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DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY Y

MÉTODO DE BRADFORD

Grupo: 5QM2

SECCIÓN: 2

Profesores:
 Olguín Ruiz Gabriela Edith
 Acuña González Carolina
 Cabrera Martínez Rosa Martha
 Fernández López Francisco Carmelo

Objetivos
 Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método
fotométrico.
 Determinará si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la exactitud entre
los métodos de Bradford y Lowry.
 Conocerá el efecto de sustancias no proteínicas en el desarrollo del color.
 Analizará las ventajas y desventajas del método de Lowry, con respecto a otros métodos para
la cuantificación de proteínas
Fundamento
 Método de Lowry
El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las
proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las
proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la
ley de Lambert-Beer A= ε.l.c
Este método consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los
átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color
azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína,
exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina y triptófano que van a participar en la segunda
etapa de la reacción.
El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.
2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos
fenólicos de los residuos de tirosina y triptófano, presentes en la mayoría de las proteínas,
actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau
es el ácido fosfomolibdotúngstico,de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos
da lugar a un complejo de color azul intenso.
 Método de Bradford
Se emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ac. fosfórico
tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína,
origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Para el ensayo se utiliza el
colorante Coomassie Brillant Blue G250. Se basa en la conversión de la forma leuco del
colorante (marrón-naranja) a una de color intensamente azul cuando los grupos aniónicos del
colorante interaccionan con los grupos amino de las proteínas. Dicha reacción se mide por
absorbancia a 595nm. Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica
entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la
presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos como el
metanol.

Resultados
 Lowry
Tabla 1. Curva de calibración de hemoglobina.
Tubo Cantidad de proteína (μg) Serie a Serie b
1 25 0.061 0.078
2 50 0.113 0.12
3 75 0.174 0.169
4 100 0.211 0.221
5 125 0.269 0.263

Tabla 2. Replicas para el análisis estadístico.


Tubo A590 Cantidad de proteína (μg)
1 0.182 81.93
2 0.154 68.09
3 0.17 75.99
4 0.183 82.42
5 0.165 73.51
6 0.185 83.41
7 0.168 75
8 0.186 83.91
9 0.18 80.94
10 0.164 73.01

Tabla 3. Resultados del análisis estadístico.


Media S S2 % CV μ
77.82 5.414 29.31 6.95 73.96, 81.68

Tabla 4. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el método de Lowry


Cantidad de
proteína
Tubo Sustancia A590 (μg) Interferencia
1 Fenol 1% 1.934 949.25 +
Mercaptoetanol
2 0.1% 0.198 89.85 +
3 Tris 1M pH 10 0.161 71.53 -
4 Urea 5% 0.191 86.38 +
5 (NH4)2SO4 0.166 74 No es interferencia
6 Tris 1M pH 7 0.165 77.39 No es interferencia
7 Glicerol 1% 0.168 78.82 No es interferencia
8 Detergente 1% 0.176 82.64 No es interferencia
9 SDS al 1% 0.184 76.91 +
10 TCA al 5% 0.166 77.86 No es interferencia

r=0.998
r2=0.996
a=0.0165
b=2.02x10-3
Gráfica 1. Curva de
calibración de la
concentración de
hemoglobina con la
absorbancia.
Si cumple la Ley de Bouger
y Beer, entre 25 μg y 125 μg
Y= Absorbancia, x= concentración de la proteína.

 Bradford

Tabla 5. Curva de calibración de hemoglobina.


Tubo Cantidad de proteína (μg) Serie a Serie b
1 25 0.216 0.26
2 50 0.365 0.344
3 75 0.425 0.433
4 100 0.489 0.499
5 125 0.612 0.579

Tabla 6. Replicas para el análisis estadístico


Tubo A595 Cantidad de proteína (μg)
1 0.426 74.65
2 0.405 67.36
3 0.395 63.88
4 0.424 73.95
5 0.352 48.95
6 0.413 70.13
7 0.376 57.29
8 0.418 71.87
9 0.418 71.87
10 0.402 66.31
Tabla 7. Resultados del análisis estadístico.
Media S S2 % CV μ
66.62 8.11 65.77 12.17 60.81, 72.42

Tabla 8. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el método de Bradford


Tubo Sustancia A595 Cantidad de proteína (μg) Interferencia
1 Fenol 1% 0.423 73.61 +
Mercaptoetanol
2 0.1% 0.445 81.25 +
No es
3 Tris 1M 0.412 69.79 interferencia
4 Urea 5% 0.489 96.52 +
5 (NH4)2SO4 0.54 114.23 +
6 Tris 1M pH 7 0.5 103.83 +
7 Glicerol 1% 0.507 105.62 +
8 Detergente 1% 0.25 39.89 -
9 SDS al 1% 0.192 25.06 -
10 TCA al 5% 0.479 98.46 +

r=0.995
r2=0.990
a=0.211
b=2.88x10-3

Gráfica 8. Curva de calibración de la concentración de hemoglobina con la absorbancia.


Si se cumple la Ley de Bouger y Beer entre 50 μg y 125 μg.
Tabla 9. Comparación del Método de Lowry con el método de Bradford
Lowry Bradford
Etapas Dos etapas Una etapa
Tiempo de reacción 40 minutos 10 minutos
Tiempo de estabilidad 120 minutos 60 minutos
Costos Más caro Más económico
Longitud de onda (λ) 590 nm 595 nm
Color Azul Azul brillante
Material Es fácil lavarlo, no tiñe el Tiñe el material
material
Tabla 10. Datos para la prueba t de Student y F de Fisher
Bradford Lowry Diferencia (B-L) Di-Dx (Di-Dx)2
74.65 81.93 -7.28 3.92 15.33
67.36 68.09 -0.73 10.47 109.52
63.88 75.99 -12.11 -0.91 0.84
73.95 82.42 -8.47 2.73 7.43
48.95 73.51 -24.56 -13.37 178.62
70.13 83.41 -13.28 -2.09 4.35
57.29 75 -17.71 -6.52 42.45
71.87 83.91 -12.04 -0.84 0.71
71.87 80.94 -9.07 2.13 4.52
66.31 73.01 -6.70 4.50 20.21
Dx= -11.20
Tabla 11. Análisis estadístico t de Student y F de Fisher
Dx S S2 ttablas tcalculada Ftablas Fcalculada
-11.20 6.53 42.64 2.62 -5.42 4.03 2.24
% error= (valor obtenido-valor esperado/ valor esperado) *100= 77.82-75/75*100=3.76
% exactitud= 100-% error= 100-3.76= 96.24
% precisión= 100-%CV= 100-6.95= 93.05
Cálculos
Cantidad de proteína (teórica)
(0.25𝑚𝑔)(0.1𝑚𝐿)
𝑥1 = = 0.025𝑚𝑔
1𝑚𝐿
𝑥1 = (0.025𝑚𝑔)(1000µ𝑔) = 25 µ𝑔
Cantidad de proteína (real) Bradford

𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎 𝑥 = 𝑦 − 𝑎/𝑏
𝑦 = (2.88𝑥10−3 )(𝑥) + 0.995 𝑥 = 0.426 −0.0165/2.88x10-3
X= 74.65 μg

Cantidad de proteína (real) Lowry

𝑥 = 𝑦 − 𝑎/𝑏
𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎 𝑥 = 0.183 −0.998/2.02x10-3
𝑦 = (2.02𝑥10−3 )(𝑥) + 0.998 X= 82.42 μg

Límites de confianza
𝑡𝑠
µ=𝑥± T=2.262
√𝑛

(2.262)(5.41)
µ = 77.82 + = 81.68
√10

(2.262)(5.41)
µ = 77.82 − = 73.96
√10

Prueba t de Student y F de Fisher


𝑫√𝒏
𝒕𝒄 =
𝑺𝑫
(−𝟏𝟏. 𝟐𝟎)√𝟏𝟎
|𝒕𝒄 | = = −𝟓. 𝟒𝟐
𝟔. 𝟓𝟑
𝑆 2 𝐵𝑟𝑎𝑑𝑓𝑜𝑟𝑑
Fc: 𝑆 2 𝐿𝑜𝑤𝑟𝑦
65.77
𝐹𝑐 = = 2.24
29.31

Discusión
El valor de R2 obtenido en el método de Bradford fue de 0.995 por lo cual si podemos afirmar que
cumple la ley de Bouguer y Beer, ya que como se puede observar en la Gráfica 8, la curva de
calibración realizada muestra un comportamiento lineal, en donde la absorbancia es directamente
proporcional a la concentración, entre mayor cantidad de proteína mayor será la absorbancia, aunque
la curva cumple la ley, su R2 no es tan confiable ya que en la literatura nos dice que para que este sea
un valor confiable debe de ser de 0.999, los resultados de esta curva de calibración pudieron deberse
a diversos factores como son el error del analista, que las pipetas, tubo y otro material usados
estuvieran sucios o mal lavados, que las pipetas estuvieran rotas por lo cual al adicionar los reactivos
hubieran errores, que la proteína estuviera contaminada con otras sustancias desconocida, entre otros
factores.
En la evaluación de interferentes en el método de Lowry se observa que el Tris a una concentración
de 1 M y a pH de 10 presenta una interferencia negativa, esto se debe a que los grupos amino
presentes en la molécula secuestran los iones cúpricos evitando que estos desnaturalicen a las
proteínas, y por lo tanto, evitando que grupos reductores interactúen con el reactivo de Folin,
disminuyendo la coloración de la solución, debido a que la interacción entre el colorante y las proteínas
es por puentes de hidrógeno entre los grupos amino presentes en las proteínas con los grupos sulfito
de la proteína los cuales sólo interactúan en pH ácidos, y los buffers al dar a la solución un pH neutro
y básico respectivamente evita la formación de esta interacción. En el caso de la interferencia positiva
presentada por SDS al 1% por mercaptoetanol al 0.1% el aumento en la coloración es resultado de la
gran actividad reductora que presenta el azufre, en los grupos sulfato y mercapto, promoviendo la
reducción del reactivo de Folin promoviendo el aumento de absorbancia, en contraste el detergente
comercial 1% no presenta interferencia debido a que la concentración de este es tan baja en la solución
que la actividad de desnaturalización del detergente sea despreciable. El fenol presenta la interferencia
positiva más notoria debido a que es un muy buen agente reductor del reactivo de Folin, además de
tener en su estructura anillo aromático como los aminoácidos que reaccionaban con el reactivo
(cisteína y triptófano) promoviendo que de una coloración azul la solución presente un tono azul intenso
casi negro.
Los detergentes son los que provocan interferencia en el método de Bradford, esto se debe a que
puede afectar a la proteína, solubilizándola y disminuyendo la cantidad y es el mismo caso con el SDS
que tiene una mayor concentración de agente tenso activo que el detergente comercial en donde
observamos que la cantidad de proteína es menor a la del detergente. En el caso de nuestros
resultados obtuvimos que los detergentes no son una interferencia, esto pudo deberse a un error en
los analistas al hacer la determinación, o que no se agregó el reactivo de la interferencia y por ello no
causo el resultado esperado.
Las demás sustancias si mostraron ser interferencias positivas, pero no aumentan la absorbancia de
una manera exagerada comparándola como en el caso del fenol con el método de Lowry, y la única
sustancia que no es interferencia en este método es el Tris 1M en pH de 10.
Al observar los resultados del análisis estadístico de los dos métodos tenemos que la t calculada (-
5.42) es mayor a la t de tablas (2.62) lo que nos indicaría que si hay una diferencia significativa en la
exactitud de los métodos, y en la prueba de Fisher obtuvimos una f calculada de 2.24 y la F de tablas
es de 4.03, ya que la F calculada es menor a la de tablas podemos decir que no hay diferencia
significativa, por lo tanto, si hay precisión en nuestros métodos, estos resultados son en cierta manera
confiables porque si puede existir la precisión sin la exactitud, pero exactitud sin precisión es imposible.
De manera indirecta podemos decir que lo que carece de exactitud son las analistas, ya que se
observaron varias discrepancias en los resultados esperados por ejemplo en cuanto a las
interferencias, aunque también el coeficiente de variación de cada uno de los métodos, la desviación
estándar y la varianza nos indica que hay un error por parte de los analistas, así que se debe trabajar
en mejorar el desempeño, sobre todo a la hora de agregar las cantidades de las soluciones.
Al calcular el % de exactitud obtuvimos 96.24 y % de precisión de 93.05, lo que a diferencia de las
pruebas anteriores nos indica que hay tanto precisión como exactitud en los métodos, aunque se
ocuparon los datos del método de Lowry por ser más confiables y cercanos a lo esperado. Se podría
decir que el método de Lowry es más preciso y exacto, pero no podemos asegurarlo ya que la curva
tipo, el análisis estadístico y las interferencias fueron realizados por diferentes analistas, así que para
realmente asegurar cual de los dos métodos es más confiable se necesitaría que una sola persona
hiciera las tres pruebas en los dos métodos.

Determinación de proteínas por el método de Biuret


•Fundamento
Al formar complejos los iones cúpricos con los enlaces peptídicos de las proteínas se produce un color
violeta morado bajo condiciones alcalinas. morado bajo condiciones alcalinas.
La absorbancia del color producido es leída a 540nm.
La intensidad del color (absorbancia) es proporcional al contenido proteico de la muestra.
Ventajas
Rápido (se puede completar en menos de 30 minutos) •es el método más simple de análisis de
proteínas •no es frecuente encontrar derivaciones de color •pocas substancias no protéicas interfieren
con la •pocas substancias no protéicas interfieren con la reacción de biuret •no detecta n2de fuentes
no protéicas o no peptídicas.
Desventajas
No es muy sensible comparado con el método de lowry •requiere de al menos 2 a 4 mg de proteína
por prueba •las concentraciones altas de sales de amonio interfieren con la reacción •puede ocurrir
opalescencia en la solución final si están presentes altas concentraciones de lípidos o carbohidratos
•debe estandarizarse el color mediante cantidades de proteína conocidas.

Ventajas del método de Lowry


Muy sensible •menos afectado por la turbidez de la muestra muestra •más específico que la mayoría
de los otros métodos •relativamente simple •se puede completar en 1 a 1.5 hora.
Desventajas
el color varía con diferentes proteínas (más que el método de biuret)
•el color no es estrictamente proporcional a la concentración •el color no es estrictamente proporcional
a la concentración de proteínas
•la sacarosa, lípidos, buffers fosfato, monosacáridos y hexoaminas interfieren con la reacción
•las altas concentraciones de azúcares reductores, sulfato de amonio y compuestos con sulfhidrilo
interfieren con la reacción

Bradford
•método rápido (la reacción se puede completar en 2 minutos)
•reproducible
•sensible (mucho más que el método de lowry)
•no existe interferencia de cationes como k+, na+, y mg+
Ventajas del método de Bradford
•no existe interferencia del sulfato de amonio •no existe interferencia de los polifenoles ni •no existe
interferencia de los polifenoles ni carbohidratos como la sacarosa •mide proteína o péptidos con una
masa molecular aproximadamente igual o mayor de 4 000 daltons.
Desventajas del método de Bradford
•el complejo proteína-colorante formado puede unirse a las celdas de cuarzo
el color varía con diferentes tipos de proteínas. • el color varía con diferentes tipos de proteínas. •la
proteína estándar debe seleccionarse con mucho cuidado
•interferencia con detergentes.

Conclusiones
 Los interferentes positivos en el método de Lowry son el detergente comercial al 1%,
mercaptoetanol al 0.1%, la urea al 5% y el fenol al 1%, siendo este último el más notorio.
 Las interferencias negativas en el método de Bradford son el detergente comercial al 1% y el
SDS al 1%.
 El método de Lowry resultó ser el más preciso y el más exacto.
 Las curvas tipo del método de Lowry y de Bradford siguen la Ley de Bouger y Beer.

Bibliografía
 Bradford, M. M., 1976. “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding”. Anal. Biochem. 72:248-254.
 Miller G., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal.
Chem. 31: 426-428.
 Determinación de la concentración de proteínas, UNAM, recuperado el 2/09/2017 en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MATERIALAPOYOANTECEDENTES_22427.pdf
 García Arellano H., Vázquez Duhalt R., Cuantificación de proteínas: una revisión, Instituto de
Biotecnología UNAM Vol.3, 1998, recuperado el 1/09/2017 en:
http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_1998_2/bitacora.pdf
 http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MATERIALAPOYOANTECEDENTES_22
427.pdf
 http://www3.uah.es/bioquimica/Sancho/farmacia/practicas/Lowry.pdf