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Explicacin
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto gram positivas
como gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2
(yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para
solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble
en solucin acuosa con el cristal violeta..
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma
es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram positivos no se decoloran, mientras
que los gram negativos s lo hacen.
Para poner de manifiesto las clulas gram negativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la
coloracin de contraste las clulas gram negativas son rojas, mientras que las gram positivas
permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de
contraste que pone de manifiesto las bacterias gram negativas. Al trmino del protocolo, las gram
positivas se vern azul-violceas y las gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de
contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).
La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la Tincin de Gram
(1884). La propiedad de teirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram negativas) por esta
coloracin es un criterio de clasificacin importante correlacionable con otras propiedades
bacterianas. Unos pocos organismos son Gram-variables.
Tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas captan la misma cantidad de cristal violeta (CV)
e iodo (I). El complejo CV-I sin embargo es atrapado dentro de la clula Gram positiva por la
deshidratacin y la reduccin del tamao de los poros de la pared resultante del proceso de lavado
con solvente. En contraste en las Gram negativas la fina (y probablemente discontinua) capa de
peptidoglicano no impide la extraccin por el solvente del complejo.
Avala lo antedicho el hecho que, si despus de su tincin se tratan con lisozima bacterias Gram
positivas, se ve que los protoplastos siguen teidos, pero pierden el colorante si se los trata con
alcohol. Esto indica que el colorante es fijado a nivel del protoplasto, y que la pared celular de las
bacterias Gram positivas es la que impide la extraccin del colorante. Corroborando esta
suposicin se observa que cuando Bacillus subtilis emerge de su espora su pared celular esta
"inmadura" y se comporta como Gram negativa. Cuando la pared celular adquiere su estructura
final pasa a ser Gram positiva.