UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SÁN NICOLÁS DE

HIDALGO.
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA.

Optativa de Terminal Materiales II (Caracterización de los

materiales).

TAREA: “MICROSCOPIA CONFOCAL”.

Profesor:
Dra. MERCEDES GABRIELA TELLEZ ARIAS.

Integrantes: Matrícula:
María Luisa Gallegos lázaro 1343018J
Pedro Muñoz Pintor 1719076F
Jorge García Macías 1719074A
Geovanni Manuel León Chávez 1415896X

Sección: 01

Ciclo: 22-22

Morelia, Michoacán. 15 de junio de 2022

 MICROSCOPIA CONFOCAL.
Fluorescencia es el fenómeno por el cual una molécula, denominada fluorocromo
o fluoró foro, emite luz unos nanosegundos después de haber absorbido luz de
menor longitud de onda. Por ejemplo, el fluorocromo FITC emite luz verde tras
ser excitado con luz azul. Aparte de la posible auto fluorescencia que pueda
producir una muestra, la fluorescencia proveniente de ésta corresponde a la
emitida por los fluorocromos utilizados en el marcado, en un rango que va desde
el azul al rojo lejano, según su espectro de emisión. La microscopia de
fluorescencia ha evolucionado de manera extraordinaria y se ha convertido en
una de las herramientas de investigación más utilizadas en biología y
biomedicina. El microscopio de fluorescencia confocal, también denominado CSM
(del inglés confocal scanning microscope), permite la adquisición de imágenes
digitales de alta resolución correspondientes a la fluorescencia producida en
distintos planos de foco (confocal), y produce secciones ópticas a lo largo del eje
z de una muestra marcada con uno o varios fluorocromos. La característica
fundamental que distingue a la microscopía láser confocal es que las imágenes
se producen punto a punto en el plano imagen a partir de los correspondientes
puntos de iluminación del plano de la muestra. Una fuente de iluminación puntual
ilumina una región del objeto y el detector puntual recibe la radiación de esta área
objeto. La imagen se construye por el barrido sincronizado de la fuente y el
detector. La gran calidad que presentan las imágenes resultantes se debe a la
omisión de toda la información óptica fuera de foco que degrada la imagen en la
microscopía convencional. La microscopia confocal es una de las herramientas
de investigación más utilizadas en biología y biomedicina. El microscopio
confocal (MC) permite seccionar ópticamente una muestra de forma no invasiva.
La reconstrucción tridimensional y el análisis de colocalización son las
aplicaciones más frecuentes del MC. La microscopia confocal fue inventada en el
año 1955 por el científico estadounidense Marvin Minsky al estudiar neuronas. Su
mecanismo, basado en el microscopio de fluorescencia hace posible la obtención
de imágenes de la arquitectura tridimensional de células y tejidos.

Principio de la microscopia confocal.

El microscopio confocal añade el principio de iluminar el espécimen punto por

punto y elimina la luz proveniente de los planos no enfocados. Para ello se
necesita una fuente de luz muy potente, así como también un filtro con un agujero
que se coloca en el trayecto del rayo de luz. Minsky lo logró con una lámpara de
arco de zirconio, pero en los microscopios modernos se emplea un rayo láser,
cuya longitud de onda puede estar disponible en un amplio rango de frecuencias.
La microscopía confocal utiliza como fuente de luz un láser para controlar la
profundidad de campo y un “pinhole” (colimador de orificio delimitante) para
eliminar la luz desenfocada, lo que permite la visualización de la imagen en un
plano horizontal simple.
En la siguiente imagen (1) se muestra como es el funcionamiento de un
microscopio confocal.

Imagen 1.- Esquema que muestra de manera simplificada el principio del

microscopio confocal y el trayecto de la luz. El rayo láser (luz azul) es filtrado por
un agujero y un espejo dicroico; luego es enfocado mediante un lente objetivo
sobre el espécimen y estimula la fluorescencia presente en el mismo (luz verde).
La fluorescencia es recolectada por el objetivo y dirigida al espejo dicroico que la
refleja y dirige hacia un detector. Un segundo filtro con agujero se coloca frente al
detector y sólo deja pasar la luz proveniente del plano de enfoque (línea
continua). La fluorescencia fuera de foco de las zonas que están por encima y por
debajo del plano de enfoque (en líneas discontinuas) no pasa por el agujero y por
lo tanto no formará parte de la imagen. La luz coherente del rayo láser es dirigida
por espejos hacia el espécimen (el cual ha sido previamente tratado mediante
marcadores fluorescentes) iluminándolo punto por punto y de manera seriada; la
fluorescencia resultante es medida también punto por punto. Para obtener la
información completa, el rayo láser debe ser desplazado por todo el espécimen
(en los planos x, y, z) y este proceso es lo que se conoce como escaneo o
barrido. Para reconstruir las imágenes a partir de los datos obtenidos, se emplean
programas de computación adecuados.

Configuración del microscopio confocal.

Los microscopios confocales constan de varias partes, las cuales son:

• La fuente de Luz: Generalmente emplea una fuente de luz muy poderosa (laser
o lámpara de arco). Se pueden utilizar sistemas de rayos láser multifrecuencia
(en el rango ultravioleta, luz visible e infrarroja) adaptados a los tipos de
marcadores fluorescentes empleados para el contraste de los elementos
celulares. Se han desarrollado dos técnicas, la de escaneo con un solo rayo
(laser) y el escaneo con múltiples rayos. La primera es la más popular y emplea
un par de espejos controlados por computadora para escanear el espécimen. La
técnica multi-rayos utiliza una lámpara de arco y el escaneo se realiza gracias a
un disco rotatorio (disco de Nipkow) conformado por microlentes y microagujeros.
Esta última técnica de iluminación disminuye el daño a los especímenes e
incrementa la detección.
• Sistema óptico: El sistema óptico de los microscopios está basado en los
principios fundamentales que se mantienen inalterados, sin embargo, están
complementados con los avances en óptica moderna y la tecnología electrónica.
• Filtros de interferencia: Incluyen espejos dicromáticos o dicroicos, barreras con
agujero de diámetro variable y diversos filtros de excitación (para seleccionar la
longitud de onda de excitación del fluorocromo).
• Detectores: Son fotodetectores muy sensibles a la fluorescencia emitida. Para
los microscopios con múltiples rayos generalmente se usan cámaras CCD
(charge- coupled device).
• Computadora: Configurada con los requisitos suficientes de memoria y
procesador, tarjetas de video de alta resolución, complementadas con software
de captura, análisis y procesamiento de imágenes, así como también de
impresoras de muy alta calidad.
En comparación a los otros tipos de microscopios, el microscopio confocal
proporciona un método altamente sofisticado y mejorado para obtener imágenes.
En la microscopía fotónica clásica el tejido debe cortarse finamente para ser
examinado y mientras más delgado sea, más nítida será la imagen; pero con este
método se pierde la información tridimensional durante el corte. Si una muestra
gruesa es observada al microscopio fotónico, la imagen que se enfoca se ve
contaminada por la superposición de los elementos del tejido que están fuera de
foco, tanto por encima como por debajo del plano enfocado; la imagen enfocada
se deteriora a causa de las estructuras superpuestas borrosas o no enfocadas.
Con el microscopio confocal estas limitaciones han sido superadas, ya que es un
instrumento que permite realizar cortes ópticos finos a muestras de tejidos más o
menos gruesos y realizar reconstrucciones en tres dimensiones a partir de cortes
seriados.

Imagen 2.- Micrografías comparativas entre las técnicas de fluorescencia con

iluminación convencional o de campo amplio (serie superior, a, c, e) y la
iluminación en microscopía confocal (serie inferior b, d, f). Nótese en la serie
superior la cantidad de señal (fluorescencia) que está fuera de foco y la
contrastante nitidez de las imágenes de la serie inferior en las cuales sólo se
obtiene exclusivamente la información del plano de enfoque. Las muestras de la
izquierda (hipotálamo de ratón) y centro (músculo liso de rata) fueron marcadas
con diversos fluorocromos (dobles y triples marcajes). Las imágenes de la
derecha corresponden a un grano de polen de girasol el cual es auto
fluorescente.

Si consideramos la imagen de un microscopio normal como algo parecido a mirar

a través de un libro transparente, donde se pueden ver imágenes de todas las
páginas solapadas, la microscopia confocal nos permitiría visualizar cada página
por separado (ver diagrama). Esto es útil para determinar la localización exacta
de estructuras celulares y objetos, como bacterias infectantes. Si se toman
suficientes imágenes de las piezas se pueden construir modelos tridimensionales.
Las imágenes deben teñirse con colorantes o anticuerpos fluorescentes o poseer
fluorescencia natural. Los colorantes son excitados a través de un haz de láser
(con una longitud de onda apropiada), emitiendo luz con una longitud de onda
inferior, la cual es detectada. La microscopía confocal permite obtener secciones
ópticas en profundidad que generan imágenes tridimensionales de la morfología
de una muestra. Esta capacidad es útil para medir perfiles de superficie y cuando
se acopla con la fluorescencia da una representación tridimensional de la
morfología interna de la muestra.

Cortes ópticos y reconstrucción 3D.

Con el microscopio confocal es posible obtener una imagen de un plano

determinado del espécimen. Esta imagen se denomina sección o corte óptico fino
y puede estar en el rango de 0.5-1.5 micrómetros. Se pueden obtener de una
manera no invasiva a partir de especímenes fluorescentes cuyo espesor puede
variar entre 50-100 micrómetros. Las imágenes se obtienen en una secuencia o
serie, de manera manual o mediante un sistema automatizado. Las imágenes 2D
(dos dimensiones) obtenidas a intervalos regulares siguiendo el eje óptico son
combinadas y utilizadas para recrear una estructura en tres dimensiones (3D)
mediante el empleo de software especializados.

Imagen 3 .- Secciones ópticas seriadas de un grano de polen de Pinus contorta.

Cada imagen fue obtenida a un intervalo de 3 micrómetros.
Aplicaciones del microscopio confocal.

Las aplicaciones de la técnica son muy numerosas principalmente dentro de la

ciencia biomédica: biología celular, biología molecular, fisiología, etc. Ya que
permite identificar y localizar componentes moleculares específicos con la
particularidad de que al no ser una técnica destructiva permite una observación in
vivo. En investigaciones en el campo de la biología celular y biomedicina es muy
útil para medir procesos dinámicos, realizar videos para capturar secuencias en
muy corto tiempo en células vivas y otras aplicaciones.
• Procesos celulares: Para medir actividades enzimáticas, reacciones de
oxidación, pH intracelular, fagocitosis, apoptosis, comunicaciones intercelulares.
Electrofisiología.
• Estudios de ADN y ARN.
• Morfología de organoides citoplasmáticos.
• Cirugía y otros métodos clínicos.
• Otras aplicaciones en el campo de la física, la química y en tecnología
alimentaria.

REFERENCIAS.

• Hartley G. Laboratorio de ciencias de la defensa y tecnología de laboratorio

(DSTL). Microscopia confocal.
• Scai|uma.es, microscopia confocal y ciltometria, extraído el 01 de diciembre de
2021 de https://www.scai.uma.es/areas/micr/mco/mco.html
• Samaniego R. Hospital general universitario Gregorio marañon. Aplicaciones de
la microscopia confocal. Madrid, España.
• Universidad de Alicante. Servicios técnicos de investigación. Microscopia
confocal. Extraído el 01 de diciembre de 2021 de
https://sstti.ua.es/es/instrumentacion-cientifica/unidad-demicroscopia/
microscopia-confocal.html
• La microscopia: herramienta para estudiar células y tejidos. Microscopia
confocal. Extraído el 01 de diciembre de 2021 de
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capit
ulo6_7.htm