Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
TecnicBasicas Colif Tot Fecales Ecoli NMP - 6529 PDF
TecnicBasicas Colif Tot Fecales Ecoli NMP - 6529 PDF
Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
GENERALIDADES
Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral
utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcione como indicador de contaminacin fecal. Estos
deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener
una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y debe de ser capaces
de desarrollarse extraintestinalmente.
El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin
embargo, las caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse
fuera del intestino tambin se observan en aguas potables, por lo que el grupo
coliforme se utiliza como indicador de contaminacin fecal en agua; conforme
mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar
frente a una contaminacin reciente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado
distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un
tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), se utilizan como
indicadores de malas prcticas sanitarias.
Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogneo con hbitat
primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra.
El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la
lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este
Versin para Administrador de Manuales y Documentos
(AMyD). Facultad de Qumica, UNAM
1
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Enterohemolisina -
Aspecto de las
heces
Presencia de
leucocitos en
heces
Fiebre
Aguadas
Aguadas
Aguadas muy Mucoides y
sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas
baja
Intiminas
Intestino
involucrado
Dosis infectiva
Serotipos
Colon y parte
baja del
delgado
Alta
Delgado
Delgado
Colon
Alta
Alta
O26, O111 y
otros
baja
O157:H7, O26,
Varios
O111 y otros
varios
FUNDAMENTO
La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del
Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a
35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales
biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de
sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se
Versin para Administrador de Manuales y Documentos
(AMyD). Facultad de Qumica, UNAM
4
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
MATERIAL Y EQUIPO
Mechero, a,b,c,d,e.
Propipetaa.
Gradillaa,b,c,e.
Balanza granatariaa.
Stomachera
Bolsas para stomacher .
Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c
Lentes de seguridadc
Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodna.
Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de algodna.
Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d
Asa bacteriolgicab,c,d,e
Portaobjetosd
Microscopio pticod
Termmetro calibradob
Bao de agua a 44.5 0,1C.b
Incubadora a 35 2,0Ca.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180Ca
Autoclavea
Versin para Administrador de Manuales y Documentos
(AMyD). Facultad de Qumica, UNAM
6
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la prctica.
b
Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica.
c
Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica.
d
Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica.
e
Material necesario a las 144 h. de iniciada la prctica.
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed.
Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
24 - 48 h
2 a 3 asadas/tubo
2 a 3 asadas/tubo
44.5C
37C
24 48 h
24 48 h
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed.
Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Homogenizar la muestra
con 90.0 mL de solucin diluyente
1.0 mL
1.0 mL
Sembrar por triplicado
cada dilucin en tubos
de caldo lauril sulfato de
sodio (1X)
10-1
10-2
10-3
35C
24 - 48 h
10-1
10-2
10-3
10-1
10-2
35C
44.5C
24 - 48 h
10-1
10-2
10-3
24 - 48 h
10-1
10-2
10-1
10-2
10-1
10-2
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
PROCEDIMIENTO
1. Agua y hielo
1.1 Prueba presuntiva
INOCULO
(mL)
CANTIDAD DE
MEDIO POR
TUBO (mL)
CONCENTRACIN
10 o ms
11 o ms
35,6
1X
10
10
20
71,2
2X
10
20
30
53,4
1.5 X
20
10
30
106,8
3X
100
50
150
106,8
3X
100
35
135
137,1
3.5 X
100
20
120
213,6
4X
Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay
formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa produccin de gas, incubar 24 h. ms.
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Control de calidad
1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por
estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inculo ligero para evitar
turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons)
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una
prueba positiva.
NOTAS
Para determinar la produccin de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogca de forma recta.
Versin para Administrador de Manuales y Documentos
(AMyD). Facultad de Qumica, UNAM
12
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG
(4 metil-umbeliferil-
-D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especfico
4-metilumbeliferil-beta-D-glucurnido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser
expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una
fluorescencia azul fcil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se
puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa
A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formacin de
gas , tomar una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de
confirmacin EC-MUG.
Incubar a 44,5 0,2C en bao de agua durante 24 h., observar si hay formacin de
gas; si no se observa la formacin de gas continuar la incubacin 24 h. ms.
Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la
lectura.
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo.
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
2. Alimentos
2.1 Preparacin de la muestra.
Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de
trabajar con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2 y 5 C.
Aadir 1.0 mL de la dilucin 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo
lauril sulfato de sodio.
Aadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada
una con caldo lauril sulfato de sodio.
Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h.
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y produccin
de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Control de calidad
Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y
una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las
muestras.
Incubar las placas a 35 0.5C durante 24 2 h., observar las colonias tpicas
fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales
biliares.
Se obtenga las siguientes combinaciones para el IMVIC: Biotipo 1(++--) o Biotipo 2 (+--) son consideradas como Escherichia coli.
Calcular el NMP de E. coli basndose en la proporcin de los tubos positivos de
caldo EC.
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,6
4,6
8,0
>8,0
TABLA 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con
10 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos
Positivos
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
9,2
12,0
16,1
23,0
>23,0
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
BIBLIOGRAFA
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995. Productos crnicos
troceados y curados. Productos crnicos curados y madurados. Disposiciones
y especificaciones sanitarias. Apndice normativo B. De la estimacin de la
densidad microbiana por la tcnica de nmero ms probable.
CCAYAC-M-004 (2006) Estimacin de la densidad microbiana por la tcnica
del nmero mas probable, deteccin de coliformes totales, cliformes fecales y
Escherichia coli por el nmero mas probable
Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th
ed. Arlington, VA: AOAC.
Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed.
2006, pp 935-936
Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiologa Mdica de
Jawetz. Manual Moderno 17a Edicin 2002, pp 274-275
Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) Enterobacteriaceae, Coliforms, and
Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of
Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito
K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82.
International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005)
Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL