UNIVERSIDAD DE TARAPACA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRONOMICAS

INFORME n1:
CUANTIFICACION DE
PIGMENTOS
FOTOSINTETICOS

Integrantes: Vctor Bravo

Juan Daniel Franco
Asignatura: Relacin suelo agua
planta
Fecha:

10 Noviembre 2016
Arica - Chile

INDICE

1.- Introduccin..........................................................................................................2
2.- Revisin bibliogrfica............................................................................................3
2.1- La clorofila.......................................................................................................4
2.2- Funciones de la clorofila.................................................................................4
2.3.- Tipos de clorofila............................................................................................4
2.4.- Los pigmentos accesorios.............................................................................5
2.5.- Importancia de su estudio..............................................................................5
2.6.- Como estudiarlos...........................................................................................5
3.- Materiales y metodologa.....................................................................................6
3.1.- Materiales.......................................................................................................6
3.2.- Metodologa...................................................................................................6
3.2.1 Mtodo del DMSO (Dimetilsulfxido)........................................................6
3.2.2 Metodo no destructivo: Medicin del contenido de clorofila mediante el
uso del Minolta SPAD 502..................................................................................8
4.- Resultados y discusiones.....................................................................................9
4.1.- Resultados.....................................................................................................9
4.1.1 Calculo de clorofila en hojas de palto con mtodo destructivo.................9
4.1.2.- Calculo de clorofila en hojas de palto con el mtodo no destructivo....11
4.2.- Discusiones..................................................................................................11
5.- Conclusiones......................................................................................................12
6.- Bibliografa citada...............................................................................................12

1.- Introduccin

Entre todas las caractersticas externas de los vegetales, el ms notable y

caracterstico es probablemente el color.
El color verde de las plantas se debe a la capacidad de pigmento llamado
cloroflicos que tienen la capacidad de absorber las fracciones roja y azul de la luz
solar (Manrique, 2003)
En este informe se presentaran los resultados obtenidos de la medicin de
pigmentos fotosintticos en hojas de palto ubicados en luz y sombra a travs de
dos procedimientos, uno destructivo y otro no destructivo.
Se estableci como hiptesis de trabajo, que las mediciones obtenidas de la
extraccin de los pigmentos por ambos procedimientos deben presentar poca
diferencia en sus concentraciones
Los objetivos del trabajo fueron:
-

Extraer y separar los pigmentos fotosintticos por medio de

espectrofotometra y extraccin simple.
Cuantificar el contenido de clorofila en hojas a pleno sol y a la sombra
Relacionar los temas observados en ctedra con fisiologa vegetal y
metodologas bioqumicas para entender el funcionamiento de las plantas.
Comprender la importancia de la clorofila en las plantas, su correcta
medicin y factores de su deficiencia.

2.- Revisin bibliogrfica

2.1- La clorofila
La clorofila es un pigmento que se encuentra mayormente en las plantas al
interior de las clulas vegetales, especficamente en un orgnulo llamado
cloroplasto, que le proporciona su color verde. Las hojas pueden llegar a tener
hasta 1 g de clorofila m -2, (Manrique, 2003), concentracin que es muy variable
entre especies, dependiendo de factores como estado nutricional, edad, cantidad
de luz, etc.

2.2- Funciones de la clorofila

Los pigmentos por lo tanto son sustancias qumicas que absorben luz, y su
color es resultado de la longitud de onda reflejada (no absorbida). (Agapito, 2013).
Para la fotosntesis la planta utiliza la luz ubicada en el rango entre 400 a 700 nm
correspondiente al espectro visible.
Se han postulado dos conceptos fundamentales para las reacciones
fotoqumicas; el primero se refiere al concepto de unidad fotosinttica (Emerson &
Arnnon, 1932) y el segundo el concepto de dos fotosistemas (Hill & Bendal, 1960).
De acuerdo al primer concepto en todos los sistemas fotosintetizadores los
pigmentos que absorben luz se dividen en dos grupos, los que absorben y
transfieren la energa hacia el centro de reaccin y los que conforman este centro
que constituyen un tipo particular de molculas de clorofila y que llevan a cabo la
reaccin fotoqumica. (Zeinalov, 2005). De acuerdo al segundo concepto la luz
induce una transferencia de electrones que requiere la cooperacin de dos tipos
de fotosistemas llamados I y II, donde el agua es usada como donador de
electrones funcionando como una maquinaria fotoelctrica.

2.3.- Tipos de clorofila

Existen diversos tipos de clorofilas, se diferencian en pequeos detalles de
su estructura molecular y que absorben en longitudes de onda distintas. La
clorofila A constituye aproximadamente el 75% de toda la clorofila de las plantas
verdes, mientras que la clorofila B absorbe la luz de una longitud de onda diferente
y transfiere la energa a la clorofila A que se encarga de transformarla en energa
qumica. (Mancilla, Castrejn, Rosas, Blanco, & Perez). Pueden formarse en las
races, tallos, hojas y frutos a condicin de que estos rganos estn situados por
encima del suelo y queden expuestos a la luz.
Argentel et al en 2009 determino que el contenido de clorofila a disminuyo
en la medida que se incrementaron las concentraciones salinas desde el control
hasta 12 dS m-1. Mielke et al, en 2010 encontraron que los ambientes de luz
afectan significativamente el contenido de clorofila a, clorofila b y clorofila total en
Eugenia uniflora. Adems, la luz por su naturaleza energtica, representa adems
un factor de riesgo aadido en las plantas, ya que mientras unos pigmentos son
4

responsables de la absorcin energtica (clorofilas) tambin han desarrollado

otros mecanismos en los que se ven involucrados pigmentos accesorios para
disipar en forma no daina el exceso de energa absorbida. (Manrique, 2003).

2.4.- Los pigmentos accesorios

Existen otros pigmentos accesorios en las plantas superiores, como los
carotenoides (carotenos y xantofilas) de coloracin roja y amarilla, que sirven
como antenas que colectan luz y transfieren la energa a los centros de reaccin,
adems de cumplir otras funciones de proteccin. (Mancilla et al). El carotenoide
mas comnmente encontrado es el - caroteno. Los carotenoides junto con los
flavonoides y las clorofilas son los pigmentos vegetales mas distribuidos. Los
flavonoides confieren tambin coloraciones similares, inclusive color azul a
muchas flores y frutos. (Agapito, 2013).
La energa lumnica absorbida por los pigmentos fotosintticos puede ser
utilizada en las reacciones fotoqumicas, ser re emitida por la clorofila o ser
disipada trmicamente sirviendo como proteccin frente a la luz excesiva.
(Manrique, 2003).

2.5.- Importancia de su estudio

El color no es nicamente un carcter llamativo de la vegetacin, sino que
adems, algunos pigmentos estn estrechamente ligados a las actividades
fisiolgicas del propio vegetal y aportan informacin sobre productividad y eventos
de estrs entre otros (Melgarejo, 2010). Por lo tanto, el conocimiento de cmo las
plantas viven y se desarrollan requiere el previo conocimiento de los pigmentos
vegetales. Adems la extraccin y reconocimiento de estos pigmentos es
interesante para el estudio y conocimiento de sus propiedades.

2.6.- Como estudiarlos

Las herramientas ms comunes usadas para determinar en campo la tasa
de fotosntesis, el estado de los procesos fotoqumicos y el contenido de
pigmentos, son el IRGA (anlisis de gases en infrarrojo), el fluorometro y el
medidor de clorofila in situ (SPAD), respectivamente. Sin embargo el SPAD provee
solo un ndice simple del contenido de pigmentos de la hoja y la determinacin de
la composicin de pigmentos requiere valores de calibracin con mediciones
reales de pigmentos usando mtodos destructivos. (Melgarejo, 2010).

3.- Materiales y metodologa

3.1.- Materiales
-

Placa Petri
Sacabocado
Dimetilsulfxido
Micro pipeta
Guantes desechables
Espectrofotmetro
Papel aluminio
Tubo de ensayo
Cubetas para medir clorofila
Balanza analtica
Toalla Nova
Estufa
Medidor contenido clorofila marca Minolta SPAD 502
Cuaderno y lpiz para tomar apuntes
Plumn para marcar los tubos de ensayos
Hojas de palto en luz y sombra

3.2.- Metodologa
Para tomar las muestras de hojas de palto que se desean analizar su
contenido de clorofila, se proceder a emplear dos procedimientos distintos, el
primero de estos mtodos es el llamo mtodo del DMSO (Dimetilsulfxido), el cual
se destaca por ser un mtodo destructivo, por el contrario el segundo mtodo mide
el contenido de clorofila directamente de las hojas sin alterarlas.

3.2.1 Mtodo del DMSO (Dimetilsulfxido)

La extraccin de las clorofilas se realizara utilizando la tcnica de Hiscox y
Isralestam (1979), la cual se basa en la extraccin de los pigmentos desde un
tejido vegetal con solvente orgnico. En este caso se utilizar el dimetilsulfxido. A
continuacin se destacan los pasos a seguir para la tomas de muestras.

Escoger dos hojas de un mismo rbol ( una a plano sol y otra en la

sombra), con la ayuda del sacabocado cortar dos discos 0,5-0,8 cm de
dimetro
6

Introducir los discos recolectados de material vegetal en dos placas Petris

previamente marcadas con plumos, destacando el tejido vegetal
proveniente del sol y de la sombra.

Introducir el
material vegetal ( discos) en dos tubos de ensayos
previamente rotulados, posteriormente echar 1 ml de DMSO y dejar por las
siguientes dos horas en estufa a una temperatura de 80C

se introduce en un tubo de ensayo con 1 ml de DMSO, y debe permanecer

2 horas a 80C.

Transcurrido este tiempo el DMSO ha extrado por completo los pigmentos

del tejido y se vierte el sobrenadante, desechndose el precipitado, en la
cubeta de medida del espectrofotmetro

.Posteriormente se mide la absorbancia a 750, 665, 649 y 480 nm,

emplendose como blanco el DMSO

.Para medir la turbidez del extracto se mira la absorbancia a 750 nm, ya

que las clorofilas no absorben en esa longitud de onda.

Se miden las absorbancias a 665 y 649 nm, mximos de absorcin para la

clorofila a y la clorofila b respectivamente, en el caso de utilizar como
disolvente el DMSO. Igualmente el contenido de carotenos y xantofilas
(carotenoides) se cuantifica a 480 nm.
Para realizar el clculo del contenido de clorofila presente en la muestra de
tejido vegetal, se tiene que emplear las siguientes formulas y teniendo en
cuenta que el disolvente empleado es el DMSO.

Chla (g / ml) = 12,47 x A665 3,62 x A649

Chlb (g / ml) = 25,06 x A649 6,50 x A665
Cx+c (Carotenoides) (g / ml) = 1000 x A480 1,29 Chla 53,78 CHlb
220
2
x + c = xantofilas + carotenos

Es de gran importancia destacar el empleo que se tiene que hacer del factor
de correccin cuando por ejemplo las absorbancias a 750 nm son mayores a

0,005 unidades, en este caso se tiene que restar el valor a las lecturas obtenidas
a 480,649,665 nm.

C= F (absorbancia 750 nm0,002) donde F=1 para 649 nm y 665 nm y F=2 para
480

3.2.2 Mtodo no destructivo: Medicin del contenido de clorofila mediante el

uso del Minolta SPAD 502
El SPAD-502 determina la cantidad relativa de clorofila presente, esto se
hace mediante la medicin de la absorcin de la hoja en dos regiones de longitud
de onda; en las regiones rojas y cercanas a infrarroja. Utilizando estas dos
transmisiones el medidor calcula el valor numrico SPAD que es proporcional a la
cantidad de clorofila presente en la hoja y en consecuencia de Nitrgeno (N).

A continuacin se destaca la frmula para el clculo de clorofila mediante el

SPAD-502
Clorofila= 1,70-(0,065*spad)+ (0,005 (spad)2)

4.- Resultados y discusiones

4.1.- Resultados
4.1.1 Calculo de clorofila en hojas de palto con mtodo destructivo
750
665
649
480
SOMBRA
0,048
0,429
0,207
0,369
SOL

0,055

0,600

0,266

0,601

4.1.1.1- Hoja de palto en sombra

Correccin: ya que los valores en 750 fueron mayores a 0,005 se emplearan las
formulas de correccin
C480 = 2 (0,048 0,002)
480 = 0,369 0,092
480 = 0,277
C649 = (0,048 0,002)
649 = 0,207 0,046
649 = 0,161
C665 = (0,048 0,002)
665 = 0,429 0,046
665 = 0,383
Quedando
SOMBRA

665
0,383

649
0,161

480
0,277

Reemplazando en las formulas de clorofila

Chla = (12,47 * 0,383) (3,62 * 0,161)
Chla= 4,193 (g/ml)
Chlb = (25,06 * 0,161) (6,50 * 0,383)
Chlb = 1,545(g/ml)
9

Carotenoides: [(1000 * 0,277) (1,29 * 4,193) (53,78 * 1,545)]/220

Carotenoides: 0,857 (g/ml)
4.1.1.2 - Hoja de palto en sol
Correccin: ya que los valores en 750 fueron mayores a 0,005 se emplearan las
formulas de correccin
C480 = 2(0,055 0,002)
480 = 0,601 0,106
480 = 0,495
C649 = (0,055 0,002)
649 = 0,266 0,053
649 = 0,213
C665 = 0,6 0,053
665 = 0,547
SOL

665
0,547

649
0,213

480
0,495

Reemplazando en las formulas de clorofila

Chla = (12,47 * 0,547) (3,62 * 0,213)
Chla = 6,05(g/ml)
Chlb = (25,06 * 0,213) (6,50 * 0,547)
Chlb = 1,782 (g/ml)
Carotenoides: [(1000 * 0,495) (1,29 * 6,05) (53,78 * 1,782)]/220
Carotenoides: 1,779 (g/ml)

4.1.2.- Calculo de clorofila en hojas de palto con el mtodo no destructivo

SOMBRA
25,4
SOL
32,9

10

4.1.2.1.- Hoja de palto en sombra

Reemplazando en las formulas de clorofila para SPAD
Clorofila = 1,70 (0,065 * 25,4) + (0,005 * 25,4 2)
Clorofila = 3,275
4.1.2.2.- Hoja de palto en sol
Reemplazando en las formulas de clorofila para SPAD
Clorofila = 1,70 (0,065 * 32,9) + (0,005 * 32,9 2)
Clorofila = 4,97
4.1.2- Grficos de comparacin

Comparacion de contenido de clorofila en hojas de palto en sol y sombra

9
8
7

Contenido de clorofila en g/ml

Clorofila b

Clorofila a

4
3
2
1
0
Sombra

Sol

Grafico 1: Comparacin de contenido de clorofila en hojas de palto en sol y sombra

4.2.- Discusiones

11

En el prctico realizado en el actual laboratorio y comparndolo con los

otros realizados obtenidos por otros grupos de trabajo que realizaron el mismo
practico, se deja de manifest que no en todas las hojas, de la misma especie,
tanto en sombra como expuesta al sombra, presentan el mismo contenido tanto de
clorofila A como de clorofila B. Es preciso sealar que la situacin anterior pudiese
deberse a que la planta est presentando alguna deficiencia a nivel fisiolgico, que
se manifiesta en un estrs.

5.- Conclusiones

En el prctico realizado en el presente laboratorio, se dej de manifiesto

que la clorofila es elemento muy importante en la planta, puesto que es una
molcula considerada una foto receptora. Destacar tambin que sin la clorofila las
plantas no podra producir su alimento.
En el marco de las mediciones tanto de clorofila A y de clorofila B
realizadas, se puede mencionar que el mayor contenido es de clorofila b en la hoja
que se encuentra expuesta al sol, otro resultado a destacar es que la clorofila b en
la hoja que se encontraba en sombra, presenta un contenido de clorofila
levemente menor en comparacin al contenido de clorofila A qu se encontr en la
hoja expuesta al sol. Y por ltimo y no menos importante mencionar que el menor
contenido de clorofila que se encontr, fue de clorofila A en la hoja que se
encontraba expuesta al sol.

Destacar que la revisin bibliogrfica fue un pilar fundamental para la

realizacin del presente informe, puesto que aporto informacin muy relevante que
aporto para su exitosa elaboracin.

12

6.- Bibliografa citada

Agapito, O. F. (2013). Reacciones cualitativas sobre pigmentos de las plantas.

Lima, Peru: Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Argentel et al, (2009) Contenido de clorofila e iones en la variedad de trigo
harinero CUBA-C-204 En condiciones de estrs salino, Revista cultivos tropicales,
vol 30 n4

Emerson, R., & Arnnon, W. (1932). A separation of the reactions in photosynthesis

by means of intermittent light. Journal of General Physiology.
Hill, R., & Bendal, F. (1960). Function of the two cytochrome components in
chloroplast: a working hypothesis. Nature.
Mancilla, C., Castrejn, C. R., Rosas, T., Blanco, E., & Perez, S. (s.f.).
EXTRACCIN Y SEPARACIN DE PIGMENTOS VEGETALES. Mexico,
DF: Universidad del Valle de Mexico.
Manrique, E. R. (2003). Los pigmentos fotosinteticos, algo mas que la captacion
de luz para la fotosintesis. Ecosistemas.
Melgarejo, L. M. (2010). Experimentos en fisiologia vegetal. Colombia: Universidad
Nacional de Colombia.
Mielke M S, Schaffer B, Li C (2010) Use of a SPAD meter to estimate chlorophyll

content in Eugenia uniflora L. leaves as affecteed by contrasting light enviroments

and soil flooding. Photosynthetica 48.
Zeinalov, Y. (2005). Mechanisms of photosynthetic oxygen evolution and
fundamental hypotheses of photosynthesis. New York: Handbook of
photosynthesis.

13