5/20/2018 Pr ctica3Determinaci n deActividaddeSuccinato DeshidrogenasadeEscherichi...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Laboratorio de Bioquímica Microbiana

Integrantes:

Durán Vera Ana

Frías Navarro RosaFarid
César
Pérez Sánchez Adriana

Grupo: 5IM1 Equipo: 1 Sección: 1

Nombre de la práctica: “Determinación de actividad de Succinato

Deshidrogenasa de Escherichia coli” 

 ASPECTOS VALOR CALIFICACIÓN

Hipótesis y diseño 6%
experimental
Objetivos 1%
Registro de datos 3%
Manejo de datos 5%
Discusión de 6%
resultados
Conclusiones 3%
Bibliografía 1%

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Hipótesis

  “Si la bacteria Escherichia coli  se inocula en glucosa y en succinato y se le

adiciona una fuente de carbono igual a la del medio de cultivo, entonces la
bacteria presentará un mayor crecimiento que si se le pusieran sustratos

  contrarios”. 
“A mayor concentración de glucosa, ya sea en el medio de inoculación o
adicionada posteriormente, menor actividad enzimática presentará la Succinato
Deshidrogenasa”. 

Fundamento

La succinato deshidrogenasa cataliza la deshidrogenación esteroespecífica de

succinato a fumarato. Esta enzima es inhibida fuertemente por malonato, un análogo
estructural del succinato y un ejemplo clásico de un inhibidor
competitivo. La succinato deshidrogenasa contiene un grupo
protético FAD que se une en forma covalente a la enzima por
medio de un residuo His (en la mayoría de otras enzimas que
contienen FAD, el FAD se sostiene fuertemente pero no en
forma covalente). En general el FAD funciona para oxidar
bioquímicamente alcanos (como succinato) a alquenos (como
fumarato), mientras que NAD+ participa en la oxidación más
exergónica de alcoholes a aldehídos o cetonas. La
deshidrogenación de succinato produce FADH 2, que debe
reoxidarse antes que la succinato deshidrogenasa pueda emprender otro ciclo
catalítio. La reoxidación de FADH2 se produce cuando sus electrones se pasan a la
cadena transportadora de electrones mitocrondrial.

Método de Ells

Es un método espectrofotométrico aeróbico aplicado para la determinación de

Succinato Deshidrogenasa soluble. Basado en que el Metosulfato de fenazina se
acoplará a la cadena transportadora de electrones entre la reducción de nucleótidos
de piridina y 2,6-diclorofenol indofenol. La adición de metosulfato de fenazina a un
sistema que contiene succinato, DCFIF y SDH soluble, causa una rápida reducción del
CDFIF (incoloro). La taza de reducción es proporcional a la cantidad de enzima
añadida.

Objetivos
  Determinar la actividad enzimática de succinato deshidrogenasa en
Escherichia coli , a partir de diferentes cultivos con condiciones diferentes.
  Analizar y discutir cómo es que se comporta Escherichia coli  en cada uno de
los cultivos empleados. 

Registro y Manejo de datos 

1. Efecto de la fuente de Carbono:  

Para observar el efecto que ocasiona al inocular al medio de cultivo Succinato y

Glucosa, con fuentes de Carbono de Succinato y Glucosa, se elaboraron los medios y

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se midieron absorbancias a 600 nm al inicio y después de incubarlos 5h a 37ºC,

obteniendo los siguientes datos, que mediante una gráfica denotamos dicho efecto:

Tabla 1. Valores de absorbancias a 600nm del efecto del crecimiento de E s c h e r i c h i a c o l i . 

Cultivos y fuentes A a 600 nm

de carbono Inicial Final ΔA 
S/S 0.712 1.005 0.293
S/G 0.72 1.206 0.486
G/S 0.894 1.105 0.211
G/G 0.889 1.211 0.322

Figura 1. Efecto del crecimiento de  en

Escherichia coli  medios de cultivo con características
diferentes. 

0.5

0.45

0.4

0.35

0.3

   A0.25

     Δ
0.2

0.15

0.1

0.05

0
S/S S/G G/S G/G
Medio de cultivo con fuente de Carbono

2. Efecto de la fuente de carbono en la actividad de la SDH:

Pusimos en evidencia el efecto de la fuente de Carbono sobre la actividad de la

Succinato deshidrogenasa únicamente adicionando DCFIF, MSF, KCN, Regulador de
fosfatos, Succinato de Na y suspensión celular, se leyeron %T a 600 nm de las 4
celdas cada una con un inóculo de células y una fuente de carbono adicionada, y se
obtuvieron las siguientes lecturas:

Tabla 2. Valores de transmitancias de las diferentes fuentes de carbono en la actividad de la

enzima Succinato deshidrogenasa.

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%T a 600 nm de suspensiones celulares

Tiempo
crecidas en las fuentes de Carbono
(s)
S/S S/G G/S G/G
0 11.5 4.5 7.3 8.2
30 13.9 4.9 8.2 8.4
60 16.3 5.2 9.4 8.8
90 18.4 5.6 10.8 9
120 20.5 6 12.2 9.3
150 22.7 6.3 13.7 9.6
180 24.7 6.6 15.2 9.8
210 26.9 7 16.7 10
240 29.5 7.3 18.2 10.2
270 32.1 7.5 19.8 10.5
300 34.7 7.9 21.4 10.6

Para observar el efecto que generan las fuentes de carbono utilizadas, realizamos una
gráfica comparando las fuentes de carbono con respecto del tiempo, para ello es
necesario restarle el %T inicial de cada tubo ya que este no corresponde a nuestros
resultados:

%T 
  = %T t   %T 0'  
%T S /S    = 13.9   11.5 = 2.4  %T G/S    = 8.2   7.3 = 0.9 
%T S /G   = 4.9   4.5 = 0.4  %T G /G   = 8.4   8.2 = 0.2
 
De igual forma
siguiente tabla, ylocon
hacemos
ello se para cada una
construye uno gráfica
de los de
tiempos, teniendo
 Δ%T vs t: los valores de la

Tabla 3. Diferencias del %T de los medios de cultivo con diferentes fuente de carbono.

Tiempo Δ%T de suspensiones celulares crecidas

(s) en diferentes fuentes de Carbono
S/S S/G G/S G/G
0 0 0 0 0
30 2.4 0.4 0.9 0.2
60 4.8 0.7 2.1 0.6
90 6.9 1.1 3.5 0.8
120 9 1.5 4.9 1.1
150 11.2 1.8 6.4 1.4
180 13.2 2.1 7.9 1.6
210 15.4 2.5 9.4 1.8
240 18 2.8 10.9 2
270 20.6 3 12.5 2.3
300 23.2 3.4 14.1 2.4

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Figura 2. Efecto de la fuente de Carbono en la actividad enzimática.

25

20

15
     T
     %
     Δ
10

0
0 50 100 150 200 250 300 350
t (s)

S/S S/G G/S G/G

Discusión de resultados

La bacteria Escherichia coli es una enterobacteria que puede llevar a cabo tanto
respiración aerobia como fermentación, esto ayuda a que se adapte casi a cualquier
medio en el que se cultive, siendo estos los determinantes para que exista un mayor o
menor crecimiento de la misma. Esta bacteria lleva a cabo la glicólisis, proporcionando
de esta manera coenzimas que se reducirán en el Ciclo de Krebs quien a su vez
proporcionará los electrones a través del FADH2 para que lleve a cabo la cadena
transportadora de electrones y así poder vivir. Sin embargo en el experimento
realizamos pruebas con dos fuentes de carbono como medio de cultivo: glucosa y
succinato, combinando también la fuente de carbono que se le adicionaba una vez
cultivada. En las gráficas podemos observar que la bacteria no tiene un crecimiento
grande en el medio de Glucosa/Glucosa (dónde el primero indica el sustrato
adicionado y el segundo el medio de cultivo) pero sabemos que esto es falso, ya que
como ya se mencionó anteriormente, al llevar a cabo glicólisis, la fuente de carbono
principal es la glucosa. Después le seguirían el medio Succinato/Glucosa, a
continuación el Glucosa/Succinato y por último Succinato/Succinato. Aunque el
succinato también forma parte de una de las vías que esta bacteria lleva a cabo,
claramente no es la principal y es por ello que el crecimiento no es tan grande que
como si lo hiciera con glucosa. La otra variable que tenemos además del medio de
cultivo es precisamente el sustrato que le adicionamos después, nuevamente tendrá
un mayor crecimiento con glucosa que con succinato y esto es otro determinante, ya
que si se adiciona succinato en el medio de glucosa, el primero inhibirá el crecimiento
aunque no tanto por tener a la glucosa como otra fuente de donde puede obtener
carbono.

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Conclusiones

  Succinato Deshidrogenasa presenta mayor actividad enzimática en presencia

de Succinato que con Glucosa.

  La importancia de la Succinato Deshidrogenasa reside en que si se le agregara
algún inhibidor al complejo I, los electrones pueden llegar a la cadena
respiratoria mediante ella directamente en el complejo II.
  La enzima necesita un acarreador para poder llevar a cabo su actividad
catalítica en un medio con glucosa.
  Escherichia coli crece mejor en un medio donde exista 100% glucosa, sin
embargo, puede crecer en los diferentes medios que se utilizaron aunque en
menor proporción. 
 

Bibliografía

  Voet – Voet. “Fundamentos de Bioquímica: La vida a nivel molecular”. Editorial

Médica Panamericana, 2ª edición, Madrid España, 2009. Pág. 530

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