍMICOS o INMUNOCITOQUÍMICOS se basan en el reconocimiento
específico de determinados componentes celulares y tisulares (antígenos) utilizando un anticuerpo (NOTA: los
anticuerpos son proteínas producidas por células del sistema inmune en respuesta a una proteína extraña denominada
antígeno a la cual se une específicamente).
Los anticuerpos utilizados pueden ser POLICLONALES o MONOCLONALES. Los primeros se obtienen inyectando el antígeno
a un animal (p. ej. conejo). Distintos clones de linfocitos B producen entonces anticuerpos contra distintas partes de la molécula
del antígeno (epitopes). Los monoclonales son producidos por células híbridas (hibridomas) producto de la fusión de un clon
único de linfocitos B y una célula plasmática tumoral. El clon de linfocitos B produce un único tipo de anticuerpo dirigido contra
un solo epitope. La célula tumoral otorga inmortalización celular y la capacidad de proliferar activamente. Por esto los
anticuerpos monoclonales son mas específicos que los policlonales.
Para reconocer una molécula determinada (antígeno) se utiliza un primer anticuerpo llamado primario. Luego
se reconoce este anticuerpo primario con un anticuerpo secundario específico para las moléculas de
anticuerpo de la especie animal en la que se obtuve el anticuerpo primario (ver figura abajo).

Anticuerpo dirigido
Anticuerpo obtenido contra anticuerpos
en conejo dirigido de conejo con un
contra el antígeno A marcador acoplado

Como se puede observar en la figura el anticuerpo secundario esta unido a un marcador que permite su
visualización.
Si se utiliza como marcador un colorante fluorescente, es decir una sustancia que absorbe luz ultravioleta
(UV) y emite luz con una longitud de onda dentro del espectro visible, la técnica recibe el nombre de
INMUNOFLUORESCENCIA y la observación debe realizarse con el microscopio de fluorescencia.

Inmunofluorescencia de células de glioma (tumor cerebral) mostrando los microfilamentos de actina en rojo y
los núcleos en verde. En este caso se utilizó faloidina, una molécula que se une directamente a la actina y
que esta unida a un fluorocromo o molécula fluorescente (rojo) y un anticuerpo primario que reconoce una
proteína (hemoxigenasa-1) que se quería demostrar que estaba en el núcleo. Este anticuerpo fue detectado
con un anticuerpo secundario obtenido en una especie animal distinta y unido a un colorante fluorescente
(verde). Foto obtenida en el Laboratorio de Biología del Cáncer (INIBIBB-CONICET).
Si el marcador es la enzima peroxidasa de rábano que convierte un sustrato incoloro en producto
coloreado insoluble que precipita en el sitio de la reacción, la técnica se denomina método de la
inmunoperoxidasa o INMUNOHISTOQUÍMICA.

Inmunohistoquímica de un carcinoma mamario utilizando un anticuerpo policlonal que reconoce la enzima

(hemoxigenasa-1). Las zonas donde se ha precipitado el sustrato insoluble, y que indican la presencia de
la enzima, se observan de color marrón. Izquierda: 10X. Derecha: 100X. Fotos obtenidas en el Laboratorio
de Biología del Cáncer (INIBIBB-CONICET).
Los órganos y estructuras biológicas son tridimensionales mientras que los
cortes histológicos sólo tiene dos dimensiones.