ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS

Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de

músculo esquelético de pollo

PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.

Las proteínas se purifican mediante métodos de fraccionamiento que son
una serie de etapas independientes basadas en las diversas propiedades
fisicoquímicas de la proteína de interés y que se usan para separarlas
de manera progresiva de otras moléculas.
 ¿Para qué queremos purificar proteínas?
 Conocer secuencias de aminoácidos.

 Establecer relaciones evolutivas.

 Investigar la función biológica.

Establecer relaciones estructura-función.

Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas

GUÍA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA
• Definir los objetivos de la purificación
Pureza, actividad y cantidad.

•Definir las propiedades de la proteína de interés e impurezas.

PM, pI, solubilidad, estabilidad. Componentes que puedan dañar a
las proteínas (ej proteasas).

• Seleccionar la fuente de proteína.

Organismo, tejido, localización celular.

• Desarrollar una técnica de análisis.

Para una detección rápida de la pureza, actividad y/ o contenido
total de la proteína de interés.
•Minimizar el manejo de la muestra.
Evitar procedimientos largos para evitar perder actividad
biológica.

• Minimizar el uso de aditivos.

Usar lo mínimo necesario.

• Eliminar los contaminantes.

Por ejemplo, las proteasas.

• Usar una técnica diferente en cada paso.

Con el fin de aprovechar al máximo las características de la muestra
en el proceso de separación.

•Reducir el número de pasos.

Los pasos extra reducen el rendimiento e incrementan el
tiempo de purificación.
 Seleccionar la fuente de proteína
La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales
como:

a) la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se aísla la

proteína
b) la cantidad de la proteína de interés en el tejido y
c) cualquier propiedad peculiar de la proteína de interés, que ayudará en su
estabilización y su aislamiento.
Definir las Propiedades de la Proteína de Interés
• La información es útil para detectar la proteína a través de SDS-
Masa Molecular PAGE, también es importante cuando seleccionamos un método
de filtración en gel.

Punto • El conocer el valor del pI puede ser utilizado con diferentes

propósitos: precipitación isoeléctrica, selección de columna de
Isoeléctrico intercambio iónico, pH de trabajo.

• Afectada por temperatura, pH, fuerza iónica. Esto debe ser

Solubilidad considerado para evitar la agregación y precipitación de la proteína.
También útil para separación.

• Hidrofobicidad e hidrofilicidad de la muestra, para elegir una

Polaridad columna de interacción hidrofóbica.

• Ligandos útiles para separar la proteína por cromatografía de

Unión Específica afinidad.

• En términos de actividad, agregación y composición de

Estabilidad subunidades. Las características físicas y químicas de la proteína
son importantes a lo largo del proceso.
Técnicas de purificación/separación de acuerdo a las
propiedades de las proteínas
Características Procedimiento
1. Salting in
Solubilidad 2. Salting out
1. Cromatografia de intercambio
Carga iónica iónico
2. Electroforesis
1. Cromatografía de adsorción
Polaridad 2. Cromatografía en papel
3. Cromatografía en fase reversa
4. Cromatografía interacción
hidrófoba

1. Dialisis y ultrafiltración
Tamaño molecular 2. Electroforesis en gel
3. Cromatografía de filtración en gel
4. Ultracentrifugación
1. Cromatografía de afinidad
Especificidad de unión
 Fases de la Purificación
1. Fase I o fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y
estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los
contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de
la proteína. (Homogenización, centrifugación)

2. Fase II o fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría

de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos,
endotoxinas y virus. (Precipitación selectiva)

3. Fase III o fase de perfeccionamiento, la mayoría de las

impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que
están muy relacionadas con la proteína de interés y que se
encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es
logar la mayor pureza posible. (Métodos cromatográficos)
FASE I.
Homogenización, filtración,
Métodos de centrifugación
baja resolución

FASE II. Precipitación con sales, solventes,

temperatura o pH
Métodos de
baja resolución

Métodos cromatográficos:
filtración en gel, intercambio iónico,
FASE III. Métodos afinidad
de alta
resolución Métodos electroforéticos:
electroforesis no desnaturalizante,
desnaturalizante
Ruptura de la Célula
¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante?
ESTABILIDAD
Las proteínas se desnaturalizan fácilmente a temperaturas elevadas, aunque
algunas se pueden desnaturalizar a 25°C. La purificación de las proteínas debe
llevarse a cabo a 0°C o temperaturas cercanas.

MÉTODOS
•Suaves:
Lisis celular (choque osmótico)
Digestión enzimática (lisozima)
Lisis química (detergentes)
Homogenización manual
Molienda

Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína, pero no

aseguran su liberación celular.
Ruptura de la Célula
¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante?
ESTABILIDAD
MÉTODOS
•Moderados:
Homogenización con cuchillas
Molienda abrasiva
Congelamiento

•Vigorosos:
Ultrasonicación
Homogenizador Manton-Gaulin
Prensa francesa

Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas.

 Buffer de Lisis
Debe mantener las condiciones apropiadas para mantener e incluso mejorar la
estabilidad de la proteína.

pH Fuerza Iónica Aditivos

Mantener un pH en el
cual la proteína es
estable y se previene la
precipitación isoeléctrica.
Mantener una Son componentes que
concentración de sales previenen la degradación
adecuada para reducir las y mejoran la estabilidad.
pérdidas por Se deben agregar solo si
precipitación es necesario.
Aditivos
Fraccionamiento Celular:
Centrifugación Diferencial
• Eliminar contaminantes o clarificar la muestra
• Separación de los componentes con base en las diferencias en densidad,
tamaño y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína
es diferente.
• Partículas más grandes y pesadas migran más rápido.
Homogenización del tejido

Centrifugación Diferencial
Baja
Baja velocidad decentrifugación
velocidad de centrifugación
(1 000
(1 000g,g,10’)
10’)

Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación

media
(20 000 g, 20’)

Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación

alta
Tejido homogenado (80 000 g, 1 h)

Sobrenadante sujeto
a velocidad de
centrifugación
muy alta
(150 000 g, 3 h)
Pellet, contiene
células completas,
núcleos, membranas
plasmáticas

Pellet, contiene
mitocondrias,
lisosomas,
peroxisomas
Sobrenadante
contiene proteínas
solubles

Pellet, contiene microsomas

(fragmentos de RE), vesículas
pequeñas

Pellet, contiene ribosomas, macromoléculas

grandes
Remover contaminantes y/o
concentrar la muestra
Después de romper las células y estabilizar las proteínas, el
siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes
métodos:

Ultrafiltración

Precipitación selectiva
Precipitación selectiva
¿Qué propiedad de la proteína es
importante? SOLUBILIDAD
• Debido a que la proteína contiene varios grupos cargados, la solubilidad es
sensible a la temperatura, el pH, la fuerza iónica.
• Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir o incrementar la
solubilidad de la proteína.
• El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con
(NH4)2SO4.
Sin embargo, también hay otros métodos
Precipitación con solventes orgánicos.
Precipitación isoeléctrica.
Precipitación térmica.
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es
importante? SOLUBILIDAD
Log (S/S’)

Fuerza Iónica
Precipitación por salado
Solubilidad

Capa de
Hidratación Salting in
Salting out

Concentración de sal
Precipitación por salado
Salting in: La solubilidad de una proteína, a una
concentración baja de iones, aumenta a medida que se
incrementa la concentración de la sal.

Salting out: Las interacciones proteína-proteína se hacen

más fuertes que las interacciones proteína-disolvente y la
proteína precipita.

La concentración de sales requerida para alcanzar el efecto

de salting out varía de acuerdo a las características de la
proteína
Precipitación por salado
Concentración inicial de sulfato de amonio (%) Concentración final de sulfato de amonio (%)

Gramos de sulfato de amonio que hay que añadir a 1 L de solución

En la práctica
Purificación de la lactato deshidrogenasa 1.1.1.27
Investigar:
Propiedades de LDH de Gallus gallus
LDH A LDH B
Número de aminoácidos

Peso molecular (Da)

Punto isoeléctrico

Promedio general de
hidropaticidad (GRAVY)
Localización celular

Forma activa

Superfamilia

Tipo de enzima

Cofactor
¿Cómo vamos a purificar a la
LDH de Gallus gallus?

Importante: Anotar los volúmenes de las fracciones

 Homogenización

1) 100 g de pechuga de pollo troceado (sin grasa ni tejido conectivo)

2) Licuar en frío (3 Vol de Amortiguador por gramo de tejido, 3 pulsos/3 seg.)
3) Filtrar mezcla en gasa. Tomar fracción cero (F0)
4) Centrifugar a 7,000 rpm 4° C 10 min.
5) Decantar sobrenadante y tomar fracción 1 mL (F1)
6) Guardar fracciones a -20°C

Precipitación por salado

1) 25 mL del sobrenadante en vaso de pp.

2) Agitar en hielo y añadir lentamente 8.15 g de sulfato de amonio (55 % de
saturación)
3) Centrifugar a 4°C a 10,000 rpm 10 min.
4) Registrar volumen y tomar 1 mL fracción 2 (F2) Guardar a -20°C
5) Realizar segunda precipitación para llegar a 75 %, repetir pasos 2 y 3
6) Descartar el sobrenadante
7) Resuspender botón o pellet en 1 mL de agua
8) Distribuir en 3 tubos, uno de ellos con 1 mL. Guardar a -20°C