INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Licenciatura en Biología
REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN Y SU RECONOCIMIENTO POR
MEDIO DE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
López Gómez Roxana Valeria; Emba Gutierrez César Alfredo
2OM1 Sección 3
Ejemplo de cálculos realizados para la
Introducción obtención de μmolesGlu para la curva tipo:
Las reacciones de transaminación son reacciones donde se
traspasa el grupo amino desde un α-aminoácido a un -Tubo 1
α-cetoácido, convirtiéndose él primero en α-cetoácido, y el
20 μmolesGlu 1 mL
segundo en un α-aminoácido. Las enzimas que catalizan estas 0.25 mL x mL x 1000 μL = 0.1μmolesGlu
reacciones son las transaminasas y necesitan el piridoxal
fosfato (PLP) como coenzima. *Se anexa gráfica correspondiente a los datos presentados en
Los aminoácidos ceden su grupo amino al α-cetoglutarato la tabla 1.
que se transforma en glutamato (GLU), pasando ellos al
α-cetoácido correspondiente. Estas enzimas (Transaminasa Tabla 2. ​Resultados obtenidos en el método cromatográfico
Glutámico Pirúvica, TGP y Transaminasa Glutámico realizado para el reconocimiento y producción de Ácido
Oxalacética, TGO), abundantes en corazón e hígado, son Glutámico.
liberadas cuando los tejidos sufren una lesión, por lo tanto sus
niveles altos en suero pueden ser indicativos de infarto de
miocardio, hepatitis infecciosa, u otros daños orgánicos (1).

Cálculos:
Figura 1. ​Reacción general de transaminación. De acuerdo a la gráfica obtenida y presentada en los anexos,
la ecuación de la recta es:
Objetivo general
Realizar métodos cuantitativos para determinar la actividad y = 0.0319x + 0.0373
de la enzima transaminasa (ALAT/TGP) presente en un
Despejando:
extracto crudo de hígado.
μmolesGlu = Abs−0.0373
0.0319

Objetivos particulares:
- Calculando los μmolesGlu del Problema, donde
-​​Emplear un método cromatográfico y otro
espectrofotométrico. obtuvimos una Absorbancia de 0.066
-​​Trazar una gráfica de absorbancia vs μmoles de Ácido 0.066−0.0373
μmolesGlu P = = 0.899 μmolesGlu
Glutámico. 0.0319

-Calcular los μmoles de Ácido Glutámico reales obtenidos.

- Determinar la actividad de la enzima (TGP) en Unidades *Sabiendo que se añadieron 60 μL en el cronograma
Arbitrarias de Transaminasa (UAT) realizado y se requieren saber los μmoles en 1 mL:
0.899 μmolesGlu ― 60 μL
Resultados ​ x ― 1 mL (1000 μL )
Tabla 1. ​Resultados obtenidos para la Curva tipo de Ácido x = 14.983 μmolesGlu
Glutámico, método espectrofotométrico (espectrofotómetro a *La dilución utilizada fue 1:4 (0.5 mL del Problema en 1.5
540 nm) y aplicaciones de Ácido Glutámico (solución de 20 mL de Acetona)
μmoles/mL) utilizadas en el método cromatográfico. 14.983 μmolesGlu x 4 = 59.932 μmolesGlu

- Calculando los μmolesGlu del Testigo, donde

obtuvimos una Absorbancia de 0.041
0.041−0.0373
μmolesGlu T = 0.0319 = 0.116 μmolesGlu

*Sabiendo que se añadieron 60 μL en el cronograma

realizado y se requieren saber los μmoles en 1 mL:

0.116 μmolesGlu ― 60 μL
 ​ x ― 1 mL (1000 μL )
x = 2.767 μmolesGlu
Obteniendo los μmolesGlu del Testigo y Problema, podemos
calcular los μmoles de Ácido Glutámico reales que se
obtuvieron, como se muestra a continuación:
μmolesGlu reales = μmolesGlu P − μmolesGlu T
Sustituyendo:
μmolesGlu reales = 59.932 μmolesGlu − 2.767 μmolesGlu
μmolesGlu reales = 57.165 μmolesGlu
La actividad de la enzima TGP se reportará en Unidades
Arbitrarias de Transamina (UAT), por lo que:
*Tomando en cuenta que la preparación de extracto crudo de
hígado de rata se preparó con 1 g de hígado en 30 mL de
regulador de fosfatos 0.1 M.
1g hígado
30 mL extracto crudox 2 mL extracto crudo utilizado c/tubo
= 0.066 g hígado c/tubo
- Calculando las Unidades Arbitrarias
Transaminasa
U .A.T =
μmolesGlu reales
g de hígado · 1 hr
Sustituyendo
U .A.T = 57.165 μmolesGlu
0.066 g · 1 hr
U .A.T = 866.136
Discusión
A partir de una preparación cruda de transaminasa de hígado
de rata, se visualizó la producción Ácido Glutámico a partir
de una reacción de transaminación llevada a cabo en
condiciones de pH de 7.4, a 37 ºC y durante una hora de
desarrollo. De acuerdo a la bibliografía consultada, la
eliminación de los grupos ∝-amino son catalizadas por las
enzimas transaminasas. El grupo ∝-amino, para el caso
específico de esta práctica, Alanina, se transfiere al átomo de
carbono ∝ del ∝-cetoglutarato, dejando al correspondiente
∝-cetoácido análogo del aminoácido. El ∝-cetoglutarato se
amina a la vez que se desamina el ∝-aminoácido (4).
Obteniendo como producto final al Glutamato y también
Piruvato, ya que la enzima a determinar su actividad es
Transaminasa Glutamico Piruvica, la cual es una enzima de
origen hepático, la forma mitocondrial constituye el 81% de
la enzima total presente en el hígado humano (3). Debido a
esto, necesario tomar en cuenta que no se utilizò una enzima
en un estado puro pues proviene de una muestra de hígado de
rata. Así pues, la producción de Glutamato en el tubo Testigo
fue de 2.767 μmoles , a pesar que no se le añadió
∝-cetoglutarato, por lo que se podría esperar que no hubiera
producción de Ácido Glutámico pues la reacción de
transaminación no se llevaría a cabo, sin embargo esta
producción de Glutamato se justifica por lo mencionado
anteriormente, ya que la enzima no se encuentra en un estado
puro, esto quiere decir que en la muestra de hígado están
presentes más enzimas y sustancias orgánicas que,
favorecieron la producción de este aminoácido, además que
los grupos amino de muchos ∝-aminoácidos se recogen en el
hígado en forma del grupo amino de moléculas de glutamato
(4). Por ello esta cantidad es restada del cálculo de μmoles
reales pues no fueron producidos por la transaminasa. En
contraste y cumpliendo lo que se esperaría, el tubo al cual sí
se le añadió ∝-cetoglutarato, tubo Problema, tuvo una
producción mucho mayor de μmoles .
Todas las transaminasas utilizan el mismo grupo prostético
que es el piridoxal fosfato (PLP) y un mismo mecanismo de
reacción. Actúa como un transportador intermedio de grupos
amino en el sitio activo de las aminotransferasas (4).
Para la determinación de la producción de micromoles de
glutámico que fueron inducidos a partir de la reacción de
transaminación que efectuamos, se realizó un método
cromatográfico en papel. Colocando diferentes
concentraciones de Ácido Glutámico (5, 10, 15, 20 y 25 μ
L), 60 μ L del Problema y Testigo. También se añadieron
5 μL de Alanina y 20 μ L de agua que fue el testigo para
ajustar el espectrofotómetro. En dicho cromatograma, se
observó, después de haberlo revelado con una solución de
Ninhidrina al 0.05% en etanol que, el problema corrió a la
misma altura que las muestras con diferentes
concentraciones de Ácido Glutámico, de esta manera se
de puede confirmar la producción de èste y por lo tanto, que la
reacción de transaminación y la actividad de la transaminasa
se llevó a cabo. Luego de esto, recortamos únicamente las
manchas correspondientes a la curva tipo, es decir de ácido
glutámico así como también las manchas del problema y
testigo de la reacción de transaminación añadiendo 1 mL de
solución de Ninhidrina al 1% en etanol para eluir las
muestras. En este punto es utilizada ya que todos los
aminoácidos cuando se calientan con ninhidrina pueden
formar complejos de color, en este caso obteniendo azul de
Ruhemann por lo que pudimos leer en el espectrofotómetro a
540 nm los tubos anteriormente calentados y diluidos con 5
mL de acetona al 75%, y así obtener las absorbancias
correspondientes para la realización de la curva tipo de
glutámico (Gráfica 1).
Conclusiones
1. Se obtuvo Ácido Glutámico a partir de la reacción
de transaminación a partir de la transferencia de un
grupo amino de la Alanina a un ∝-cetoácido
aceptor.
2. La cantidad de enzima necesaria para producir un
micromol de Ácido Glutámico por gramo de hígado
por hora de incubación fue de 866.136 .
3. Se obtuvieron 57.165 μmoles de Ácido Glutámico
en la reacción de transaminación efectuada.
4. La producción de Ácido Glutámico por la TGP se
puede cuantificar mediante el método de
cromatografía en papel y otro método
espectrofotométrico.
Referencias bibliográficas
1. Donald Voet, Judith G. Voet Editor. 2006. Bioquímica. Ed.
Médica Panamericana,
2. Jan Koolman, Klaus-Heinrich Röhm, Bioquímica: texto y atlas,
2005 Médica Panamericana, 488 pp.
3. Jiménez E; Pauta V: Peña R. ​Transaminasas Séricas en personas
de 23-42 años de la ciudad de Cuenca, Ecuador. ​Universidad
Cuenca, Facultad de Ciencias Médicas
 4. Lehninger AL; Nelson DL; Cox MM. 2006. Principios de
Bioquimica. 2da edición. Ediciones Omega
Pregunta extra
Reacción general del Fosfato de Piridoxal o Piridoxal Fosfato (PLP).

Figura 2. ​Mecanismos de reacción del Fosfato de Piridoxal. ​Transformación facilitada en el carbono ∝ de aminoácidos
facilitada por el Piridoxal fosfato. ​En forma activada se transamina fácilmente con formación de una nueva base de Schiff
(aldimina externa). (A) Aldimina externa mediante transaminación. (B) Aldimina externa mediante racemización (C) Aldimina
externa mediante descarboxilación. Recuperado de Lehninger AL et al. (2006).