Herramientas

bsicas para la
sntesis de ADN recombinante

1
Enzimas bsicas en la tecnologa del ADN
recombinante:
Nucleasas
Ligasas
Enzimas modicadoras de extremos
Polimerasas

2
Nucleasas:
Las nucleasas son enzimas capaces de hidrolizar los enlaces fosfodiester que se dan
entre los nucleEdos de los cidos nucleicos.

3
Exonucleasas:

4
Endonucleasas:

Endonucleasas inespeccas:
RNAasa A
DNAasa I

Endonucleasas que cortan en siEos

especcos: endonucleasas de restriccin.

5
 Endonucleasas de Restriccin.

Enzimas nucleolEcas que catalizan la hidrlisis de

enlaces fosfodister internos en las dos hebras de
una molcula de dsDNA de forma especca.

En la naturaleza forman parte del sistema de
restriccin-modicacin bacteriano (abreviadamente
sistema R-M), que sirven a las bacterias para
reconocer y destruir material exgeno.

6
7
Papel Biolgico Sistema R-M

8
MeElacin Restriccin

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 Existen varios sistemas de R-M, los de Epo II, son los
ms comunes en el mundo bacteriano.
Tienen las acEvidades meElasa y endonuclesa
separadas.
Son los ms uElizados en biologa molecular:
o Gran especicidad.
o Estructuralmente sencillas, lo que facilita su
aislamiento, conservacin y manejo.

Existen ms de un millar caracterizadas.

Pueden conocer una secuencia especca.
Pueden reconocer varias secuencias.
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Nomenclatura ER:
Eco RI
E = gnero Escherichia.
Co = especie: coli
R = esErpe, cepa RV 13.
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa.

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Diana:
Longitud variable.
Cuanto ms pequea, ms probable es que apareza.
La probabilidad de que en una secuencia de ADN
generada al azar se encuentre una determina
secuencia de 6 pares de bases es de (1/4)6= 1/4096
8 pares de bases es de (1/4)8= 1/65536
(en realidad, las secuencias no son al azar, y dieren de estos
valores, pero siempre hay que tenerlos en cuenta).
Salvo excepciones se tratan de estructuras
palindrmicas (simetra rotacional).


12
Secuencia palindrmica

13
 Puntos de Rotura de la diana:

Los puntos de rotura son dos enlaces fosfoester localizados uno

P1: SBT
en cada CUUS128/Nicholl
09780521850063c04 hebra, que 978se
0 521 encuentran
85006 3 dispuestos simtricamente March 13, 2008 17

segn el mismo eje que marca la simetra de secuencia de las

54
hebras en la diana.
THE BASIS OF GENETIC ENGINEERING
Las enzimas pueden generar extremos:
Fig.3 4.2protuberantes
Types of ends generated
by(a)5
Thep rotuberantes
different restriction enzymes.
enzymes are listed, with
5-GGCC-3 5-CTGCAG-3 5-GAATTC-3
andRomos
their (b) recognition sequences
(c) cutting sites, respectively.
GGCC CTGCAG GAATTC
(d) A schematic representation of CCGG GACGTC CTTAAG
the types of ends generated is also
shown.

may be produced: (1) blunt ends (sometimes known as flush-ended 14

fragments), (2) fragments with protruding 3 ends, and (3) fragments
Nomenclatura diana:
Nomenclatura
simplicada

GGATCC

AGATCT

Romos
3 protuberantes

5 protuberantes

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 Diana: especicidad relajada
La especicad relajada implica que en alguna posicin de
la diana el enzima de restriccin puede aceptar ms de un
nucleEdo diferente:

AvaI CYCGRG
SecI CCNNGG
StyI CCWWGG

Algunas dianas con especicad relajada pueden reconocer a
secuencias que no sean perfectamente palindrmicas.

AvaI CTCGAG CTCGGG CCCGAG CCCGGG

N= A,T,C,G W= Ao T Y=T o C R= A o G
16

 Isosquizmeros

Enzimas que reconocen la misma secuencia diana.

Algunos ClaI y BanIII reconocen la misma diana y

cortan en siEos idnEcos.

ClaI y BanIII 5 ATCGAT 3

Algunos como SmaI y XmaI reconocen la misma diana

pero cortan en siEos diferentes
SmaI 5 CCCGGG 3
XmaI 5 CCCGGG 3

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 Extremos compaHbles
Los extremos romos son siempre compaEbles para volver a pegarse.
Algunas enzimas dejan extremos compaEbles que pueden volver a unirse una
vez se cortan.

XbaI NheI

Frecuentemente al ligar extremos compaEbles provenientes de enzimas

diferentes se pierden las dianas

TCTAGC
AGATCG
Tras ligar extremos XbaI, NheI se pierden ambas dianas

18

AcHvidad Estrella
En ciertas condiciones alejadas de las pEmas,
algunas endonucleasas de restriccin pueden cortar
un DNA por siEos algo disEntos a sus dianas
especcas, y pierde especicad.

EcoRI AcEvidad normal GATTTC

EcoRI AcEvidad estrella NAATTN

19

Protocolo digesHn enzimHca

20

 Comercializacin de enzimas

Diversas compaas venden mulEtud de enzimas de

restriccin, actualmente se ha alcanzado el millar de
enzimas (NEB, Promega, Fermentas, etc).

Aunque se aislaron de bacterias diferentes, para su

generacin se han clonado y producen en E. Coli, esto
ha conseguido disminuir el precio de las enzimas.

21

One unit is dened as the amount of enzyme
required to digest 1 g of DNA in 1 hour at
37C in a total reacEon volume of 50 l.

x1

El precio de las
enzimas es muy
variable

x40

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 Diferentes enzimas pueden combinarse
en bferes similares para realizar
digesEones dobles.

Algunas enzimas de restriccin pueden inacEvarse mediante calor, otras

se deben eliminar mediante puricacin.
Algunas enzimas son ms rpido que otras: BamHI es capaz de digerir 1ug
de ADN en 10 minutos.

23

 DigesHn Parcial
Si el ADN no corta el 100% de las molculas (no hay suciente
enzima, se incuba poco Eempo, o las condiciones son subpEmas)
se crea una digesEn parcial que complica la interpretacin de los
resultados.

Sin digerir Total Parcial

3000
2500
1 500 2500 3000 2000


500

24


25

 Aplicaciones ER

I) Creacin de ADN recombinante y clonacin

molecular de ADN (estudiado ms adelante).

II) Mapas de restriccin.

III) GenoEpado: determinacin de secuencia genmica

de polimorsmos.
PCR-RFLP
RFLP = restricEon fragment length polymorphism.

26

I) Creacin de ADN
recombinante
Aplicaciones y clonacin
de
enzimas de
molecular de ADN
restriccin:
formacin de
(Estudiado en detalle ms adelante)
molculas de
DNA
recombinantes

OJO: ADN recombinante, no debe confundirse

con recombinacin genEca.

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II) Mapas de restriccin.
* Para mapear o comparar secuencias de ADN en base al patrn de
bandas generado cuando la digesEn se resuelve en un gel de agarosa.
CCCGGG
GGGCCC

CCCGGG
GGGCCC
A B CCCGGG
GGGCCC

Marcador DigesEn A DigesEn B

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III) RFLP = restricHon fragment length polymorphism.

RFLP (del ingls RestricEon Fragment Length Polymorphism)

tcnica que se uEliza para diferenciar secuencias de ADN en
virtud de que tengan cortes diferenciales con enzimas de
restriccin.

Suele combinarse con PCR o Southerblot.

Ha perdido importancia debido a la secuenciacin, que es

mucho ms informaEva, pero lleg a ser de los primeros en el
genoEpado masivo de muestras.

29
Aplicaciones: Reparan igual las diferentes formas de protenas reparadoras del
ADN? Se asocian algunas de estas variaciones polimrcas con el cncer?

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Diseo
experimental Polimorsmo 243M/M para gen XRCC3
GTGTGTGAATAAGAAGGTCCCCGTACTGCTGTCTCGGGGCATGGCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCGGTGGCAGCCCCATTCCGCTGTGAATTTGAC
AGCCAGGCCTCCGCCCCCAGGGCCAGGCATCTGCAGTCCCTGGGGGCCATGCTGCGTGAGCTGAGCAGTGCCTTCCAGAGCCCTGTGCTGTG
CATCAACCAG GTGAGCACCA AGGCAGGGTT GCACCCCTGAGCTCGTATTT TTAGCCAGGA TGCG

PCR
GTGTGTGAATAAGAAGGTCCCCGTACTGCTGTCTCGGGGCATGGCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCGGTGGCAGCCCCATTCCGCTGTGAATTTGAC
AGCCAGGCCTCCGCCCCCAGGGCCAGGCATCTGCAGTCCCTGGGGGCCATGCTGCGTGAGCTGAGCAGTGCCTTCCAGAGCCCTGTGCTGTG
CATCAACCAG GTGAGCACCA AGGCAGGGTT GCACCCCTGAGCTCGTATTT TTAGCCAGGA TGCG

Hsp92 II

43pb GTGTGTGAATAAGAAGGTCCCCGTACTGCTGTCTCGGGGCATG

105pb GCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCGGTGGCAGCCCCATTCCGCTGTGAATTTGACAGCCAGGCCTCCGCCCCCAGGGCCAGGCATCTGCAGTCCCTGGGGGCCATG
CTGCGTGAGCTGAGCAGTGCCTTCCAGAGCCCTGTGCTGTG CATCAACCAG GTGAGCACCA AGGCAGGGTT GCACCCCTGAGCTCGTATTT TTAGCCAGGA TGCG
105pb

Gel Agarosa 2%

MM
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 Polimorsmo 243T/T para gen XRCC3

GTGTGTGAATAAGAAGGTCCCCGTACTGCTGTCTCGGGGCATGGCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCGGTGGCAGCCCCATTCCGCTGTGAATTTGAC
AGCCAGGCCTCCGCCCCCAGGGCCAGGCATCTGCAGTCCCTGGGGGCCACGCTGCGTGAGCTGAGCAGTGCCTTCCAGAGCCCTGTGCTGTG
CATCAACCAG GTGAGCACCA AGGCAGGGTT GCACCCCTGAGCTCGTATTT TTAGCCAGGA TGCG

Hsp92 II

45pb GTGTGTGAATAAGAAGGTCCCCGTACTGCTGTCTCGGGGCATG
210pb GCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCGGTGGCAGCCCCATTCCGCTGTGAATTTGACAGCCAGGCCTCCGCCCCCAGGGCCAGGCATCTGCAGTCCCTGGGGG
CCACGCTGCGTGAGCTGAGCAGTGCCTTCCAGAGCCCTGTGCTGTG CATCAACCAG GTGAGCACCA AGGCAGGGTT GCACCCCTGAGCTCGTATTT
TTAGCCAGGA TGCG

TT
GenoHpado de XRCC3 para la posicin 243 de la
cadena polipepXdica

210bp

105pb
+ 105pb

43bp

MM TT
TM MM TT
33
 BRCA1

NBS1

XRCC3

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 Ligasas
Enzima que se uEliza para ligar covalentemente fragmentos de ADN.
Catalizan la formacin de un enlace fosfodister entre el 5 fosfato de
una hebra de ADN y el 3 hidroxilo de otra hebra.
 ADN Ligasas
Humanas:
ADN Ligasa I: Liga los fragmentos de okazaki de la hebra de retrasada.
ADN Ligasa II: forma alternaEva de la ADN Ligasa III encontrada en clulas
que no se dividen.
ADN Ligasa III: parEcipa en los procesos de reparacin por excision de
nucleEdos
ADN Ligasa IV: parEcipa en los procesos de reparacin de doble de ADN
cadena por unin de extremos sin homologa.

UHlizadas en Biologa Molecular:

ADN Ligasa del fago T4.
ADN Ligasa del fago T7.
ADN Ligasa del E.coli.
 Estas enzimas requieren
incorporar AMP, que lo toman
de diferentes cofactores.

Las de Fagos y humanas uElizan como cofactor ATP y Mg++.

Las de E. coli y la mayora de las bacterianasuElizan como cofactor NAD
(nicoEnamide adenine dinucleoEde)
 La ligasa T4 es la ms
polivalente ya que es capaz
de unir extremos romos (ni
la T7 ni l de E. Coli pueden
hacerlo.)

Los extremos romos se ligan mucho menos ecientemente, requieren ms

enzima y sustrato y se suele aadir polieElien glicol (PEG) que secuestra
molecular de agua concentrando los sustratos.