INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLIGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA
CURSO PRCTICO DE MTODOS DE ANALISIS
SEPARACIN DE UNA MEZCLA DE AZUL DE METILENO Y
FLUORESCENA USANDO CROMATOGRAFA POR ADSORCIN
PROFESOR: FERNANDEZ LOPEZ FRANCISCO CARMELO
CEVADA SANTIAGO KAREN JAZMIN 5QM1 SECC. 4
OBJETIVOS

Aplicar la tcnica de cromatografa por adsorcin para la separacin de dos colorantes

Comprobar la separacin con base en el perfil de elucin

FUNDAMENTO

Un rasgo caracterstico de la cromatografa es la presencia de dos fases; dispuestas de

tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase
estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de l (fase mvil). La clave de la separacin
en cromatografa es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de
su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribucin). En general, los
componentes ms afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (ms retenidos)
mientras que los ms afines a la fase mvil (menos retenidos) se mueven con mayor
rapidez. Por consecuencia, el medio cromatogrfico (columna, placa o papel) funciona
como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla,
logrando as su separacin y mediante el uso de un detector, su caracterizacin
qumica.

La cromatografa lquida de adsorcin se caracteriza por utilizar una fase estacionaria

slida (Adsorbente) de carcter polar y una fase mvil lquida (Eluyente) apolar, y se
utiliza tanto con fines analticos (identificacin de sustancias) como con fines
preparativos (aislamiento), siendo su limitacin ms importante la dificultad de
separar sustancias de polaridad parecida. En este tipo de cromatografa, la fase
estacionaria la constituye un slido poroso finamente granulado, siendo el proceso de
adsorcin debido a las atracciones intermoleculares dipolo-dipolo o puentes de
hidrgeno entre los componentes de la muestra y el adsorbente. El adsorbente ms
utilizado es el gel de slice, aunque tambin se utiliza almina activada. Por otra parte,
la fase estacionaria debe ser qumicamente inerte con las sustancias que se pretenden
separar, por lo que hay que tener en cuenta que el gel de slice tiene carcter cido,
mientras que la almina puede adquirirse con carcter cido, bsico o neutro.
La fase mvil est constituida por una mezcla de disolventes que deben ser, al menos,
parcialmente solubles. Para una fase mvil determinada, cuanto ms polar sea la
sustancia de la muestra, ms va a ser retenida por la fase estacionaria (o menos
arrastrada por la fase mvil), mientras que por lo que respecta a la velocidad de
elucin de una sustancia determinada, depende de la naturaleza de la fase mvil:
cuanto ms polar sea la fase mvil ms se desactivar la fase estacionaria y, por lo
tanto, menos retenida quedar la sustancia en cuestin, recogindose en el cuadro
adjunto una relacin de los disolventes ms utilizados en esta tipo de cromatografa.

RESULTADOS
Tabla 1.- valores de absorbancia obtenidos para la sepacin de fluorescena y azul de
metileno.
Volumen de elucin (ml) A493 A668
Blanco 0 0
3 0.053 0.033
6 0.113 1.744
9 0.150 1.334
12 0.052 0.140
15 0.002 0.048
18 0.069 0.046
21 0.050 0.030
24 0.072 0.046
27 0.046 0.038
30 0.007 0.084
33 0.057 0.104
36 0.030 0.036
39 -0.012 0.004
42 0.028 0.030
45 0.017 0.012
48 0.041 0.031
51 0.037 0.028
54 -0.008 0.008
57 0.055 0.052
60 0.030 0,026
63 -0.004 0.001
66 0.198 0.026
69 0.644 0.014
72 0.676 0.037
75 0.469 0.034
78 0.220 0.006
81 0.156 0.046
84 0.089 0.032
87 0.030 0.001
90 0.060 0.035
 PERFIL DE ELUCIN DE UNA MEZCLA DE AZUL
DE METILENO Y FLUORESCENA
2

Azul de metileno
1.8

1.6

1.4

1.2
ABSORBANCIA

0.8 Fluorescena

0.6

0.4

0.2 Azul de metileno Fluorescena

0
9

78
3
6

12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48
51
54
57
60
63
66
69
72
75

81
84
87
90
Blanco

-0.2
VOLUMEN DE ELUCIN (ML)

Absorbancia a 493 nm Absorvancia a 668 nm

Figura1.- Grfica del perfil de elucin de una mezcla del azul de metileno y la fluorescena con
base al volumen de elucin y su absorbancia a 493nm y 668 nm. Con un blanco de agua destilada
para ambas absorbancias.

DISCUSIN

La separacin de la fluorescena y el azul de metileno en la cromatografa

existieron varios aspecto que lograron la separacin, entre ellos se encuentra
la fase estacionaria la cual era la almina cida pH 5, el valor de pH hace que
las molculas que constituyen esta fase estn cargadas positivamente, y al ser
el azul de metileno una molcula con carga positiva se repelen entre s creando
una interaccin intermolecular (fuerzas de van der Waals), aunado a eso el azul
de metileno al ser una molcula polar y el agua ser polar tambin provocaba
una solubilidad del compuesto haciendo que se pudiera eludir, por otro lado
la fluorescena es de tipo apolar teniendo una carga negativa, por lo cual por
fuerzas de atraccin entre ambas molculas haciendo que la fluorescena no
pudiera eluir dndose en este momento el proceso de adsorcin que se debe a
interacciones intermoleculares de tipo dipolodipolo o enlaces de hidrgeno entre el
soluto y el adsorbente, por lo tanto fue el segundo colorante en ser arrastrado,
para lo cual se necesit que la fase mvil se cambiara por el regulador de
fosfato con pH 12, el cambio del pH hace que la almina se alcalinice y por
tanto generar desprotonacin de sus molculas, con lo cual las fuerzas de
atraccin se convierten en fuerzas de repulsin logrando de esta manera que
la fluorescena se eluya y salga de la columna.

Al realizar las lecturas de absorbancia en el equipo, para ambas muestras se

utiliz agua destilada, lo cual afect en el tamao de los picos del perfil de
elucin a Absorbancia de 493 nm. En el perfil de elucin se puede ver una gran
resolucin entre los picos ms altos de la grfica, lo cual indica una separacin
de la mezcla. Entre la resolucin de los grficos se observan una serie de picos,
estos son resultado de un volumen desproporcional en la serie de tubos
utilizados, ya que si uno posee una gota de ms puede concentrar ms ese tubo
(aumentando su absorbancia), en cambio si el tubo tiene una gota de menos
disminuye su concentracin y por tanto su absorbancia. Otro aspecto a
destacar del perfil de elucin a A 493 nm, es que el pico correspondiente al azul
de metileno es de tamao pequeo y esto puede ser debido a la velocidad del
eluyente, debido que al comenzar la cromatografa se cerr el flujo de las gotas
por un momento y despus se abri nuevamente, creando en ese momento
que el primer tubo no presentara coloracin y el segundo fuera muy colorido.

La lectura a absorbancias establecidas reside en que las molculas a ese

parmetro puedan absorberla y por tanto generan espectro caractersticos por
tanto la longitud de onda que produce que una molcula tenga una
absorbancia mxima la hace caracterstica y pueda identificarse que para el
caso del azul de metileno es a 668 nm y de la fluorescena a 493 nm.

CONCLUSIN

El perfil de elucin comprob la separacin cromatogrfica de la mezcla de azul de

metileno y fluorescena.

La cromatografa de adsorcin es efectiva para la separacin de compuestos de

distinta polaridad.

La fase mvil de la cromatografa de adsorcin debe ser de polaridad igual a la de la

sustancia a separar.

CUESTIONARIO

1.- Especifique y defina los elementos del sistema cromatogrfico para esta separacin

En la realizacin de esta prctica se tuvieron como elementos del sistema

cromatogrfico de adsorcin a la fase estacionaria, la fase mvil, el soporte y la mezcla
de colorantes.

Tipo de soporte: atendiendo al modo en que se lleva a cabo la separacin (como se

ponen en contacto las fases). La utilizada fue un soporte de columna (cromatografa
en columna), donde la fase estacionaria se introduce en un tubo estrecho a travs del
cual se hace pasar la fase mvil.

Mezcla de colorantes: conjunto muestras problemas que se encuentran unidos en

solucin y que se desean separar en base a su polaridad hacia ciertos eluyentes.

Fase mvil: disolventes que deben ser, al menos, parcialmente solubles; para una fase
mvil determinada, cuanto ms polar sea la sustancia de la muestra, ms va a ser
retenida por la fase estacionaria (o menos arrastrada por la fase mvil), mientras que
por lo que respecta a la velocidad de elucin de una sustancia determinada, depende
de la naturaleza de la fase mvil: cuanto ms polar sea la fase mvil ms se desactivar
la fase estacionaria y, por lo tanto, menos retenida quedar la sustancia en cuestin.
Los disolventes utilizados fueron agua destilada y regulador de fosfatos 0.1 N pH 12.

Fase estacionaria: slido poroso finamente granulado, siendo el proceso de adsorcin

debido a las atracciones intermoleculares dipolo-dipolo o puentes de hidrgeno entre
los componentes de la muestra y el adsorbente. El adsorbente utilizado es la columna
de almina cida (pH5) activada.

2.- Defina el trmino adsorcin y, empleando frmulas, esquematice que fuerzas

intermoleculares participan en el proceso de separacin de los solutos.

La adsorcin es la capacidad de las superficies para fijar molculas de gas o lquidos.

La separacin de los solutos es debido a las fuerzas de atraccin que mantienen

las molculas de gas o lquido en la superficie del slido que son las fuerzas de
Vander Waals y cuya frmula es: ( p+ (n2 ) (a)/ V2 ) (V nb) = nRT ; donde: p es
la presin del fluido, V es el volumen total del recipiente en que se encuentra el fluido,
a mide la atraccin entre las partculas , b es el volumen disponible de un mol de
partculas, n es el nmero de moles, R es la constante universal de los gases
ideales, T es la temperatura, en kelvin.

3.- Considerando las propiedades de solubilidad de los colorantes, indique qu

modificaciones hara para invertir el orden de la elucin.

Para invertir el orden y que la fluorescena eluya primero, cambiara las fases mviles,
empezara con el regulador de fosfatos de pH 12 y despus lo cambiara por el agua
destilada, con la cual eludira el azul de metileno.

4.- Frmula de la almina de Brockmann

Frmula Hill: AlO

BIBLIOGRAFA

McMurry, John. (2008). Qumica Orgnica. Mxico, Distrito Federal.CENGAGE

Learning. Sptima edicin.

Cromatografa Lquida de Adsorcin. [Internet] Disponible en:

https://rodas5.us.es/file/23a16560-123f-bec5-ec5b-
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Is now Merck 101078 | Aluminio xido 90 activo cido (0,063-0,200 mm). [Internet]
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Site/es_ES/-/MXN/ProcessMSDS-Start?PlainSKU=MDA_CHEM-101078&Origin=PDP
[acceso 26 de agosto del 2017].

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http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/Quimica%20analitica%20ambien
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