Identificacion Genetica de Bacterias Acido Lacticas Aisladas de Queso Adobera PDF

Identificación genética de bacterias ácido lácticas aisladas de queso... S. Gaytan Ramírez.
Revista Virtual Pro

ISSN 1900-6241
Bogotá, Colombia
info@revistavirtualpro.com
www.revistavirtualpro.com
2017
Samuel Gaytan Ramírez
Identificación genética de bacterias ácido lácticas aisladas de queso adobera
Instituto Tecnológico Superior de Arandas
Arandas, México
ISSN 1900-6241, No 191, Diciembre 2017 :: Calidad de Alimentos.
1
Identificación genética de bacterias ácido lácticas aisladas de

queso adobera
(Genetic identification of lactic acid bacteria isolated from adobera cheese)
Samuel Gaytan Ramírez

Instituto Tecnológico Superior de Arandas, Arandas, México
email: ing.samuel.gaytan@outlook.com
Resumen
En la región de los Altos de Jalisco (México), el queso Adobera es el de mayor demanda. Se elabora
con leche 100% de vaca y sin pasteurizar. Existen reportes escasos que describan cuales bacterias ácido
lácticas (BAL) se emplean en su elaboración, los reportes existentes presentan identificación por
métodos fenotípicos que son poco confiables para discriminar especies estrechamente relacionadas. El
objetivo de este estudio fue la identificación genética de 24 cepas de BAL aisladas de un queso
Adobera previamente identificadas mediante el sistema API 50 CHL. Las cepas fueron recuperadas en
gelosa MRS, se incubaron a 37 °C por 48 h. Se realizó la extracción de DNA genómico mediante
extracción de fenol-cloroformo con proteinasa K. Se hizo la amplificación del gen 16S rDNA con los
iniciadores 27f y 1492r. Se purificaron los productos de amplificación con el sistema comercial
Agencourt® AMPure® XP. Los amplicones purificados se enviaron al servicio de secuenciación con la
indicación de obtener la secuencia con el iniciador 27f. Se realizó un análisis bioinformático para
evaluar la calidad y la edición de secuencia, así como una reconstrucción filogenética de las cepas por
el método de parsimonia y 100 repeticiones de bootstrap. Solo se logró identificar 17 de las 24 cepas de
BAL, 16 correspondieron a Enterococcus faecium y 1 a Enterococcus gallinarum. La identificación
genética no coincidió con la identificación hecha con API, lo que concuerda con otros estudios. Es raro
el uso de este género en la elaboración de queso ya que es empleado como un microorganismo
indicador de contaminación fecal. El hecho de que las cepas fueran identificadas dentro del género
Enterococcus puede deberse a que es un queso elaborado con leche no pasteurizada, un insumo que
suele presentar el género Enterococcus según otros reportes.
Palabras clave: Enterococcus, gen 16S rDNA, BAL, queso Adobera, API 50 CHL secuenciación, fenotípicos.
Abstract
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In the region of Altos de Jalisco (Mexico), Adobera cheese is the most demanded. It is made with
100% unpasteurized cow's milk. There are few reports that describe which lactic acid bacteria (LAB)
are used in their elaboration, existing ones present identification by phenotypic methods that are
unreliable to discriminate closely related species. The objective of this study was the genetic
identification of 24 LAB strains isolated from an Adobera cheese previously identified by the API 50
CHL system. Strains were recovered in MRS agar, incubated at 37 ° C for 48 h. The extraction of
genomic DNA was carried out by extraction of phenol-chloroform with proteinase K. The
amplification of the 16S rDNA gene was made with primers 27f and 1492r. The amplification products
were purified with the commercial system Agencourt® AMPure® XP. The purified amplicons were
sent to the sequencing service with the indication to obtain the sequence with the primer 27f. A
bioinformatic analysis was performed to evaluate the quality and sequence edition, as well as a
phylogenetic reconstruction of the strains by the parsimony method and 100 bootstrap repetitions. Only
17 of the 24 LAB strains were identified, 16 corresponded to Enterococcus faecium and 1 to
Enterococcus gallinarum. The genetic identification did not coincide with the identification made with
API, which agrees with other studies. The use of this genus in cheese making is rare since it is used as a
microorganism that indicates faecal contamination. The fact that the strains were identified within the
genus Enterococcus may be due to the fact that it is a cheese made with unpasteurized milk, an input
that the Enterococcus genus usually presents according to other reports.
Keywords: Enterococcus, 16S rDNA, LAB, Adobera cheese, API system 50 CHL sequencing, phenotypic.
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Introducción
Las bacterias ácido lácticas (BAL), se han clasificado de diferentes formas, tanto por su capacidad de
crecimiento a diferentes concentraciones de sales y diferentes temperaturas, así como con base a sus
características morfológicas. Estas se clasifican como: bacterias Gram positivas; bacilos o bacilos
cortos; catalasa y oxidasa negativas; no esporuladas; no móviles; de acuerdo a la especie pueden ser
anaerobios obligados o anaerobios facultativos; pueden presentar un crecimiento óptimo en atmósferas
parciales de concentración de CO2 del 5 % a 37 ºC (Cabeza, 2006).
La clasificación más empleada de las BAL es con base al producto principal de la fermentación de la
glucosa, donde se consideran homofermentativas cuando el principal producto generado es el ácido
láctico; y cuando producen además en cantidades significativas etanol, ácido acético, ácido succínico,
entre otros ácidos orgánicos, se denominan heterofermentativas. El método de clasificación
considerado como el estándar para la identificación de este grupo es con base al análisis de la
información genética, contenida en la secuencia completa o parcial del gen ribosomal 16S rDNA, el
cual permite asignar una identidad confiable de los miembros de las BAL. Los principales géneros
bacterianos que conforman este grupo son: Leuconostoc, Lactobacillus, Pediococcus, Bifidubacterium,
Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus y Oenococcus (Ljung y Wadström 2009).
En la fabricación de quesos artesanales se emplean diferentes cultivos de BAL que proporcionan

ciertas características organolépticas; algunas de las más asociadas a las BAL son: sabor, color, olor y
textura, que presentan variaciones con respecto a las características de los quesos procesados
industrialmente. Los procesos tecnificados para la elaboración de quesos garantizan la inocuidad
mediante procesos como la pasteurización de la leche y el establecimiento de condiciones de limpieza y
aseo del equipo y del personal; sin embargo, en ocasiones los consumidores perciben la pérdida de
algunas de las características que poseen los quesos elaborados de forma artesanal que no controlan lo
antes mencionado. (Alvarado et al., 2007; Rodríguez et al., 2007).
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En el estado de Jalisco, México, uno de los quesos elaborados artesanalmente y, de mayor demanda, es
el queso Adobera en la región de los Altos de Jalisco, que se produce de forma artesanal a partir de
leche entera y de un 100% de vaca sin descremar y sin pasteurizar, por lo que se cataloga como un
queso fresco de pasta blanda ligeramente acidificada. Además, existe una demanda considerable en los
Estados de Guanajuato, Zacatecas e Hidalgo (Vicente, 2011; Cheese, 2012).
Gran parte de los estudios de identificación de BAL citados en la literatura son basados en métodos
miniaturizados como el API 50 CHL (bioMerieuxTM Inc., Francia), métodos automatizados como
VITEK (bioMerieuxTM Inc., Francia), con base a su morfología macroscópica y microscópica, criterio
de Cowan y Steel (1979) y pruebas bioquímicas complementarias basadas en la fermentación de
diferentes carbohidratos (Martínez et al., 2012).
En la literatura existen pocos estudios en relación a los quesos artesanales que describan de forma
confiable cuales son los miembros de las BAL que intervienen en el proceso de fabricación artesanal de
este tipo de quesos, en particular el queso Adobera. Los avances en las herramientas moleculares para
identificación genética de microorganismos han permitido la asignación de identidades más confiables
mediante el análisis de la secuencia completa o parcial del gen 16S rDNA, con el que se han logrado
una clasificación de las especies de BAL más precisa; lo que permite mejorar las mezclas de
microorganismos empleados en la elaboración de quesos artesanales (Ramos et al., 2009).
Objetivos
Objetivo general
Identificar genéticamente cepas de bacterias ácido lácticas aisladas de queso Adobera de la región de
los Altos de Jalisco, México.
Objetivos específicos
Identificar genéticamente cepas de bacterias ácido lácticas por el análisis de la secuencia del gen 16S
rDNA ribosomal.
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Conservar cepas de bacterias ácido lácticas mediante criopreservación y liofilización.
Hipótesis
Con la utilización del análisis de la secuencia del gen 16S rDNA ribosomal, se podrá realizar una
identificación más confiable de las bacterias ácido lácticas presentes en queso Adobera.
Alcance y Limitaciones del estudio
El alcance de este estudio será la identificación genética de BAL por medio de la secuenciación.
Las principales limitaciones que se presentaron para la realización de este estudio, son las siguientes:
● El tiempo establecido para la realización de los diferentes ensayos.

● Recopilación de la información de las cepas de BAL de la Colección de Microorganismos del
Centro Nacional de Recursos Genéticos (CM-CNRG).
● Entrega a tiempo de las secuencias por parte del servicio de secuenciación.
Métodos
Cepas de bacterias ácido lácticas
Se utilizaron 24 cepas depositadas por la Dra. Ma. Dolores Méndez Robles, responsable del
Laboratorio de Microbiología de Alimentos del Centro Universitario De Los Altos (CUALTOS), en la
Colección de Microorganismos del CNRG. Se solicitó la autorización para el uso de las cepas de BAL
aisladas de queso adobera. En el cuadro 1, se enlistan las cepas que fueron recuperadas para los
diferentes ensayos además de la identificación de las cepas por medio del método miniaturizado API 50
CHL.
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Figura 1: Esquema general de trabajo. Actividades a realizar para los diferentes ensayos. Adaptado de Centro Nacional de
Recursos Genéticos. México
Cuadro 1: Materiales biológicos utilizados en los diferentes ensayos.
Clave API 50 CHL Clave API 50 CHL

BAL-12 Leuconostoc lactis BAL-106 Lactococcus lactis ssp. lactis 1
BAL-25 Lactococcus lactis ssp. lactis 2 BAL-117 Lactobacillus curvatus ssp. curvatus
BAL-45 Lactococcus lactis ssp. lactis 1 BAL-122 Leuconostoc lactis
BAL-48 Lactococcus lactis ssp. lactis 1 BAL-129 Lactococcus ssp. lactis lactis 1
Lactobacillus delbrueckii ssp.
BAL-53 BAL-133 Leuconostoc lactis
delbrueckii
BAL-68 Lactobacillus curvatus ssp. curvatus BAL-151 Lactobacillus curvatus ssp. curvatus
BAL-77 Lactococcus lactis ssp. lactis 2 BAL-184 Lactococcus raffinolactis
BAL-100 Leuconostoc lactis
Fuente: Elaboración propia
Recuperación y re-identificación de bacterias ácido lácticas conservadas por crioconservación.
Las cepas de BAL de la CM-CNRG se encontraban crioconservadas en caldo MRS con glicerol al 20%
y almacenadas a -80 ºC. Las 24 cepas fueron descongeladas en un baño de agua a 37 ºC por 60 s, se
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tomó un inóculo de las suspensiones bacterianas con un asa de nicromo y se inocularon cajas de Petri
con gelosa MRS por la técnica de estría cruzada. Las cepas fueron incubadas dentro de frascos de
plástico en la cual se generó una atmósfera parcial de CO2 al 5% por extinción de flama de vela, se
incubaron 37 ºC por 72 h hasta observar un crecimiento óptimo.
Se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas: prueba de catalasa y oxidasa, tinción Gram para
observar la morfología microscópica, con un microscopio óptico para la re identificación de las BAL
por los criterios de Cowan y Steel (1979).
Conservación de BAL por criopreservación y liofilización
Se generó un abasto de biomasa de cada una de las cepas de BAL en gelosa MRS mediante la siembra
masiva en la superficie de los medios, los cultivos fueron incubados en las condiciones descritas
anteriormente. Se transfirió la biomasa a un tubo con solución salina fisiológica para ajustar a una
turbidez del tubo 7 del Nefelómetro de MacFarlan, se transfirieron 0.5 mL de la suspensión bacteriana
a un criotubo con 0.5 mL de caldo MRS más glicerol al 20 %, después se homogeneizó con la ayuda de
un agitador vórtex. Los criotubos fueron colocados en un baño de hielo por 2 h para equilibrar el
crioprotector, transcurrido el tiempo se congelaron a -20 ºC por 24 h, después de este tiempo se
almacenaron en un ultracongelador a -80 ºC.
Para conservar las cepas por el método de liofilización, se empleó el procedimiento que se describe a
continuación:
Se preparó un cultivo puro en gelosa MRS sembrado por estría masiva. Se transfirió la biomasa a un
tubo con solución salina fisiológica para ajustar a una turbidez del tubo 7 del Nefelómetro de
MacFarlán, se tomó 1 mL de la suspensión bacteriana y se adicionó dentro de un criotubo con 1 mL de
leche descremada al 20 % (solución de soporte) en viales para liofilizar de 5 mL. Los viales fueron se
sellados con tapas de plástico en condiciones asépticas dentro de gabinetes de bioseguridad clase 2. Los
viales fueron colocados en un baño de hielo por 2 h, transcurrido el tiempo se congelaron a -20 ºC por
24 h y por último fueron transferidas a un ultracongelador a -80 ºC por 2 h. Las tapas de plástico se
colocaron en un ángulo de 20 º, para permitir la formación de vacío en el interior del vial. El proceso de
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liofilización se llevó a cabo a -50 °C y una presión de 54 bares. Terminado este proceso, los viales
fueron sellados y se les colocó una tapa de aluminio, a cada vial se colocó una etiqueta externa para su
identificación.
Se empleó el método de Miles y Misra (1938) previo a la liofilización y posterior al proceso de

liofilización para determinar la eficiencia del proceso de conservación de las cepas. Se tomó un vial y
se adicionó 1 mL de caldo MRS, se dejó hidratar el liofilizado por 3 min. Se realizó una serie de
diluciones decimales y se inocularon cajas con gelosa MRS con 20 µL de cada una de las diluciones.
Se calculó las UFC/mL, se empleó la siguiente ecuación:
Cálculo de exponente de crecimiento:
C(10x )
U F C /mL = Y
“C”: Número de colonias contadas
“X”
: Dilución considerada para conteo
“Y”: Volumen de inóculo en placas.
Extracción de DNA de BAL, por el método de fenol-cloroformo
Se empleó la técnica de fenol-cloroformo, por lo cual fue modificada la técnica de Wallace (1987), para
la extracción de DNA total con fenol-cloroformo-isoamílico con proteinasa K y RNAsa, la cual se
describe a continuación:
Se preparó un cultivo de 48 h de incubación a 37 ºC, en atmósferas parciales de concentración de CO2

del 5%. Se colocaron de 3 a 10 colonias en un microtubo, se adiciono 500 µL de regulador TE 50/20,
(Tris-base 1 M y EDTA 0.5M; pH 8.0 v/v), la biomasa fue re suspendida mediante agitación con la
ayuda de un agitador vórtex por el tiempo de 10 s. La biomasa fue centrifugada a 1 min a 8000 xg y el
sobrenadante fue descartado. Fue añadido a un microtubo 175 µL de TE 50/20 y la biomasa fue
resuspendida con la ayuda de un agitador vórtex. Fue añadida 1.5 µL de RNAsa, la suspensión fue
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incubada a temperatura ambiente por 10 min. Después fue adicionado 5 µL de proteinasa K (20
mg/mL) y 20 µL de SDS al 10 %, se agitó mediante un vórtex y fue incubado a 56 ºC por 2 h.
Transcurrido el tiempo, se adicionaron 500 µL de TE (10/1) y 20 µL de NaCl (5 M) y fue agitado
cuidadosamente por inversión. La extracción con fenol fue realizada con la adición de 500 µL de fenol
equilibrado frio al tubo, y se agitó por inversión por 10 min a 4 °C y se recuperó un volumen
aproximado aprox. 300 a 400 µL, el cual fue transferido a un tubo limpio para microcentrífuga. Se
realizaron 2 extracciones con 500 µL de cloroformo-alcohol isoamílico (24/1, v/v), el tubo fue agitado
por inversión y se centrifugó a 12000 xg por 2 min a 4 ºC. El sobrenadante fue recuperado en un tubo
para microcentrifuga limpio y fue adicionado 500 µL de isopropanol frío, el tubo fue agitado mediante
inversión y se centrifugó a 12000 xg por 1 min a 4 °C. Se decantó el sobrenadante y se verificó que el
botón no se desprendiera. Se realizó un lavado del botón de DNA con 1 mL de etanol al 70 % frío, se
centrifugó a 12000 xg por 1 min a 4 °C. Se decantó el sobrenadante y se verificó que el botón no se
desprendiera del fondo del tubo. El botón de DNA fue secado a una temperatura de 65 ºC por un
tiempo de 2 h. Se hidrató con 200 µL de agua calidad biología molecular. Para finalizar, las muestras
obtenidas de DNA fueron almacenadas a una temperatura de -20 ºC para usos posteriores.
La integridad de las muestras resultantes de DNA, fueron determinadas mediante un corrimiento

electroforético en un gel de agarosa al 0.8%. El tamaño molecular de las bandas se puso de manifiesto
con un marcador de fago λ cortado con Hind III. Las muestras de DNA se prepararon en una mezcla de
5 µL de DNA más 2 µL de sustituto de bromuro de etidio para teñirse. El gel se corrió a 100 V por 1 h
en una cámara de electroforesis horizontal. El gel se visualizó con un fotodocumentador. El tamaño
molecular de las bandas se puso de manifiesto con un marcador de fago λ cortado con Hind III,
escalera de 100 pb.
Amplificación del gen 16S rDNA
Se realizó una PCR de amplio rango a partir de los DNA genómicos seleccionados para amplificar un
fragmento de ≈1500 pb del gen 16S rDNA. Los iniciadores empleados para la amplificación del gen
16S rDNA, se describen en el cuadro 2.
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Cuadro 2: Iniciadores utilizados para la amplificación del gen 16S rDNA.
Iniciador Secuencia Tamaño del amplicon Referencia

27f 5´- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3´ 1500 pb Frank et al., 2008
1492r 5´- CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT -3´
Las especificaciones de la mezcla de reacción para cada uno de los reactivos empleados y las
condiciones del programa del termociclador se detallan en los cuadros 3 y 4.
Cuadro 3: Mezcla de la reacción para la amplificación del gen 16S rDNA.
Reactivo Concentración inicial Volumen por tubo (µL) Concentración final

H2O inyectable cbp 25 μL 30 --------
Regulador PCR 10X 2.5 1X
Iniciador 27f 10 µM 2.5 10 µM
Iniciador 1492 r 0.1 µM 2.5 10 µM
MgCl2 50 mM 1 2 mM
dNTP´s 2 mM 2.5 0.2 mM
Taq polimerasa 5 U/µL 0.3 0.05 U/µL
DNA V 2 --------
Fuente: Elaboración propia. cbp= cuanto baste para. V= variable; NA= no aplica
Cuadro 4: Condiciones del programa del termociclador para la amplificación del gen 16S rDNA.
Etapa Temperatura/Tiempo N.º de ciclos

Desnaturalización inicial 95 ºC, 5 min 1
Desnaturalización 94 ºC, 60 s
Alineamiento 57 ºC, 60 s 30
Extensión 72 ºC, 90 s
Amplificación final 72 ºC, 7 min 1
El producto de los amplificados del gen 16S rDNA, se visualizó mediante un corrimiento
electroforético en geles de agarosa al 1.5 % en regulador TAE 1X a 100 V durante 1 h. Los
amplificados se prepararon mezclando 5 µL de DNA amplificado más 2 µL de sustituto de bromuro de
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etidio para su tinción. Se visualizó con un fotodocumentador. El tamaño molecular de las bandas se
puso de manifiesto con una escalera de 100 pb (ladder: 100-1000 pb).
Purificación de DNA amplificado
Los productos de PCR del gen 16S rDNA se purificaron con el sistema comercial de purificación
Agencourt® AMPure® XP (Beckman Coulter, USA), con base a las indicaciones de uso del fabricante
que se describen a continuación:
El frasco que contiene la solución de perlas fue homogeneizado con la ayuda de un agitador vórtex por
2 min. Fue transferido 36 µL de la solución de perlas a un tubo para microcentrífuga en base a la
siguiente fórmula:
Cantidad de perlas (µL) = (1 µL de amplicon) * (1.8 µL)
Se transfirió 20 µL de producto de PCR a un tubo para microcentrífuga nuevo y limpio, la mezcla fue
homogeneizada y se dejó en reposo a temperatura ambiente por un lapso de 5 min. Transcurrido el
tiempo, el tubo fue colocado en el soporte magnético DynaMagTM-2 por un tiempo de 3 min hasta la
formación de un botón de perlas magnéticas. La solución fue descartada y se cuidó que el botón de
perlas magnéticas no se desintegrara, sin retirar el tubo del imán. Se adicionaron 500 µL de etanol al
70% al tubo y se incubó durante 30 s a temperatura ambiente, se giró el tubo 180° para mover las perlas
alrededor del interior del tubo sin desintegrar el botón, después de 30 s se giró nuevamente el tubo
180°. Se descartó el sobrenadante sin desintegrar el botón.
Se realizó un segundo lavado como se describe en el párrafo anterior. Se eliminó del tubo el etanol
residual con ayuda de una micropipeta, sin desintegrar el botón y se dejó secar el tubo por 5 min a la
temperatura ambiente.
El tubo se retiró del magneto y se adicionaron 20 µL de la solución TE para separar el DNA de las
perlas, después de 5 min se colocó nuevamente el tubo en el magneto y se transfirió la solución de TE
con el DNA a un tubo nuevo para PCR. Por último, el DNA amplificado y purificado fue almacenado a
– 20 ºC.
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Secuenciación
Los productos purificados de DNA amplificado, fueron enviados a una concentración de 10 ng/μL al
servicio de secuenciación del INMEGEN. El iniciador 27f fue enviado a una concentración de 100
pM/μL, para obtener la secuencia. Las muestras fueron secuenciadas con el equipo secuenciador ABI
PRISM 310.
Análisis bioinformático
Las secuencias fueron entregadas con el formato*.abi y fueron transformadas a formato FASTA por el
programa BioEdit versión 7.0.9.0 (Hall, 1999) para revisar la calidad y cantidad de la secuencia
obtenida.
Las secuencias se analizaron en las bases de datos del NCBI por medio del programa MegaBlast
versión 2.2.22 (Morgulis et al., 2008); a partir de este análisis se construyó una minería de secuencias
del GenBank para obtener las secuencias consenso. Por medio del programa ClustalX versión 2.0
(Larkin et al., 2007).
Los alineamientos obtenidos se editaron manualmente utilizando el programa Seaview versión

4.0(Galtier et al., 1996). Con las secuencias consenso se realizó un nuevo análisis con el programa
MegaBlast versión 2.2.22 (Morgulis et al.,2008) para determinar la identidad de cada una de las
secuencias obtenidas de las secuencias de las bibliotecas del gen 16S rDNA, con base a los criterios de
Rossello-Mora y Aman (2001), en los que se establece que la especie corresponde a más del 97 % de
identidad, el género entre 90% y 96% de identidad, para valores menores al 90% se consideran otros
niveles taxonómicos como familia y orden.
Por medio del programa ClustalX versión 2.0 (Larkin et al., 2007), el cual se los parámetros
establecidos por el propio programa, se alinearon las secuencias obtenidas de las bases de datos (base
de datos Refseq rRNA).Los alineamientos se editaron manualmente con la ayuda del programa
Seaview versión 4.0 (Galtier et al., 1996) y la construcción de los árboles filogenéticos se construyó
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con el programa Mega versión 6.0 (Tamura et al., 2013), con la utilización del modelo de sustitución de
Jukes-Cantor por medio de Neiborg-Joining con bootstrap de 100 repeticiones.
Árbol filogenético
Las secuencias fueron alineadas por medio del programa en línea Muscle (Edgar, 2004) con una
minería de secuencias de BAL del GenBank. Se utilizaron los parámetros establecidos por el mismo
programa. El archivo generado fue convertido al formato ALN por medio del programa ClustalX
versión 2.0 (Larkin et al., 2007) y se generó el archivo *meg por medio del programa MEGA versión
6.0 (Tamura et al., 2013). La reconstrucción filogenética se realizó con el método de parsimonia con
100 repeticiones de Bootstrap. Se editó el filograma en Power Point (Office, 2013).
Resultados
Re identificación de bacterias ácido-lácticas
Se realizaron las pruebas de catalasa y oxidasa a las 24 cepas de BAL que fueron recuperadas para su
re identificación por los criterios de Cowan y Steel (1979). Además, se comprobó que la morfología
microscópica mediante la tinción de Gram (figura 2).
Conservación de BAL por criopreservación y liofilización
Se conservaron las 24 BAL por los métodos a largo plazo de criopreservación y liofilización. Se evaluó
la viabilidad del método de liofilización por la técnica de Miles y Misra (1938).
Viabilidad de las cepas conservadas por el método de liofilización.
Se determinó viabilidad de las cepas conservadas por el método de liofilización. Para esto, se utilizó el
método de Miles y Misra (1938), antes y después de someter al proceso de liofilización. En la figura 3,
se muestra la comparación de UFC/mL obtenidas en la pre-liofilización y post-liofilización.
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Figura 2: Morfología microscópica. A) Cepa 53 (Enterococcus faecium). B) Cepa 77 (Enterococcus gallinarum). C) Cepa
117 (Enterococcus faecium). Tinción de Gram (100x). En la imagen A y C se observan bacilos Gram positivo y en el caso
de la imagen B se observan bacilos cortos Gram positivos. Fuente: Elaboración propia
Figura 3. Comparación de UFC/mL obtenidas en la pre-liofilización y post-liofilización. Se muestra que el método de

conservación por liofilización es viable para las cepas 12, 25, 53, 77, 100, 129, 137, 155, 184, 16-4, 18-2, 32,3 y 32-4.
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Extracción de DNA de BAL, por el método fenol-cloroformo
Al finalizar la recuperación, re identificación y conservación de las cepas BAL, se extrajo DNA

genómico de las cepas. El DNA obtenido mostró una integridad y pureza suficiente para realizar la
tipificación y la amplificación del gen 16S rDNA. En la figura 4, se muestra la integridad de las
muestras de DNA.
Figura 4. Integridad de los amplicones de DNA.Carriles. - 1: Marcador de talla molecular fago lambda cortado con Hind
III, 2: 122, 3: 152, 4: 48, 5: 106. Del carril 2 al 5 se ilustra la integridad de los amplicones de los DNA obtenidos. Fuente:
Elaboración propia
Amplificación y purificación del gen 16S rDNA
Una vez realizada la extracción del DNA, se ejecutó la PCR para la amplificación del gen 16S rDNA y
posteriormente se purificaron los productos obtenidos. Se utilizó como control positivo Escherichia
coli ATCC 25922.
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Secuenciación, análisis bioinformática y árbol filogenético
Se envió al servicio de secuenciación del INMEGEN, el amplicón de ≈1500 pb del gen 16S rDNA de
17 de las 24 cepas de BAL y se realizó un análisis, para evaluar la calidad e identidad de las
secuencias. Se analizaron las 17 secuencias recibidas.
Se realizó un alineamiento de las secuencias correspondientes al gen 16S rDNA de las especies de
BAL depositadas en la base de datos (GenBank), esto con el propósito de comparar las secuencias
obtenidas y así conocer la identidad de estas con la utilización del análisis bioinformático.
El análisis bioinformático fue realizado con 17 secuencias recibidas. En la figura 5 se muestra el

electroferograma de la secuencia 77. En el cuadro 5 se ilustra una comparación entre los resultados
obtenidos por API 50 CHL (bioMerieuxTM Inc., Francia), los resultados obtenidos de los alineamientos
de las secuencias, además de pruebas bioquímicas realizadas. Se especifica el nombre designado de las
cepas que se utilizaron en los diferentes ensayos. Se utilizó todas las secuencias de BAL reportadas
hasta el momento y depositadas en la base de datos del Genbank.
Figura 5. Electroferograma de secuencia 77. Visualización de la secuencia 77 con la ayuda del programa BioEdit con el
propósito de su re edición manual.. Fuente:Elaboración propia
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Cuadro 5: Comparación entre los resultados obtenidos por API 50 CHL y los resultados obtenidos de los alineamientos de
las secuencias, además de pruebas bioquímicas realizadas.
Secuenciación por
Clave API 50 CHL GRAM CATALASA OXIDASA ΔE %ID
gen 16S rDNA
BAL-12 Leuconostoc lactis Positivo Negativa Negativa N/D N/D N/D
Lactococcus lactis Enterococcus
BAL-25 Positivo Negativa Negativa 0 99%
ssp. lactis 2 faecium
Lactococcus lactis
BAL-48 Positivo Negativa Negativa N/D N/D N/D
ssp. lactis 1
Lactobacillus
Enterococcus
BAL-53 delbrueckii ssp. Positivo Negativa Negativa 0 99%
faecium
delbrueckii
Lactobacillus
Enterococcus
BAL-68 curvatus ssp. Positivo Negativa Negativa 0 99%
faecium
curvatus
ssp. lactis 2 gallinarum
BAL-10 Enterococcus
Leuconostoc lactis Positivo Negativa Negativa 0 99%
0 faecium
BAL-10 Lactococcus lactis
Positivo Negativa Negativa N/D N/D N/D
6 ssp. lactis 1
Lactobacillus
BAL-11 Enterococcus
curvatus ssp. Positivo Negativa Negativa 0 99%
7 faecium
curvatus
BAL-12
Leuconostoc lactis Positivo Negativa Negativa N/D N/D N/D
2
BAL-12 Lactococcus ssp. Enterococcus
Positivo Negativa Negativa 0 99%
9 lactis lactis 1 faecium
BAL-13 Enterococcus
3 faecium
BAL-13 Enterococcus
7 faecium
Lactobacillus
BAL-15
curvatus ssp. Positivo Negativa Negativa N/D N/D N/D
1
curvatus
BAL-15 Enterococcus
5 faecium
BAL- Lactococcus Enterococcus
Positivo Negativa Negativa 0 99%
184 raffinolactis faecium
BAL-16 Enterococcus
N/D Positivo Negativa Negativa 0 99%
-4 faecium
BAL- Enterococcus
18-4 faecium
18
BAL- Enterococcus
32-3 faecium
N/D: No determinado. Δ E: Valor de expectación. % de ID: porcentaje de identidad.
Fuente:Elaboración propia
Se realizó un árbol filogenético de BAL mediante la utilización y comparación de las secuencias

parciales del gen 16S rDNA, generado por el método de agrupamiento de parsimonia donde se incluyó
100 repeticiones, por el cual se utilizó las secuencias de las BAL aisladas de queso Adobera y
secuencias de referencias del Genkbank de los principales grupos de BAL. Se tomó en cuenta el
porcentaje de identidad de más del 97 %, propuesto por Rossello-Mora y Aman (2001). En la figura 6,
se ilustra el árbol filogenético donde se contempla el agrupamiento y las relaciones evolutivas de los
resultados de la secuenciación y secuencias diferentes grupos de BAL. La especie predominante de las
cepas secuenciadas fue Enterococcus faecium en el cual se encontraron 16 coincidencias; mientras que
solamente se encontró una coincidencia con el género Enterococcus gallinarum. Además, se muestra la
similitud del género Enterococcus con el resto del grupo de las BAL. Los valores del Bootstrap se
indican sobre las ramas.
Discusión
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son típicamente asociadas con el aparato gastrointestinal humano.
Tradicionalmente, estas BAL han sido clasificadas en base a sus características fenotípicas. Estudios
basados en el análisis de la secuenciación del gen 16S rDNA ribosomal han demostrado que algunas
identificaciones generadas por pruebas fenotípicas no corresponden con las relaciones filogenéticas.
Por esta razón, esta técnica genotípica se ha vuelto cada vez más importante para la identificación de
BAL y para la diferenciación de cepas (Holzapfel et al., 2001).
19
Figura 6. Árbol filogenético generado por el método de agrupación de parsimonia donde se incluyó 100 repeticiones. Se
observa la agrupación y las relaciones evolutivas de los géneros Se observa la agrupación y las relaciones evolutivas de los
géneros Enterococcus spp., con los principales grupos de BAL. Se utilizó la secuencia de la cepa Bacillus subtilis L3 como
grupo externo.
20
El género Enterococcus pertenece al grupo de las bacterias ácido lácticas (BAL), se encuentra
clasificado como bacilo corto, Gram positivo, no esporulado, catalasa y oxidasa negativa, anaerobios
facultativos. Los Enterococcus, son el grupo más controversial de las BAL. Los Enterococcus se
encuentran principalmente en el tracto intestinal de los mamíferos. Estudios recientes sobre la
microbiota de quesos tradicionales de las ciudades del mediterráneo de Europa, han indicado que los
Enterococcus juegan un papel importante en la maduración del queso, probablemente mediante
proteólisis, lipólisis y citrato, contribuyendo al sabor y olor de estos quesos típicos (Franz et al., 2003;
Cabeza 2006; Foulquíe et al., 2006).
Debido a la gran capacidad de los Enterococcus de sobrevivir a tratamientos térmicos y a diversas

condiciones ambientales, se pueden encontrar en multitud de alimentos de origen animal (Murray,
1990). Incluso se ha hecho referencia a Enterococcus faecium como uno de los microorganismos
predominantes en la leche cruda, además juegan un papel importante en la fabricación de quesos (Franz
et al., 2003). Esto se debe a que el género Enterococos contribuye de forma activa con el desarrollo del
aroma y maduración, muy específicamente en aquellos quesos que se han elaborado a base de leche
cruda de vaca (Centeno et al., 1999). Incluso se suelen encontrar con frecuencia en quesos elaborados
con leche pasteurizada, lo que está relacionado con su gran termorresistencia. Pueden aparecer en
ordenes de 104 a 106 UFC/g en la cuajada y en ordenes de 105 a 107 UFC/g en quesos maduros, con
claro predominio de las especies Enterococcus faecium y Enterococcus fecalis (Giraffa, 2003; Foulquíe
et al., 2006; Orgier y Serror, 2008). Las condiciones de ordeño y suministro de agua influyen en la
calidad microbiana de la leche (Verdier-Metz et al., 2012).
Este estudio tuvo el propósito de realizar una identificación genética de BAL presentes en queso
Adobera, tradicional en los Altos de Jalisco. En el presente trabajo, las cepas aisladas del queso
Adobera fue analizada por medio de la amplificación y secuenciación del gen 16S rDNA. Este método
de identificación genética reveló que el género de BAL predominante en un queso adobera, fue el
género Enterococcus. De las 17 secuencias estudiadas, 16 fueron identificadas como Enterococcus
faecium y la especie menos frecuente fue Enterococcus gallinarum, donde solo 1 especie coincide con
este género.
21
Los hallazgos obtenidos concuerdan por lo reportado por Alegría et al., (2012) quien determinó la
microbiota bacteriana del queso Oscypek mediante amplificación del gen 16S rDNA encontrando
presencia de Enterococcus faecium. En otros estudios (Gelsomino et al., 2002) se reportó una gran
biodiversidad del género Enterococcus que está extremadamente distribuido en leche y queso artesanal,
elaborado con leche cruda de vaca. Este mismo autor hace referencia a que la fuente de contaminación
de Enterococcus en leche y queso comienza en los equipos de ordeño y tanques de almacenamiento,
incluso después de la cloración de estos equipos.
Cabeza (2006) menciona que al final de la maduración de los quesos, presentan recuentos de
Enterococcus faecium en parámetros de 105 a 107 UFC/g, ya que esta especie tolera la sal y la acidez.
Esto podría explicar por qué Enterococcus faecium fue el más abundante en las secuencias analizadas.
De modo que se puede concluir que la amplificación del gen 16S rDNA ha resultado exitosa para la
identificación y diferenciación de bacterias a nivel especie. Los iniciadores 27f y 1492r empleados para
la amplificación del gen 16S rDNA, mostraron excelentes resultados para amplificar el gen de 1500 pb.
Similarmente Alegria et al., (2012) utilizó los mismos iniciadores universales y obtuvo la amplificación
del gen 16S rDNA por pirosecuenciación.
Adicionalmente, Angeletti et al., (2001) recomienda la utilización de los iniciadores ddl Enterococcus
faecium y ddl Enterococcus faecalis, como una buena alternativa para obtener una rápida y precisa
identificación del género Enterococcus, en donde se puede evitar inconvenientes de identificación de
los sistemas comerciales, como pruebas fenotípicas complementarias de identificación.
Por lo anterior, se verifica que la la caracterización e identificación mediante diferenciación fenotípica

del género Enterococcus, puede ser muy tediosa, y, además, puede conducir a una errónea
identificación (Jackson et al., 2004).
Por otro lado, Furtaleno et al., (2014) comparó la técnica de PCR con un método automatizado
(MicroScan system) para la identificación de Enterococcus, donde obtuvo resultados significativos, el
método automatizado concordó con el 90% de las secuencias analizadas. Por lo anterior, se refuerza la
necesidad de mejorar los sistemas automatizados para la identificación del género Enterococcus.
22
Adicionalmente, Ramos et al., en el 2009, aisló, identifico y caracterizo BAL de un queso crema
tropical tradicional de la región, elaborado con leche sin pasteurizar, donde realizó una prueba
bioquímica con la ayuda de un sistema comercial miniaturizado (sistema API 50 CHL). La
identificación fue llevada a cabo mediante la amplificación y secuenciación del gen 16S rDNA, además
de la construcción de un árbol filogenético donde utilizó el programa MEGA 2 (Molecular
Evolutionary Genetics Analisis) versión 2.1 (Kumar et al., 2001) donde usó el método de agrupación
de Neighbor-Joining. La evaluación estadística incluyó 1000 repeticiones.
Ramos (2009), reportó la identificación molecular de 6 especies de BAL (Lactobacillus) con un

porcentaje de similitud de un mínimo de 97% y un máximo del 100%. Estos porcentajes de similitud
concuerdan con el criterio de identificación propuesto por Rossello-Mora y Amann et al., (2001) en el
que se considera que células procariotas cuyo gen 16S rDNA un 97% de similitud o más de secuencia
con las secuencias de la misma especie.
Kulwichit et al., (2007) realizó una identificación de BAL comparando el sistema API contra la
secuenciación del gen 16S rDNA, donde utilizó 4 cepas de referencia ATCC y 29 cepas aisladas de
diversas fuentes. Solo 2 cepas coincidieron con la identificación de API 20 STREP, API 50 y con los
resultados de la secuenciación del gen 16S rDNA. Además 6 cepas coinciden en la identificación con
API 50 CHL y la secuenciación del gen 16S rDNA y 6 cepas se encontró coincidencia entre API 20
STREP y la secuenciación del gen 16S rDNA. Cabe señalar que la única identificación del género
Enterococcus faecium mediante la secuenciación del gen 16S rDNA tuvo coincidencia con el sistema
API 20 STREP. Estos resultados demuestran que la forma más confiable para la identificación de BAL
es mediante la secuencian del gen 16S rDNA, ya que los métodos miniaturizados no proporcionan
resultados con un alto porcentaje de confiabilidad.
De modo que se verifica que la amplificación del gen 16S rDNA en la identificación de Enterococcus,
es una alternativa rápida y exacta a comparación de métodos automatizados y pruebas tradicionales.
Los resultados obtenidos en este estudio, mediante secuenciación, arrojan la identificación de 16
Enterococcus faecalis y una secuencia identificada como Enterococcus gallinarum. Estos resultados
fueron comparados con los obtenidos con API 50 CHL, lo cual indica que la mejor forma para
23
identificación de BAL es por medio de la secuenciación del gen 16S rDNA y no por medio de la
utilización métodos miniaturizados como las galerías API 50 CHL.
Por lo anterior, el sistema de identificación API systems, necesita mejoras en la identificación de BAL
a nivel género, ya sé que se requiere la asistencia de una identificación genotípica para confirmar los
resultados obtenidos por los sistemas API systems.
Al respecto, Fuentes (2014), realizó un estudio sobre la microbiota del grupo de BAL presente en el
queso Oaxaca, donde aisló cepas de BAL mediante la secuenciación parcial del gen 16S rRNA
ribosomal. Encontró diversos géneros de bacterias pertenecientes al grupo de las BAL, de las cuales, el
género Enterococcus fue de mayor prevalencia. Los resultados de la secuenciación parcial del gen 16S
rRNA permitieron el conocimiento y la identificación a nivel especie de las BAL además de que la
carga elevada de Enterococcus indica la existencia de malas prácticas de elaboración y la manipulación
de la leche y/o en las prácticas de la elaboración de queso. Cardona et al., (2013), realizó un estudio
filogenético mediante el algoritmo ML (Máxima verosimilitud) con base a las secuencias del gen 16S
rDNA de algunas BAL, entre ellas el género Enterococcus aisladas a partir subproductos de caña de
azúcar y lactosuero bovino y caprino, utilizando 100 repeticiones. Donde encontró mayor presencia del
género de Enterococcus en los residuos de lactosuero de bovinos y caprinos que en los subproductos de
caña de azúcar.
Existe una gran posibilidad que la presencia de Enterococcus en heces fecales de humanos es debido a
la ingesta de leche y quesos. La adaptabilidad a diferentes sustratos y factores que afectan el
crecimiento como temperaturas altas y bajas, pH extremo, salinidad y resistencia a la pasteurización,
hacen que el género Enterococcus pueda encontrarse en cualquier alimento fabricado con materia
prima cruda como leche por su termorresistencia y resistencia a sales y pH ácidos. (Gelsomino et al.,
2002; Cabeza, 2006). La presencia del género Enterococcus en queso, debe interpretarse desde
diferentes puntos de vista. Este grupo de bacterias, ha sido considerado como indicador del grado de
higiene en la elaboración de quesos. Los géneros Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis son
muy frecuentes en la leche cruda y en los productos lácteos. Estas bacterias se desarrollan en gran
variedad de quesos, especialmente en quesos artesanales producidos en el sur de Europa (Portugal,
24
España, Italia y Grecia). Su presencia en quesos se debe en parte, en la contaminación de la leche y a la

supervivencia en el ambiente de la lechería mientras que otra parte proviene del crecimiento bajo las
condiciones de fabricación y la maduración del queso. (Abriouel et al., 2008).
La presencia de Enterococcus es un indicador de contaminación fecal y refleja falta de higiene durante

la elaboración o manipulación del producto y advierte de la posible presencia de otros patógenos
(Cristóbal y Maurtua, 2003). La norma NOM-121-SSA1-1994 no indica los valores límite para la
presencia de Enterococcus en quesos.
El origen de Enterococcus spp. en leche puede provenir de una contaminación fecal directa o indirecta.
La primera consiste en el contacto directa de leche con materia fecal de cualquier animal de granja e
incluso del ser humano. La segunda, se relaciona con el ambiente del cual se obtiene este producto
puesto que el ganado vacuno, por lo general, mantiene una relación estrecha con otros animales de
granja como gallinas, perros, caballos y cerdos. Así, estos animales de granja adquieren distintas
especies de Enterococcus que pueden llegar a encontrarse en la leche.
Otra forma indirecta mediante la cual se justifica la presencia de Enterococcus spp., en la leche, está
relacionada con la limpieza del equipo de ordeño y con la pureza del agua que se utiliza para el
proceso. Se ha descrito que existen especies de Enterococcus spp. Las cuales con frecuencia son
aisladas de ciertos animales, como es el caso de Enterococcus durans que se encuentra principalmente
en cerdos, Enterococcus avium presente en diversos tipos de aves y Enterococcus gallinarum que se
asocia a aves de corral como gallos, gallinas y pollos (Araya et al., 2005). Por lo anterior, esto podría
explicar la presencia de Enterococcus gallinarum en el queso Adobera.
Su papel en el desarrollo del sabor en los quesos aun no es claro, mientras algunos investigadores creen
que ellos son la causa del deterioro en el sabor otros consideran que contribuye con el mejoramiento
organoléptico del producto final. Cuando en un producto lácteo se detectan Enterococcus se supone que
las condiciones sanitarias empleadas en la fabricación del producto han sido inadecuadas. Sin embargo,
se ha demostrado que la presencia de Enterococcus faecalis en muchos productos alimenticios no
siempre está relacionada con contaminación fecal (Rodríguez et al., 2007).
25
Sin embargo, cada vez con más frecuencia y debido a sus propiedades, los Enterococcus se consideran
apropiados para emplearse como co-cultivos iniciadores. En muchos casos, el sabor propio y típico de
algunos quesos se deba, no sólo a los cultivos tradicionales sino también a los Enterococcus
adicionados intencionalmente en la fabricación de estos (Rodríguez et al., 2007).
Los Enterococos juegan un papel importante en la fabricación de quesos típicos de algunas regiones.
Esta doble faceta despierta una gran inquietud sobre la seguridad de las cepas presentes en quesos
elaborados de forma artesanal en muchos de los cuales juegan un papel importante en la maduración y
el desarrollo del aroma (Abriouel et al., 2008).
Adicionalmente, el género Enterococcus ha sido utilizado extensamente en la industria alimenticia

como probióticos o fermentos lácticos. Enterococcus faecalis y Enterococcus facecium regularmente
son aislados de queso por su capacidad de sobrevivir al proceso de la pasteurización de leche. El
género Enterococcus es considerado médicamente importante por su producción de bacteriocinas y por
su capacidad probiótica (Fisher y Phillips, 2009). Las bacteriocinas pueden ayudar contra otras
bacterias competidoras, ya que estas bacteriocinas son activos contra patógenos de alimentos, por
ejemplo, contra Listeria monocytogenes. Ammor et al., (2005) demostró que el género Enterococcus
spp inhibió el crecimiento de patógenos como Listeria innocua y Esherichia coli en un ensayo de
difusión en agar. Estas cepas fueron aisladas de instalaciones donde se producen embutidos secos.
Esto nos demuestra la capacidad de Enterococcus spp. Como actividad antibacteriana contra patógenos
como Listeria innocua y Escherichia coli. Estos compuestos antimicrobianos pueden servir para evitar
el crecimiento de los biofilms y el crecimiento de bacterias no deseadas en superficies donde se
producen alimentos. Las BAL que son aisladas de productos fermentados son probablemente las
mejores opciones para mejorar la seguridad microbiana en los alimentos procesados, ya que estas
bacterias se encuentran adaptadas a las condiciones de los productos fermentados (Ammor et al., 2005).
Prácticamente todos los microorganismos utilizados en los alimentos probióticos o suplementos
alimenticios son representantes de los géneros Lactobacillus, Enterococcus, o Bifidobacterium
(Holzapfel et al., 2001).
26
Yang et al., en el año 2015 utilizó BAL como probióticos en la dieta de cerdos. En el cual menciona la
utilización de la especie de Enterococcus faecium en el crecimiento de lechones donde los efectos
probióticos a la especie porcina fueron: inducción a una fuerte respuesta anti inflamatoria en el
intestino, aumento de ácidos monoinsaturados y poliinsaturados; aumentó en la digestibilidad de
nutrientes y disminución fecal. Esto nos indica que la aplicación del género Enterococcus spp., tiene un
gran potencial como alternativa a los antibióticos. Fisher y Phillips, (2009) citan que las bacterias del
género Enterococcus pueden mostrar resistencia a la vancomicina y teicoplanina en la alimentación de
animales.
Esparza et al., (1999) cita que Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis son ejemplos de bacterias
que han desarrollado resistencia a la la meticilina/oxacilina. Estos resultados nos indican que
Enterococcus spp., tiene un gran potencial como alternativa a los antibióticos en alimentación para
animales. Por lo tanto, se necesitan estudios controlados sobre la eficacia de las preparaciones de
Enterococcus, así como una óptima suplementación etapas y dosis.
La identificación genética por medio de la amplificación del gen 16S, es una herramienta útil para
revelar la composición microbiana de quesos elaborados tradicionalmente. Estos resultados demuestran
que la utilización de la amplificación y la secuencian del gen 16S son necesarios para una correcta y
confiable identificación de bacterias ácido lácticas.
Conclusiones y Recomendaciones
Conclusiones
Todas las cepas fueron identificadas dentro del género Enterococcus, mediante el análisis de la
secuencia del gen 16S rDNA ribosomal.
Recomendaciones
27
Utilizar pruebas complementarias para la genotipicación de bacterias ácido lácticas.
Revisar las prácticas de higiene para los procesos de elaboración de queso Adobera.
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Pathogens. 4: 34-45.
32

Identificacion Genetica de Bacterias Acido Lacticas Aisladas de Queso Adobera PDF

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Identificación genética de bacterias ácido lácticas aisladas de queso... S. Gaytan Ramírez.

Revista Virtual Pro

ISSN 1900-6241, No 191, Diciembre 2017 :: Calidad de Alimentos.

Identificación genética de bacterias ácido lácticas aisladas de

Samuel Gaytan Ramírez

ISSN 1900-6241, No 191, Diciembre 2017 :: Calidad de Alimentos.

ISSN 1900-6241, No 191, Diciembre 2017 :: Calidad de Alimentos.

En la fabricación de quesos artesanales se emplean diferentes cultivos de BAL que proporcionan

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Conservar cepas de bacterias ácido lácticas mediante criopreservación y liofilización.

Alcance y Limitaciones del estudio

● El tiempo establecido para la realización de los diferentes ensayos.

Cepas de bacterias ácido lácticas

ISSN 1900-6241, No 191, Diciembre 2017 :: Calidad de Alimentos.

Cuadro 1: Materiales biológicos utilizados en los diferentes ensayos.

Clave API 50 CHL Clave API 50 CHL

Recuperación y re-identificación de bacterias ácido lácticas conservadas por crioconservación.

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Conservación de BAL por criopreservación y liofilización

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Se empleó el método de Miles y Misra (1938) previo a la liofilización y posterior al proceso de

Cálculo de exponente de crecimiento:

“C”: Número de colonias contadas

“Y”: Volumen de inóculo en placas.

Extracción de DNA de BAL, por el método de fenol-cloroformo

Se preparó un cultivo de 48 h de incubación a 37 ºC, en atmósferas parciales de concentración de CO2

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La integridad de las muestras resultantes de DNA, fueron determinadas mediante un corrimiento

Amplificación del gen 16S rDNA

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Cuadro 2: Iniciadores utilizados para la amplificación del gen 16S rDNA.

Iniciador Secuencia Tamaño del amplicon Referencia

Cuadro 3: Mezcla de la reacción para la amplificación del gen 16S rDNA.

Reactivo Concentración inicial Volumen por tubo (µL) Concentración final

Etapa Temperatura/Tiempo N.º de ciclos

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Purificación de DNA amplificado

Cantidad de perlas (µL) = (1 µL de amplicon) * (1.8 µL)

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Los alineamientos obtenidos se editaron manualmente utilizando el programa Seaview versión

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Re identificación de bacterias ácido-lácticas

Conservación de BAL por criopreservación y liofilización

Viabilidad de las cepas conservadas por el método de liofilización.

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Figura 3. Comparación de UFC/mL obtenidas en la pre-liofilización y post-liofilización. Se muestra que el método de

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Extracción de DNA de BAL, por el método fenol-cloroformo

Al finalizar la recuperación, re identificación y conservación de las cepas BAL, se extrajo DNA

Amplificación y purificación del gen 16S rDNA

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Secuenciación, análisis bioinformática y árbol filogenético

El análisis bioinformático fue realizado con 17 secuencias recibidas. En la figura 5 se muestra el

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Se realizó un árbol filogenético de BAL mediante la utilización y comparación de las secuencias

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Debido a la gran capacidad de los Enterococcus de sobrevivir a tratamientos térmicos y a diversas

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Por lo anterior, se verifica que la la caracterización e identificación mediante diferenciación fenotípica

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