INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE GENÉTICA MICROBIANA

Grupo: 6QV1

Sección 2

Reporte de Práctica 6 “REACCIÓN EN CADENA DE LA

POLIMERASA (PCR)”

Elaborado por Equipo 7:

• Martínez Torres Ricardo

• Mendoza Gallegos Natalia Verónica

Profesores:
• Verónica Pérez Enríquez
• Francisco Español Español
• Octavio Gómez Guzmán
• Sergio Mora Ramírez

Fecha de entrega: 13/06/23

OBJETIVO GENERAL.
Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del DNA de interés clonado en la
práctica de transformación.
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE.

• Entender los fundamentos básicos de la reacción en cadena de la polimerasa

(PCR).
• Identificar los diferentes componentes de la PCR y el fundamento de su utilización
en la reacción.
• Deducir las concentraciones y volúmenes a utilizar de cada uno de los reactivos y
componentes de la PCR en volumen de reacción.
• Entender los fundamentos de la técnica de la electroforesis.
• Identificar algunas aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa.

RESULTADOS.

Fig. 1 Gel de agarosa tras el corrimiento electroforético (90 V, 30 minutos, 1% agarosa) de las PCR efectuadas
para pRSET-mCherry y pRSET-NS1.

Tabla 1 Datos empleados para la construcción de la gráfica que permite estimar el tamaño de las bandas
obtenidas a partir del marcador 1 Kb de ThermoFisher .

Número Tamaño (pb) Distancia de

de banda migración (cm)

1 10,000 4.8
2 8,000 5.2
3 6,000 5.69
4 5,000 6
5 4,000 6.5
6 3,500 6.8
7 3,000 7.2
8 2,500 7.7
9 2,000 8.5
10 1,500 9.4
11 1,000 10.9
 12 750 11.9
13 500 13.5
14 250 15.2
Nota: Todas las distancias de migración expuestas se obtuvieron a partir de una ampliación e impresión de la
imagen del gel en una hoja tamaño carta.

Fig. 2 Gráfica obtenida a partir de la Tabla 1. Se señalan sólo dos de las interpolaciones realizadas para los
amplificados del Pozo 1= (•) y del Pozo 5 = (•).

Tabla 2 Tamaño en pares de bases de las bandas obtenidas por electroforesis de la PCR con pRSET-mCherry
y pRSETNS1
Pozo Inserto Presencia Distancia de log obtenido Tamaño Número de
por
en vector de migración (pb) bandas
interpolación
amplificón del adicionales
amplificado
(cm)

1 NS1 Sí 11.6 2.91 813 2

2 NS1 Sí 11.7 2.9 794 2
3 NS1 Sí 11.2 2.96 912 2
4 NS1 No - - - 2
5 NS1 Sí 11.3 2.95 891 1
7 NS1 Sí 11.4 2.93 851 2
8 mCherry No - - - 0
9 mCherry No - - - 0
DISCUSIÓN.

Los resultados obtenidos concuerdan parcialmente con los resultados esperados, ya que
las bandas que se obtuvieron oscilan entre las 800-900 pb, cercano al aproximado de 1103
pb esperado para el amplificón (el tamaño del gen NS1), sin embargo, se aprecian dos
bandas más de lo esperado, lo cual se considera que se trata del DNA recombinante que
se empleó para la amplificación; que comparte cierta similitud a lo visto en la práctica de
transformación cuando los plásmidos no eran digeridos con ninguna enzima de restricción.
La banda que se encuentra hasta el final del corrimiento de todos los carriles corresponde
a los primers o posibles dímeros de primers que se hayan formado (alta migración debido
a su bajo tamaño), considerando que dicha banda aparece en el testigo negativo donde se
agregaron los oligos pero no DNA. Es entonces que se aprecia un patrón donde a medida
que se avanza en los pozos, la intensidad de esta banda disminuye, muy posiblemente
debido a que conforme se transferían los reactivos entre los equipos para cada reacción,
estos disminuían su cantidad, siendo notorio que en la reacción del carril 1 donde se
agregaron primero los primers estos son abundantes mientras que en el carril 5 ya casi no
es notoria dicha banda, donde para el carril 7 se proporcionaron nuevamente primers ya
que estos se habían agotado. A partir de esto, se puede establecer que el problema en
aquellas reacciones donde no hubo gran amplificado (Carril 1 y 3) no reside en la cantidad
de primers ya que incluso en el carril 4 donde no hubo gran cantidad de los mismos, existió
amplificado. Adicionalmente, tampoco se podría considerar que las condiciones de la PCR
o de la electroforesis hayan influido como se discutirá más adelante para el carril 4. Es
entonces que para el carril 1 y 3 se pueda pensar que pese a la notable cantidad en exceso
de primers, la estructura del DNA recombinante no permitió una correcta hibridación y
eventual extensión, la cual forzosamente debe llevarse ya que la DNA polimerasa
DreamTaq DNA dependiente es una polimerasa de alto rendimiento y sensibilidad. Entre
posibles factores que puedan alterar la calidad/ integridad o pureza del DNA son; nucleasas
contaminantes, reactivos residuales de la purificación del DNA (EDTA, fenol, SDS, etc),
sales/ iones residuales (Na+, K+) que inhiben a las DNA polimerasas. (ThermoFisher
Scientific, s.f.). El papel de las nucleasas inespecíficas pudo ser importante considerando
que estas pueden generar las bandas manchadas o en forma de frotis observadas en gran
parte de las amplificaciones para NS1.

Tal como ya se mencionó previamente, para el caso del carril 4 donde no existió amplificado
se descarta que las condiciones en las que se llevó la electroforesis y los ciclos planteados
para la reacción (tiempos y temperaturas) hayan influenciado en la falta de la banda del
amplificón, pues el resto de carriles de PCR para NS1 si permitieron la observación de dicha
banda. Asimismo, no se considera que el problema resida en los componentes de la Master
Mix o del aguan inyectable pues nuevamente el resto de amplificaciones también usaron la
misma mezcla de reacción y el carril 10 no indica contaminación de los reactivos. Es
entonces que nuevamente se puede pensar que el DNA molde o los primers sean los
causantes de este resultado. Por una parte, los primers pudieron no agregarse debido al
poco volumen que se emplea de los mismos, lo que incrementa el margen de error al
momento del pipeteo, aunque debido a la presencia de la banda al final del corrimiento esto
puede no ser del todo cierto. En lo que respecta al DNA molde este pudo encontrarse
ausente o en concentraciones extremadamente bajas (<1 ng), aunque esto es debatible ya
que se observa una ligera banda manchada (“smear band”), lo que indica que si se agregó
en cantidad suficiente DNA. Otra de las razones y de forma similar al pozo 1 y 3, puede ser
que la muestra de DNA no fuera de buena calidad o contara con la presencia de algún
inhibidor de la reacción (New England BioLabs, s.f.), es decir, se cuestiona la pureza del
DNA.

En los carriles donde se colocó pRSETmCherry (8 y 9) no presentaron amplificón, ya que,

pese a que la fracción previa a los primers usados puedan hibridar con las secuencias
complementarias a los sitios de reconocimiento de BamHI y HindIII en pRSETmCherry, la
falta de complementariedad con el primer propiamente dicho, hace que no se complete la
hibridación y en consecuencia, no se lleve la amplificación, recordando que el primer está
diseñado exclusivamente para NS1.

CONCLUSIONES.
• La hibridación es un proceso en la PCR altamente específico; donde, aunque
segmentos adicionales al primer puedan hibridar con una secuencia diferente a la
deseada, no se completará la misma y en consecuencia no habrá amplificado.
• La cantidad de primers agregados no fue una limitante para efectuar la PCR, ya que
incluso en aquellas reacciones donde los oligos estaban en menor cantidad se pudo
obtener amplificado.
• La falta de amplificado se pudo relacionar con la calidad y cantidad de DNA
recombinante aislado.
• Los ciclos planteados, la temperatura y duración de cada etapa en los ciclos así
como la estructura de los primers propuesta resulta adecuada para la amplificación
del inserto NS1.
BIBLIOGRAFÍA.
• New England BioLabs (s.f.). PCR Troubleshooting Guide. Recuperado el 12 de junio
de 2023 de https://international.neb.com/tools-and-resources/troubleshooting-
guides/pcr-troubleshooting-guide
• ThermoFisher Scientific (s.f.). PCR Troubleshooting Guide. Recuperado el 12 de
junio de 2023 de https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-
science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-
education/pcr-reagents-enzymes/pcr-troubleshooting.html