DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS EN PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN DIAGRAMA DE TRABAJO RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En un tubo de Los aminoácidos azufrados como Metionina y Cisteína se reconocen por la
La metionina, la cisteína, la homocisteína y la taurina son los 4 aminoácidos comunes que contienen azufre, pero solo la metionina y la cisteína están ensaye vierta 1ml de formación de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se
presentes en las proteínas. La metionina es un aminoácido esencial necesario para la síntesis de otros aminoácidos y de proteínas. Tiene una función muy clara de huevo forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino. El grupo tiol
importante como donante de metilo, esta capacidad de donar su grupo funcional le permite reaccionar para formar otras moléculas. La metionina y la (SH) de la cisteína es nucleofílico y fácilmente oxidable. La reactividad aumenta
cisteína son aminoácidos azufrados que se encuentran metabólicamente relacionados. La cisteína tiene un papel importante para la estructura de las cuando el tiol es ionizado y los residuos de cisteína en proteínas tienen valores de
proteínas ya que gracias al grupo tiol que tiene este aminoácido, puede formar uniones llamadas puentes disulfuro, son un enlace covalente fuerte entre pH cercanos a la neutralidad. El enlace disulfuro es un enlace covalente que se
dos cisteínas y a estos dímeros de cisteínas que encontramos en las proteínas, se les llama cistinas. Esta característica es muy importante para el análisis Agregue dos gotas produce cuando dos grupos sulfhidrilo (SH) reaccionan para formar un puente
Añada 1ml de la
de la estructura primaria de las proteínas, para los efectos sobre los cambios en la estructura secundaria y para la estabilización de la estructura terciaria de acetato de plomo disulfuro “S-S” (enlace entre átomos de azufre). Dicho enlace se forma por
solución de NaOH
y cuaternaria. La formación de un enlace disulfuro resulta de la oxidación de dos grupos tiol o sulfhidrilo de cisteína, con la liberación de dos electrones. y observe oxidación de los grupos SH, es decir, en presencia de oxígeno, se liberan los
hidrógenos de los grupos SH y los átomos de azufre quedan enlazados. Como vimos,
Los enlaces disulfuro se pueden romper mediante la adición de agentes reductores. Los agentes más comunes para este propósito son el ß-mercaptoetanol
esta reacción es específica para aminoácidos con azufre presente en la molécula,
(BME) o el Ditiotreitol (DTT). Para su identificación podemos emplear el reactivo de Ellman, el reactivo de Ellman es ácido 5,5'-ditio-bis-(2-
esto debido a que se produce la hidrólisis alcalina del grupo sulfhidrilo o tiol (SH),
nitrobenzoico), también conocido como DTNB, un compuesto utilizado para cuantificar los grupos sulfhidrilo libres en solución. DTNB reacciona con
formándose sulfuro de sodio (Na2S) (Reacción 1). Posteriormente, el plomo
un grupo sulfhidrilo libre para producir una mezcla de ácido disulfuro y 2-nitro-5-tiobenzoico. El objetivo de DTNB en esta reacción es la base conjugada
desplaza al sodio, dando como resultado sulfuro de plomo (PbS), un precipitado
(R-S-) de un grupo sulfhidrilo libre. El reactivo de Ellman, se utiliza como reactivo cromogénico. DTNB tiene un enlace disulfuro altamente reactivo, lo
(ptdo) de color gris o negro (Reacción 2)
que da como resultado un disulfuro mixto con grupos tiol libres al escindir DTNB y la liberación de un ácido 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB). El TNB Caliente en el baño
resultante tiene un máximo de absorción en la región visible del espectro a 412 nm y se puede medir usando un espectrofotómetro. También, el átomo de Retire del baño, deje
maría hasta
enfriar
azufre de la cisteína participa en la formación del grupo sulfhidrilo, que es muy reactivo. El grupo sulfhidrilo de la cisteína se puede considerar también ebullición.
como un factor reductor muy fuerte, que es muy importante para la actividad de muchas proteínas, un oligopéptido (glutatión), tiene una fuerte influencia
en el potencial redox del ambiente en ciertos compartimentos in vivo y puede formar un centro del sitio activo de algunas enzimas, también puede jugar 3. Escriba la reacción entre un aminoácido azufrado, el NaOH y el acetato de
un papel importante en los procesos catalíticos de las enzimas, en el almacenamiento y ajuste de los potenciales de reducción. La metionina es un CONCLUSIÓN plomo
aminoácido natural constituyente de las proteínas de albúmina de huevo. Se estima que alrededor del 8% de los aminoácidos en las claras de huevo son
Se logró el reconocimiento de aminoácidos azufrados Aminoácido azufrado más hidróxido de sodio
aminoácidos que contienen azufre (metionina y cisteína).
dentro de la proteína ovoalbúmina, contenida en la clara
COMPOSICION CLARA DE HUEVO de huevo debido a la desnaturalización de la proteína por
acción de la temperatura, lo que permite la interacción
La metionina es un aminoácido natural constituyente de las proteínas de albúmina de huevo. Se estima que alrededor del 8% de los aminoácidos en las del hidróxido de sodio con el azufre de los El sulfuro de sodio se encuentra libre para reaccionar con el acetato de plomo
claras de huevo son aminoácidos que contienen azufre (metionina y cisteína). Su composición química en cuanto aminoácidos y proteínas es la siguiente aminoácidos azufrados (metionina y cisteína) en la
ovoalbúmina generando la sustitución del azufre por
• Ovoalbúmina: Es rica en cisteína y metionina y presenta grupos sulfhídricos OH, llevando a la posterior formación de sulfuro de 4. Diseñe un desarrollo experimental que le permita establecer si la presencia
• Ovotransferrina: Contiene manosa y glucosamina, numerosos enlaces disulfuro plomo, por reacción de acetato de plomo y el azufre de los del azufre, detectada en la proteína de la clara de huevo se debe a la presencia
• Ovomucoide: Presenta manosa, galactosa y ácido neuramínico. Es rica en enlaces disulfuro aminoácidos azufrados, generando como resultado un de puentes disulfuro
• Ovomucina: comprende aproximadamente 3.5% de la proteína en la clara y está fuertemente glucosilada con un contenido de carbohidrato de color negro en la solución, por otro lado la muestra a la
hasta el 33% que no se le agregó acetato de plomo, no presentará Para determinar la presencia de puentes disulfuro se empleará una técnica de
ningún cambio en el color, esto debido a que el agua no modificación química selectiva mediante la reducción con mercaptoetanol o
Conalbúmina: Es una proteína no fosforilada formada por dos cadenas polipeptídicas. No presenta grupos sulfhídrico, pero es rica en enlaces disulfuro. ditioeritrol.
reacciona con el azufre de los aminoácidos y únicamente
Contiene estos de manosa y glucosamina
se observa la desnaturalización de la proteína.
i). Método de Ellman ii). Reducción. iii). Método de Ellman
Figura 2. Aminograma completo de CUESTIONARIO
albúmina de huevo 1. Escriba la fórmula de los aminoácidos azufrados
que podemos encontrar en las proteínas.
Figura 1. Formación de un enlace disulfuro
OBJETIVO

Realiza una reacción preliminar para detectar la presencia de aminoácidos azufrados en una proteína.

2. ¿Cuál es la diferencia entre cisteína y cistina?

MATERIALES Y MÉTODOS
La principal diferencia entre ellos son los componentes detrás de su REFERECIAS
formación; la cisteína se deriva del aminoácido metionina con la
Damodaran, S. (2016) Amino acids, peptides, and proteins. In
MATERIAL colaboración de vitaminas como B-12 y B-6, mientras que la cisteína se
MATERIAL BIOLÓGICO REACTIVOS Fennema’s Food Chemistry, 5th Edition (Damodaran, S., and
forma cuando dos moléculas de cisteína se combinan y se produce el
➢ 2 tubos de ensaye Parkin, K.L., Eds.), CRC Press, pp.235-356
proceso de oxidación. El tiol es susceptible a la oxidación para dar lugar
➢ Clara de huevo ➢ Agua destilada
➢ Gradilla a puentes disulfuros derivados de la cisteína que tienen un importante Ayudas didácticas para QFB: Bioquímica I, Departamento de
➢ NaOH 20%
➢ Pinzas para tubo de ensaye papel estructural en muchas proteínas. La cisteína también es llamada Bioquímica – Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas. BUAP.
➢ Acetato de plomo 0.5%
➢ Baño maría cistina, pero esta última se trata de un dímero de dos cisteínas unidas
➢ 1 pipeta de 5ml mediante un puente disulfuro.