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Antonio Ceron Gamez 5Qm2

Factores Sigma en Escherichia coli. y Staphylococcus aureus.

1.- Escherichia coli contiene un factor σ 54 y seis factores σ de la familia de σ 70, σ 70 (RpoD),
σs (RpoS), σ 32 (RpoH), σ F (FliA), σ E (RpoE), y FceI (Gruber y Gross, 2003). Cada uno de
ellos dirige la transcripción de grupos de genes específicos. En E. coli σs transcribe más de 100
genes implicados en supervivencia celular, protección contra diversas situaciones de estrés
(estrés oxidativo, radiación UV, choque térmico, hiperosmolaridad, pH ácido) y expresión de la
virulencia (Ishihama, 2000). Los niveles celulares de σs están cuidadosamente controlados,
aumentando significativamente en la entrada en la fase estacionaria de crecimiento, momento
en el que alcanza el 30% del nivel del factor “housekeeping” σ 70, aumentando así su habilidad
de competir por el núcleo enzimático con otros factores σ disponibles en la célula (Jishage et
al., 1996). Los estudios sobre los niveles de σs han revelado uno de los sistemas más complejos
de regulación en bacterias, ya que tiene lugar a nivel de transcripción, de traducción y de
estabilidad proteica, todo coordinado con la respuesta a diversas situaciones de estrés celular.
Aunque Eσ 70 y Eσs reconocen básicamente las mismas secuencias promotoras, determinadas
por las denominadas cajas -10 y -35, algunas características determinan la selectividad de Eσs
. A nivel de secuencia son: utilización total o parcial de una secuencia UP situada aguas arriba
de la caja -35 (las secuencias UP son un tercer elemento de reconocimiento en determinadas
regiones promotoras localizado aguas arriba de la caja -35 y que interacciona con el dominio C-
terminal de la subunidad α de la RNAP); una citosina en la posición -13 de la caja -10; una zona
rica en A-T aguas abajo de la caja -10; una caja -35 degenerada; y, finalmente, un cambio en la
distancia entre las cajas -10 y -35. Finalmente, la acción sobre una región promotora de
determinados factores, como H-NS, Introducción 6 Lrp o IHF o la topología del ADN en esta
misma región, juegan en ocasiones un papel decisivo en la especificidad de Eσs (Hengge-
Aronis, 2002). Como se ha mencionado anteriormente en E. coli, la mayoría de los genes
expresados durante la fase exponencial de crecimiento se transcriben por Eσ 70, mientras que
Eσs es esencial en la transcripción de varios genes específicos de fase estacionaria. Algunos
genes de respuesta al estrés se transcriben con el holoenzima formado por otras subunidades
σ minoritarias. Eσ 54 transcribe genes activados por una deficiencia de nitrógeno y otros genes
de respuesta al estrés. Eσ 32 transcribe genes que codifican para proteínas del choque térmico,
y se induce por un número excesivo de proteínas citoplasmáticas que no se pliegan
correctamente, resultado de un choque térmico y otros estreses. Eσ F activa los genes tardíos
implicados en el ensamblaje del flagelo. Eσ E se induce por proteínas desplegadas de la
envoltura celular y dirige la expresión de los genes para restaurar la integridad de las envueltas.
Y, para finalizar, FceI, responsable de la transcripción de la maquinaria necesaria para el
transporte por translocación de citrato férrico ante una situación de limitación de hierro y
presencia de citrato férrico en el ambiente. FceI forma parte de la subfamilia de factores sigma
extracitoplasmáticos (EFC) o sigmas del grupo 4, pertenecientes a la familia de σ 70 pero
caracterizadas por tener una secuencia bastante divergente de otros grupos de la familia σ 70.
Originalmente se les denominó factores sigma extracitoplasmáticos porque muchos miembros
de este grupo identificados inicialmente regulaban aspectos relacionados con la superficie
celular o el transporte, y se cotranscribían muy a menudo con un factor anti-sigma
transmembrana. Sin embargo, se está demostrando que proteínas de función más amplia
pertenecen a este subgrupo. Muchas bacterias, sobre todo las de genomas más complejos,
contienen múltiples factores σ EFC que a menudo superan el número de otros tipos de factores
sigma. Varios ejemplos son Bacillus subtilis (7 factores sigma EFC), Mycobacterium tuberculosis
(10), Caulobacter crescentus (13), Pseudomonas aeruginosa (aproximadamente 19), y
Streptomyces coelicolor (aproximadamente 50) (Helmann, 2002).

2.- En E.coli, el factor sigma 70 (σ 70) es la subunidad más abundante que reconoce al promotor.
Adicionalmente, existen seis factores sigma alternativos de acuerdo a las condiciones sobre las
cuales se ha observado su actividad. Muchos de los genes expresados durante la fase de
crecimiento son transcritos por la acción del factor σ 70, mientras que el factor σ s es esencial
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en la transcripción de algunos genes durante la fase llamada estacionaria y en algunas


condiciones de estrés El factor σ 54 se utiliza para la expresión de genes cuando la bacteria se
enfrenta a una deficiencia de nitrógeno y otras condiciones de estrés. El factor σ 28 se requiere
para la expresión de los elementos flagelares y de los genes involucrados en los procesos de
quimio taxis. Mientras que el factor σ 32 transcribe a los genes necesarios para la respuesta
adaptativa a estrés por calor; el factor σ 24 modula la expresión de los genes involucrados en
la producción de proteínas

S. aureus
Sigma (σ) factors in Staphylococcus aureus There are only four sigma factors have been
identified in S. aureus to date. σA the housekeeping σ factor, which directs the transcription of
the bulk cellular RNA and three alternative σ factors σB , σH and the newly defined σS. The S.
aureus σB protein is closely related to the σB protein of B. subtilis and is mainly involved in stress
response. The S. aureus σH protein is a homolog of B. subtilis σH involved in the regulation of
sporulation-related genes.10 S. aureus relies on only four σ factors to direct the execution of its
gene expression. In addition to a primary σ factor, σA, S. aureus, as with the majority of
organisms possesses a σB alternative σ factor, which controls the general stress response. A
third factor, σH, has recently been reported, demonstrating homology to σH from B. subtilis, and
has been shown to regulate competence genes and the integration and excision of prophage.
Recently it was demonstrated that the existence of a fourth σ factor, σS, belonging to the ECF
family.

Somastotatina

La primera proteína producida utilizando células bacterianas fue la somatostatina. Para ello se
desarrollaron técnicas decisivas para la posterior producción de insulina.

La somatostatina consta solamente de 14 aminoácidos y es una de las muchas hormonas que


se producen en el hipotálamo, una región del cerebro medio. Desde allí llega hasta la glándula
pituitaria con el flujo sanguíneo, donde se ocupa de parar la liberación de insulina y del
“apagado” de la hormona del crecimiento humana.

La somatostatina podría, por lo tanto, tener valor terapéutico. Por este motivo, en 1977 Hebert
Boyer y sus colaboradores escogieron esta sustancia para sus investigaciones en el City of
Hope National Medical Center y la Universidad de California en San Francisco. Hasta entonces
no se había conseguido aislar el gen de la somatostatina de células humanas, pues su
secuencia de bases se obtuvo del conocimiento del código genético a partir de la secuencia
conocida de los 14 aminoácidos en el péptido.

Así se construyó en bloques, de tres bases cada uno, un gen artificial. Consta de 52 pares de
bases, de las cuales 14 x 3 = 42 contenían el plan de construcción codificado para la
somatostatina. Los diez pares de bases restantes debían garantizar la expresión del gen
(comprensión de las instrucciones de construcción) mediante el ribosoma, facilitar el aislamiento
de la hormona y finalmente liberar “extremos pegajosos”, que serían importantes para incorporar
fragmentos de ADN de doble hebra en un plásmido (el vector). Como huésped se
eligió Escherichia coli. Para llevar a cabo la transferencia se combinó el gen sintético con un
plásmido que llevaba la descripción pBR322, así como un fragmento del operón lac.

Para una expresión efectiva de un gen clonado se requiere una señal clara que sea entendida
por la célula huésped. Estos promotores vienen frecuentemente de un gen, que puede alcanzar
un grado de expresión elevado en el huésped. Lo más sencillo es acoplar el ADN clonado al
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ADN de un gen propio de una célula y aprovechar al mismo tiempo sus promotores buenos
funcionales. el gen de la somatostatina se incorporó en el extremo propio del gen bacteriano,
en el cual se codifica la enzima β-galactosidasa. La β-galactosidasa es una enzima que se
encuentra en grandes cantidades y degrada lactosa. Es una enzima inducible.

Tras la transferencia con éxito del plásmido en una célula de E. coli se produce, por lo tanto,
una somatostatina en forma de proteína de fusión somatostatina-β-galactosidasa. En realidad
es sólo un “péptido cola” de 14 aminoácidos, más corto, colgado a la enzima galactosidasa.

Mediante tratamiento con el producto químico bromocianuro (CNBr), la proteína se rompe sólo
en el lugar donde se encuentra el aminoácido metionina, dejando la somatostatina finalmente
separada de la β-galactosidasa.

Debido a que el gen se había producido sintéticamente, era una menudencia incorporar la
metionina requerida al inicio de la molécula de somatostatina. Para ello simplemente se instaló
el codón ATG para la metionina. Este proceso previo no se pudo evitar. Si no, la somatostatina,
si se intenta producir por sí misma, se degrada muy rápido mediante enzimas (proteasas)
bacterianas fragmentadoras de proteínas. Esto es evidente gracias a que la “buena confidente”
galactosidasa está “escondida” y no se muestran apéndices de la somatostatina, que en otro
caso se fragmentarían. Científicamente se dice: mediante su expresión como “proteína de fusión
con acción propia de las bacterias”, la somatostatina exógena de las bacterias se protege de la
degradación por las proteasas bacterianas.

El resultado fue que la somatostatina sintetizada en E. coli era completamente idéntica a la


natural humana. Cada célula forma alrededor de 10000 moléculas de somatostatina. Esto era
una hazaña extraordinaria, que animó a obtener otros péptidos.

Después de todo, el descubridor de la somatostatina animal, Roger Guillemin(nacido en 1924,


premio Nobel en 1977 con Andrew V. Schally y Rosalyn Yalow), tuvo que trabajar con 500000
hipotalamos de cerebro de oveja para obtener aproximadamente cinco miligramos de la
sustancia purificada de la hormona somatostatina animal.

Solamente ocho litros de la suspensión de las bacterias E. coli recombinantes aportaban ahora
la misma cantidad de somatostatina humana.
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Obtención de somatostatina por ingeniería genética.

En el esquema se muestran los procedimientos para sintetizar y clonar un gene híbrido que
permitió la producción de la hormona humana somatostatina en la bacteria Escherichia coli.
Este fue el primer experimento en que se demostró que es posible producir proteínas humanas
en bacterias. En este caso, el gene sintético que codifica para la hormona, el cual estuvo
construido a partir de ocho fragmentos de ADN sintéticos, fue unido al extremo del gene que
codifica para la enzima b-galactosidasa de la bacteria E. coli y ambos fueron clonados en el
plásmido pBR322. Después de transformar a la bacteria con el ADN recombinante, el plásmido
híbrido permitió la síntesis de una proteína híbrida b-galactosidasa-somatostatina (con el
segmento de somatostatina en el extremo carboxilo de la proteína), que al ser purificada y
tratada con bromuro de cianógeno, permitió liberar a la hormona somatostatina, a la cual se le
comprobó su actividad biológica.

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