Levadura inmovilizada

Inmovilización de levaduras en perlas de alginato de calcio.

Objetivo

Proporcionar una introducción a las técnicas de la inmovilización celular y el estudio

cuantitativo de la fermentación.

Introducción

El encapsulamiento dentro del alginato de calcio es la técnica más utilizada para inmovilizar
células. Es especialmente adecuado para las células vivas, ya que tiende a no dañarlas. Las
aplicaciones de este método versátil incluyen inmovilización de células en biorreactores,
encapsulamiento de protoplastos de plantas y embriones de plantas ("semillas artificiales")
para micropropagación, inmovilización de hibridomas para la producción de anticuerpos
monoclonales, y el encapsulamiento de enzimas y fármacos (ver tabla).

Las células o enzimas para ser inmovilizadas primero se mezclan con una solución de alginato
de sodio. Esta luego se gotea en una solución que contiene cationes multivalentes
(generalmente Ca2 +). Las gotitas a medida que caen forman esferas, atrapando las células en
una rejilla tridimensional de alginato reticulado iónicamente.

Micrografía electrónica de células Inmovilizadas de levadura en alginato de calcio.Las cicatrices

de los brotes son visibles en algunos de las celulas.

Equipos y materiales

Necesitado por cada persona o grupo.

Equipo

• Jeringa de plástico de 10 ml (sin aguja)

• Vasos pequeños o vasos de plástico desechables, 2

• Frasco cónico de 250 mL.

• Tapón para encajar en el matraz, perforado para tomar un candado de fermentación.

• Bloqueo de fermentación

• Colador de té

• Varilla agitadora de vidrio

Materiales

• 4% de solución de alginato de sodio, 25 ml

• Solución de cloruro de calcio al 1.5%, 100 ml

• Levadura de panadería, seca, 2,5 g

• 8% de solución de sacarosa, 150 ml

• Solución indicadora universal, 1 ml, diluida con 1 ml de agua destilada o desionizada,

Nota Todas las soluciones deben estar preparadas con agua destilada o desionizada.de
alginato de sodio no es fácil soluble, y requiere tanto calor agua y agitación para disolverla.

Para medir el dióxido de carbono evolucionado (opcional).

Equipo

• Frasco cónico de 250 mL.

• Tapón, para colocar en un matraz cónico, perforado y equipado con un tubo de suministro.

• Cilindro de medición de 100 mL.

• vaso de 500 ml

Materiales

• 13% de solución de cloruro de sodio, alrededor de 1 litro.

(La sal de mesa ordinaria es adecuada)

Procedimiento

1 Mezclar la levadura seca con 25 ml de agua destilada en un vaso pequeño.

Cubrir y dejar rehidratar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

2 Añadir 25 ml de solución de alginato de sodio a la suspensión de levadura. Revuelva bien.

3 Absorba un poco de la mezcla de levadura / alginato en una jeringa.

Agréguelo, gota a gota, a la solución de cloruro de calcio.

4 Deje que las perlas de células de levadura inmovilizadas se endurezcan en la solución de

cloruro de calcio durante 5-10 minutos. El alginato será reticulada iónicamente por los iones
de calcio.

5 Separe las perlas de la solución con el colador de té.

6 Coloque las perlas en una solución de azúcar en un matraz cónico. Tapónar el matraz con un
tapón que ha sido equipado con una llave de fermentación. Si se agrega un indicador universal
a la llave de fermentación, el indicador cambiará de color a medida que se produce dióxido de
carbono.

OPCIONAL Medición de la producción de dióxido de carbono.

7 Tapar el matraz con un tapón al que se ha instalado el tubo de suministro.

8 Mantener el matraz a 21-25 ° C. Recoger el gas que se produce en una probeta invertida
sobre una solución al 13% de cloruro de sodio. El dióxido de carbono no se disolverá en esta
solución.
9 Registrar el volumen de gas que se ha recogido a intervalos convenientes. Grafica los
resultados en una gráfica, mostrando el volumen de gas evolucionado contra el tiempo.

Reglas de seguridad

La acumulación de gas en los recipientes de vidrio podría ser peligrosa. Asegúrese de que los
matraces estén adecuadamente ventilados.

Preparación y tiempo

Las células de levadura inmovilizadas se pueden preparar en 10-15 minutos. el alginato de

sodio tarda un tiempo en disolverse, por lo que es mejor preparar la solución antes de la
lección. Si desea almacenar la solución alginato de sodio por más de unos pocos días, es
recomendable autoclave. Para prevenir la despolimerización excesiva de las cadenas de
alginato, es aconsejable elevar el pH a 7-8 antes del autoclave.

Solución de problemas

Debido a que el alginato de sodio es difícil de disolver, puede ser útil dejarlo que el alginato se
disuelve durante la noche. Si desea hacer actividades adicionales que utilizan soluciones
tampón, tenga en cuenta que cualquier contenido que contenga el fosfato, el citrato o el EDTA
se debe evitar, ya que causarán la disolución de la matriz de alginato (El tampón 50 mM citrato
de sodio o fosfato a pH 7 se puede usar para recuperar células de las perlas).

Investigaciones adicionales

1 La levadura de panadería común, Saccharomyces cerevisiae, no puede fermentar el azúcar

lactosa. La enzima b-galactosidasa descompone la lactosa en glucosa y galactosa. Levadura que
es co-inmovilizado con esta enzima es capaz de crecer en un medio que contiene lactosa. De
los dos azúcares formados por enzima, la glucosa se utiliza preferentemente. Una vez que este
azúcar suministrado se ha agotado, la levadura ajusta su metabolismo y la levadura utiliza el
otro producto de la descomposición de la lactosa, galactosa. La actividad de la levadura se
controla fácilmente simplemente midiendo el volumen de gas (dióxido de carbono) que
evolucionó durante la fermentación.

2 Diferentes soluciones de azúcar, temperaturas de incubación o tipos de levadura, por

ejemplo, la levadura de los fabricantes de vino o panadería, puede ser comparada.