I BLOQUE BIOQUIMICA II

Fecha 21/10/2019
Profesor Dr. Rafael Bonfante
Aidalys Serradas Carlos Valera
Desgrabadores German Lombo Olga Soteldo
Maria Sanchez Lucia Ruscica

Señalización mediada por Receptores Tirosina Kinasa

Hoy vamos a trabajar con algunas rutas de señalización que son disparadas por
estos Receptores Tirosina Kinasa y voy hacer mucho énfasis en la insulina, y
ustedes deben saber que el 30-40% que ven los internistas son Diabéticos,
incluso ellos deberían llamarse
Diabetologos.

Vamos a tener como ejemplo el

Receptor para Insulina, y vamos a
repasar unos conceptos, los
Receptores Tirosina Kinasa son
dímeros, cuyos monómeros están
disociados antes de que llegue él
señalizador, para ello este receptor
para insulina este dímero es
constitutivo, es decir ellos mantienen
su dimerización continuamente, y lo
que hace en el cambio
conformacional es acercar los dominios intracelulares que son tirosina kinasa para
que ocurra la transfosforilacion.

La transfosforilacion como lo
vimos lo que crea es una
plataforma para que ocurra la
señalización, ella genera residuos
de fosfotirosina donde se une esos
módulos de SH2 Y PTB, todas las
proteínas que tengan estos
módulos proteicos capaz de
reconocerse.

Receptores Tirosina Kinasa

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Entonces si ustedes ven aquí nosotros tenemos 3 formas de señalización de este

Receptor de insulina, uno que va a través de este adaptador que se llama IRS1 o
sustrato al Receptor de insulina que al unirse, al reconocer a través de su
módulo, fíjense que tiene dos módulos, uno capaz de reconocer a PIP3 que es el
módulo de plestrina y es capaz de reconocer al receptor, cuando el queda unido
acá, este receptor es un receptor tirosina kinasa y termina de fosforilar; ese
adaptador es fosforilado y esa fosforilacion permite entonces reconocer una serie
de proteínas adaptadoras.

Las más importantes en este sistema son GrB Y SOS, GrB directamente y SOS
tiene la propiedad de favorecer la activación de RAS y RAS es un punto central
en esta vía, de hecho se dice que RAS en todos son variantes son oncogénicas,
de echo mucho de los marcadores que le piden a los pacientes con cáncer es
verificar si hay mutación de ras, pero además de esta ruta que llevan a RAS y de
RAS a MAP Kinasas, también pueden haber rutas importantes.

Una de ellas es la de IP3 Kinasa, que tiene que ver con la expresión de
transformadores de glucosa en la membrana, y tiene que ver con la captación de
glucosa por la célula, posteriormente envía una (inaudible) de una protein Kinasa
que es PKB. Y fíjense que entre los residuos de estos receptores, tenemos
también por estos con los que se puede activar PKC.

Un punto central en las rutas mitogenica de RAS, si ustedes ven ahí Ras es una
superfamilia, y a su vez se clasifica en los que pertenecen al grupo de RAS
propiamente, el grupo de RO-Rak, la RAK, RAM y ERF así como el factor de
ribosilacion del ADP.

De RO-RAK, ya les hable

un poquito que tiene que
ver con la activación de
estos intercambiadores,
fíjense que ellos tienden a
ser GEF o GAP.

Aquí vemos como se llega

a la activación de RAS,
aquí puede ser a través de
todos estos adaptadores
que ya lo vimos, (inaudible
los anteriores) SOS, que
ya lo vimos o si no puede
entrar otra proteína

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adaptadora, que en este caso CHC todas ellas tienden a activar a RAS.

Aquí lo ve esquemáticamente, viene el receptor dimerizado, en este caso se une

CHC que es una molécula adaptadora, después que es fosforilado, ella es capaz
de unir en este caso al dimero GRB-SOS, Y este va entonces a activar a RAS,
sin embargo yo puedo prescindir de CHC y directamente el dímero SOS-RB se
une directamente al receptor y este directamente trabaja activando a RAS.

Para que RAS este activa

ella tiene que estar unida a
la membrana celular, si
RAS está en el citoplasma
soluble ella es inactiva,
porque la unión a la
membrana es loque
permite desplegar el sitio
catalítico, fíjense que la
forma activa es RAS unida
GTP, igual que la Proteína
heterotrimerica, solo que
esta es un solo monomero,
y para que RAS adquiera el
GTP, lo adquiere a través
de un intercambiador de nucleótidos, sale GDP y entra GTP.

Cuando ella está activa, la señal, la activación de Ras esta limitada por la actividad
GTPasa intrínseca de Ras que al igual que las proteínas G heterotrimericas tiene
esa propiedad. Y es acelerada por los GAP (proteínas activantes de la actividad
GTPasica de estas proteínas).

Entonces al fin y al cabo el tiempo, la vida media de RAS, es lo que determina la

calidad de efecto que va a tener.

Cuando se analiza la
actividad GTPasica de Ras
encontramos que la forma
activa esta unida a GTP.
Cuando GTP se une el forza o
tensa a la enzima, porque el
grupo fosfato tiene que
establecer interacciones con
la glicina 60 y la treonina 70.
Pero esta interaccion en los

Receptores Tirosina Kinasa

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llamados switch 1 y 2 es tensa ( en la diapostiva se ve como un resorte), esa

tension va a llevar a la ruptura del enlace fosfato para formar GDP y la enzima
adquiere una forma relajada.

Es decir la actividad GTPasica de Ras depende de la tensión intramolecular

generada por residuos de glicina 70 y treonina 36.

¿Ajá y porque yo me tengo que aprender eso? porque resulta que la mutación
de este y de este ( creo que hace referencia a los aminoácidos) son oncogénicos,
porque al no existir en esas posiciones esos aminoácidos no se puede transformar
el GTP en GDP y entonces la Ras permanece activa y esta mandando señales
mitogénicas de division celular todo el tiempo.

Aqui vemos un modelo bidimensional, que se lo tienen que imaginar

tridimensional, el sitio donde se une GTP es decir el sitio catalítico siempre todos
lo que son GTP tiende a ser estabilizados por magnesio para estabilizar las
cargas negativas.
Podemos ver glicina aca y treonina aca y aquí vemos los switches ( mostrando
esas estructuras con la diapositiva),aqui se ve de que depende la actividad
catalítica de la proteína Ras como GTPasa.

Esa tensión es beneficiosa porque hace que la vida del mismo sustrato sea muy
corta porque cuando la somete a tensión el va a provocar la hidrolisis del GTP en
GDP. En cambio si esa unión fuese relajada aaaaayy dura y dura dura y se
produce mas activación de la ruta mitogénica.

Este sistema es tan importante que existen las GAP y en realidad la GAP es una
coenzima es decir es otra enzima que ayuda a hidrolizar ese GTP porque el no
puede permanecer mucho tiempo ya que es extremadamente peligroso.

GAP y GEF
esquemáticamente que es
lo que ocurre a nivel
molecular, fijense aqui esta
el GTP, aqui tiene un
fosfato 2 y 3 que se
requiere hidrolizar el enlace
gamma o fosfato gamma y
tiene que salir y es una
hidrolisis osea que tiene
que entrar agua para que
eso pueda salir, en esa
parte en el sitio catalítico de
Ras, no los sitios
que generan tension, esta
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la lisina 16 y por este punto entra GAP y el tambien en su sitio catalitico tiene otro
aminoacido cargado positivamente que es la arginina 789 son positivas que hace?
ello generan una atracción electrostática muy poderosa sobre ese enlace, y eso va
generar tensión en el enlace y va a permitir que entre una molécula.

¿Porque creen que yo les pongo arginina 789 y lisina 16?, porque si eso está
mutado no hay transformacion de GTP en GDP,,

GEF ( factores intercambiadores de

nucleótidos de guaninas)
Aquí esta Ras con su swich 1 y su switch 2, aqui
esta GDP, y el dentro de esa proteina esta
estabilizado porque estos grupos fosfatos estan
altamente cargados positivamante y en el sitio de
union de GDP hay residuos cargados positivamente,
como son los residuos de amino, de glicina, y ellos
establecen una atracción para estabilizar, pero si vemos
en otra contraparte del dominio, aquí en este otro lado
cercano schit*(no se le entiende bien) 2 va a estar
cargado negativamente, es decir, está alanina, aspartico, glutamico. Esto llega como un
gran platillo volador y aterriza, ¿Qué hace? Mueve esto, al mover esto que está cargado
positivamente, suelta al GDP y las cargas se unen aquí y esto estabiliza, entonces GDP
sale, porque esta suelto.
Ahora les voy hacer una pregunta de físico-química sencilla ¿Por qué si GDP
sale GTP entra? Hablan no se entiende. Profesor: muy bien puede ser que tenga
más cargas negativas pero fíjate que yo quite la tracción que no estoy haciendo
competencia con este.

Andrea: usted lo acaba de decir doctor el Mg2+ cuando se une con el grupo
carboxilo se vuelve parcialmente positivo y va a estabilizar para que se pegue la
molécula.

Profesor: no, porque si GDP sale y hay un poco de cosas afuera que no sabemos
que es, si sale GDP ¿por qué? Pero si lo vemos estadísticamente ¿qué
probabilidad tentemos que reunir para que sea más probable que GDP
entre?

Las concentraciones de GTP mayor que la de GDP en la célula por lo tanto hay
mayor probabilidad que ocupe ese espacio vacío y por eso GDP no se une a RAS,
se genera en RAS, porque si fuera por eso nunca fuera probable que se dé.

El médico tiene que jugar mucho con estadística y probabilidades.

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El sale, vamos a suponer que esto estuviera vacio, y yo tengo 10 GTP y 1 GDP
¿Quién es más probable que ocupe este espacio? GTP, a eso me refiero que
la concentración de GTP es mucho mayor en el medio donde se encuentra este
complejo que la de GDP, es por eso que GDP se forma es intramolecular a partir
de GTP.

Bueno y ¿Qué hace RAS?, una vez activado activa las rutas de las MAPkinasas ,
esa ruta es una ruta central para entender los fenómenos proliferativos. Aquí
usted tiene a Racks activo unido a GTP y este activa a RAF, MAP viene de
proteína activada por mitógenos, mitógenos son herramientas farmacológicas que
utilizaron los científicos para inducir mitosis, ellos se dieron cuenta que los
mitógenos activaban a las MAPkinasas.

O sea que la primera kinasa que conocieron (cambia de idea) vamos a decirlo al
revés, MAP kinasa, kinasa, kinasa, que activa a RAF, RAF a su vez va a activar a
MAP kinasa, kinasa que se llama MEK, y esta MAPkinasa, kinasa se llama
MAPkinasa, kinasa.

Entonces esto que está aquí está involucrado en la fosforilación de proteínas para
activar esta proteína o en activar factores de transcripción o proteína involucrado
en fosforilar factores de transcripción y de esa manera cambia la expresión génica
en favor de la proliferación celular. Aquí lo vamos a ver con más detalles para que
se den cuenta. Fíjense que aquí tenemos:

RAF: MAP kinasa kinasa kinasa

Cuando está en su estado inactivo ella esta plegada, porque ella tiene un
dominio autoinhibitorio que solapa el sitio catalítico y además aquí hay una
proteína 14-3-3 que lo que hace es que termina de cerrar ese sitio catalítico.

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Cuando RAF interacciona con la membrana celular ella tiende a desplegarse

porque aquí ella va a interaccionar con RAS y con la membrana celular, eso
hace que ella se despliegue, al desplegarse, este 14-3-3 se va y queda expuesto
el sitio catalítico.
Como lo ven ahí, activation loop: asa de activación y asa catalítica ¿les recuerda
a quién? ¿Cuáles son los receptores con actividad enzimática? Receptores
Tirosina Kinasa. Ellos tienen un sitio
catalítico dentro y yo les explique cómo se
activa el sitio catalítico, es un asa que tapaba
que tenía que desplegarse para poder abrir.
Esa es el asa de activación.
La actividad full de RAF se consigue
cuando ella dimeriza es decir se quieren 2
RAS para activar un dímero de RAF. Ese
RAF una vez activado tiene actividad
Tirosina Kinasa, entonces él se autofosforila
y se activa. Esos sitios de fosforilacion
también permiten que interactúe con MEK.
MEK: MAP kinasa kinasa
El fosforila a MEK y este una vez activado va a interaccionar con ERK
ERK: MAP kinasa
¿Cómo se desactiva RAF? RAF se activa primero se despega, viene ERK le
hace unas fosforilaciones y eso permite que la fosfatasa, tanto PP1 como PP2
empiecen a desfoforilar los sitios, una vez desfosforilada ella puede ¿activarse?
(28:50).
Esa es la forma de ese ciclo que
tenemos de la activación de las
MAP Kinasa, vamos a
relacionarlo otra vez con la
cascada de insulina:
Recuerde que insulina además
de ser una hormona metabólica
que ayuda a regular los niveles
de glucosa ella es una hormona
trófica que regula la expresión
de genes metabólicos,
especialmente relacionado con
la glucogénesis, glucolisis y con

Receptores Tirosina Kinasa

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la síntesis proteica, quiere decir que ella debe ser capaz de activar esta .. (29:44) y
asi es, recuerden lo que vimos:
IRS-1 interacciona con el receptor, se fosforila, Grb, SOS, RAS, RAF, MEK, ERK
¿y qué pasa con ERK?, va al núcleo y en el núcleo él es responsable de fosforilar
los factores de transcripcion que se llama ELK-1, el forma un dimero con otro
factor de transcripción que es factor de respuesta sérica que a su vez es
fosforilado por otras proteínas kinasa.

Aquí lo vemos con más detalle

Este que está aquí es ERK, va al núcleo y allí va a trabajar con ELK-1 que
esta en rosado, lo fosforila, aquí está la otra protein kinasa que es la que se
va a encargar de fosforilar al factor de respuesta sérica que son estos 2 de
acá y están unidos a este elemento de respuesta en el DNA que es SRE.
SRE no es una proteína, es una secuencia de ADN que es reconocida
por este dimero.
¿Qué pasa? Ahí se regula y empieza la
transcripción de genes tempranos. Los
clásicos genes tempranos relacionados
con proliferación y trofismo son c-Fos y c-
Jun, ellos son factores de transcripción,
ellos están siendo sintetizados y vuelven
nuevamente a identificar los genes que
van a ayudar a transcribir, entre esos
genes (que c-Fos y c-Jun facilitan su
transcripción y su expresión) están las
ciclinas.

Al activarse las ciclinas la célula puede pasar de la fase S1 a la fase G1 y ahí

empieza el proceso de división celular , esto es para recordarles “ El profesor
habla sobre la Importancia de biología celular y como nos torturan “ Fíjense
que las células cuando están en reposo están en G0 , cuando están en presencia
de factores de crecimiento ella sale de G0 y se rompen las limitaciones para pasar
de G0 a la etapa S para la síntesis del ADN , para que ocurra este paso , es
necesario que se produzcan las Ciclinas , las Cdks los factores de
transcripción como e2f para que ocurra todo el fenómeno de síntesis de ADN y
de duplicación celular , acá les estoy relacionando esto con una ruta de
señalización que pacta directamente con la división celular. ahora , aquí
terminamos la ruta de las MAP, ahora veremos la ruta de las PI3K , si ustedes se
acuerdan primariamente de esta PI3k es capaz de reconocer los sitios de la

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fosfotirosina tanto en el receptor como en un adaptador , es decir que puede

unirse directamente al receptor o IRS fosforilada , esta unión lo que hace es
acercar a PI3K a la membrana celular y ahí reconoce a su sustrato que es PIP2 ,
lo fosforila y lo transforma en PIP3 , este PIP3 sirve como sitio de anclaje para las
proteínas que forman el signalosoma , en este caso es muy sencillo porque
implica dos proteínas señalizadores , PDk1 y Akt o Pkb, entonces PDK1 fosforila
a Akt también llamada Pkb , acá también puede recibir ayuda de una enzima
muy importante en procesos de trofismo proteico que es mtor , cuando ella se
fosforila full ella se disocia , que le va a pasar a PDK1 y Akt? Van dirigidos a las
vesículas con trasportadores de glucosa , esos transportadores se encuentran
adosados al citoesqueleto que los tiene reprimidos, entonces cuando se ejerce
un efecto inhibitorio a esta proteína AS160 esto favorece el intercambio de GDP
por GTP , Rab GDP , pasa a Rab GTP, y se expresan los transportadores GLUT-
4 en la membrana , al expresarse los trasportadores de membrana es lo que
favorece la entrada de glucosa en la célula , si la glucosa entra en la célula ,los
niveles de glucosa en sangre BAJAN , por eso se dice que la insulina es una
hormona HIPOGLICEMIANTE. . Por otra parte fíjense ustedes que esta misma
Pdk1 , puede potenciar la Cdks ciclinas por lo tanto se involucra en la
proliferación celular, por acá tenemos una variante de mtor que esta relacionado
con la activación de las proteínas , mtor es activado por akt y mtor promueve la
síntesis proteica que se necesita para pasar a la etapa S.

Germán : Osea que si yo tengo un paciente con diabetes mellitus tipo 2 es porque
tengo un daño en cualquier de esos mecanismos?

Profesor: Tiene menor , por eso es que usted me a un paciente diabético , por
ejemplo cuales son las características fenotípicas de un paciente tipo 1 , que no
produce insulina , son FLACOS , tienen retraso en el crecimiento y alteraciones en
el desarrollo psicomotor , la falta de desarrollo muscular es porque le cuesta
activar la síntesis proteica.

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**(40:12) Está hablando de la diabetes.

Si hay proliferación celular, ¿esas células pueden entrar en apoptosis o se

contrarresta la apoptosis? Se debe contrarrestar.

Porque una regula a la otra. Cuando yo no quiero que una célula prolifere y está
demás, la elimino con apoptosis.

Akt

Akt activa factores anti-

apoptóticos, por ejemplo:
Bcl-2, Bcl-XL.

Por otro lado, inhibe factores

pro-apoptóticos, por
ejemplo: Bad, Bax, p53.

Lo que aumenta la
supervivencia celular. Si yo
voy a proliferar, necesito que
la célula sobreviva más.

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Señalización Anti-Apoptótica.

Esta ruta es una ruta por PI3K.

Veamos unos detalles de la

regulación, porque PI3K es
activada por factores de
crecimiento, por Receptores
Tirosina-Kinasa.

Estamos hablando de
proteínas adaptadoras. Fijense
que PI3K es un dímero, tiene
varias variantes, por ejemplo;
Ahí está el peso molecular de
cada uno de los monómeros,
esta es p85 con p100.

La porción catalítica es la
p100, y la parte que reconoce los residuos de Fosfo-tirosina es p85.

Sin embargo, existen variantes de PI3K, que pueden ser activados por RAPG,
entre esos las Quimiocinas.

- B/y (Beta-gamma) interacciona con una subunidad, que es p101, para

activarse la porción catalítica.

Por esas dos vías puedo activar PI3K.

Que permite la transformación de PIP2  PIP3.

Hay otra enzima muy importante, porque es oncogénica, que es la fosfatasa, que
se llama PTEM.

Ella desfosforila al PIP3 y lo

transforma otra vez en PIP2.

Si esta fosfatasa no existe

PIP3 dura más tiempo en la
célula y me va a generar
activación del trofismo y de la
división celular.

Aquí está la Akt activa.

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Una de las proteínas pro-apoptótica más importante es Bad.

 Bad está unida a una proteína inhibitoria de la apoptosis.

Akt fosforila a la proteína inhibitoria de la apoptosis.

 Se libera y logra inhibir la apoptosis.

Por otro lado, al dejar fosforilada Bad, se une a una Proteína 14-3-3.

 Que favorece la ubiquitinación y la degradación de esas proteínas.

Las rutas tróficas pueden ser potenciadas, y eso va a depender que la célula sea
capaz de analizar esa señalización.

Vías Convergentes de la Regulación Génica

La ruta de las MAP Kinasas:

 Raf puede ser fosforilda

por PKC. La PCK es
producto de la activación
de la PLCy (gamma).
 La PLC genera IP3 que
depleta las reservas
intracelulares de Ca2+, lo
que hace que se libere
Ca2+.
 El Ca2+ no solo es
aumentado por la
liberación de IP3, sino por
el sistema ORAI.
 Eso permite reconocer a
Calmodulina, que a su
vez activa a Calcineurina, y esta desfosforila al NFAT.

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NFAT es otro factor de transcripción que activan en este caso, los genes de la
respuesta al Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF), es decir, se
produce angiogénesis.

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