Para qu romper clulas?

Para obtener productos que se encuentran en

el interior de las clulas.
La tcnica de RC seleccionada
determina el tamao de los
desechos y la inuencia que
tendrn en las operaciones que
se utilicen para su separacin.
!"#$%&'( *# %+'*,-.'(
/0.+1-#&,&1+#(
cldos nuclelcos
Lnzlmas
1anasa
lnverLasa
roLeasas
unA pollmerasa
lgmenLos
8-coerlLrlna (8L), coloranLe rosa
ollmeros lnLracelulares
Anublucos
Caldo de
fermentacin
Separacin de clulas
Rompimiento celular
Separacin,
tratamiento de
cuerpos de inclusin
s
o
b
r
e
n
a
d
a
n
t
e

Con
clulas
protenas
intracelulares
Concentracin
Purificacin alta
resolucin
refinamiento
Refinamiento

S
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a
s

La recuperacin ptima de productos intracelulares
requiere del conocimiento de la estructura de las
capas externas que protegen a las clulas.
Paredes microbianas:
La Lecnlca uullzada
deLermlnar el Lamano
de los desechos que se
produclrn
2!34567287 9! :;<=;:4
3!>;>4:
La seleccln de una Lecnlca depende de las
caracLerlsucas del producLo:
! 8eslsLencla a:
- Medlos alcallnos
- SolvenLes
- ueLergenLes
- Lnzlmas
- 1emperaLura
- Lsfuerzo de corLe
Los meLodos de rupLura celular en la
lndusLrla pueden ser dlvldldos en:
MeLodos qulmlcos
MeLodos nslcos
MeLodos blolglcos
8CMlMlLn1C
CLLuLA8
:;<=;:4 9! 3?>;>47 9! 263:88:@4567287
2A.'*'( BC(/-'(
2A.'*'( D,C$/-'( 2A.'*'( E/'&FG/-'(
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MeLodos qulmlcos:
Choque osmuco
ermeablllzacln
ulsolucln llpldlca (Lolueno 10 de la blomasa)
ulgesun enzlmuca (enzlmas que aLacan la
pared celular)
1raLamlenLo alcallno
ueLergenLes
Llollzacln
Los meLodos no-mecnlcos son US-/&#( *#
#(-1&1+, sl uno neceslLa LraLar 10 veces ms
maLerla orgnlca basLa con adlclonar 10
veces ms reacuvo qulmlco o enzlmuco
TCNICAS PRINCIPIO
ESTRS EN EL
PRODUCTO
COSTO EJEMPLO
Solubilizacin
Detergentes solubilizan la
membrana
Suave
Moderado/
Caro
Choque osmtico
Ruptura osmtica de la
membrana
Suave Barato
Ruptura
de glbulos rojos
Disolucin lipdica
Solventes orgnicos actan
sobre
la pared celular
desestabilizndola
Moderado Barato
Rompimiento de
levaduras con
tolueno
Digestin
enzimtica
Rompimiento por la digestin
de
la pared celular
Suave Caro
Micrococcus
lysodeikticus
tratado con
lisozima
Tratamiento
alcalino
La saponificacin de los
lpidos solubiliza la
membrana
Fuerte Barato
Permeabilizacin
enzimatica
Permeabilizan la membrana
ocasionando
la ruptura de la clula
Suave Caro
Tratamiento de M.
lysodeikticus
con lisozima
8omplmlenLo celular por meLodos qulmlcos.
MeLodos mecnlcos:
MeLodos a pequena escala:
- ulLrasonlcacln
- Molldo con abraslvos
- Pomogenelzadores
MeLodos a gran escala:
- Pomogenelzadores a alLa presln
- Mollnos de perlas
TCNICAS PRINCIPIO
ESTRS
SOBRE EL
PRODUCTO
COSTO EJEMPLO
Homogeneizador
de cuchillos
Las clulas son
rotas en un mezclador
Moderado Moderado
Rompimiento de tejidos y
clulas animales.
Homogeneizador
alta
presin
Las clulas son forzadas
a pasar a travs de un
pequeo orificio,
produciendo su ruptura
por el esfuerzo de
corte
Fuerte Moderado
Tratamiento a gran
escala
de suspensin
de clulas.
Molienda
Las clulas son rotas
por medio de una
molienda con abrasivos
Moderado Barato
Molino de perlas
Las clulas son
trituradas con perlas de
acero o vidrio
Fuerte Barato
Rompimiento a gran escala
para suspensiones de clulas y
clulas de plantas
Ultrasonificacin
Las clulas son
quebradas en una
cavidad ultrasnica
Fuerte Caro
Rompimiento de suspensiones
de clulas a lo menos en
pequea escala
8omplmlenLo celular por meLodos mecnlcos
MeLodos blolglcos:
Lnzlmas
lagos
AgenLes lnhlbldores de pared celular
LsLos meLodos no son muy empleados
debldo a que son muy cosLosos.
Anlmales
Mlcello
8acLerlas Cram +
8acLerlas Cram -
Levaduras
Lsporas
7 = Fcil de romper 1 = Difcil de romper
ulculLad para romplmlenLo de dlferenLes upos de celulas.
Cue hay que Lomar en cuenLa para la
seleccln de un meLodo de rupLura celular
naLuraleza del producLo lnLracelular
Lscala de la operacln
velocldad
LsLabllldad del producLo
ureza del producLo
CosLo del meLodo
3P8D;! 872V=638
Las celulas se colocan en un volumen de agua
frecuenLemenLe 2 veces mayor que el volumen de
celulas.
Las celulas se expanden, por un slmple u[o osmuco
que se produce debldo a que las celulas conuenen
soluLos, ocaslonando que el agua enLre al lnLerlor.
uebldo a esLa expansln puede conduclr a su llsls o
romplmlenLo.
Ll uso de esLe
meLodo depende de
la reslsLencla de las
celulas.
Ley de van`t Hoff
='&,#0/J1-/F0W
8upLura a alLas concenLraclones, , se Lraba[a a
ba[as LemperaLuras, celulas lnacuvas
meLabllcamenLe.
ermeablllzacln a ba[as concenLraclones,
celulas meLabllcamenLe acuvas comlenzan a
desLrulrse.
9/G#(RF0 #0J/$SR-1
ConslsLe en el empleo de enzlmas que aLacan a la
pared celular hldrollzndola.
ermeablllzando la membrana para llberar
compuesLos lnLracelulares al medlo o romplendo
compleLamenLe la celula.
9/G#(RF0 #0J/$SR-1
A pP< 3 las celulas no se rompen aun cuando la
pared haya sldo desLrulda por dlgesun.
Los cosLos son muy alLos
no hay recuperacln de las enzlmas empleadas
Mayor suscepubllldad a Cram +
L[emplos
Cram(+): llsozlma
Cram(-): llsozlma + ALu1
Levaduras: 1,3-glucanasa,
1,6-glucanasa manasa, qulunasa
<#+$#1Q/&/J1-/F0 -'0 *#.#+G#0.#(
Los deLergenLes uenen una zona hldronllca y oLra
hldrofblca, por esLa razn pueden lnLeracLuar LanLo
con el agua como con los llpldos. Su habllldad se basa
en la solublllzacln de los llpldos de la pared celular
Los deLergenLes ms uullzados son de Lres upos:
-ueLergenLe anlnlco
-ueLergenLe caunlco
-ueLergenLe no-lnlco
L[emplos ueLergenLes anlnlcos :
uodecll SulfaLo de Sodlo (SuS)
SulfonaLo de Sodlo
1aurocloraLo de Sodlo
ColaLo de sodlo
L[emplos ueLergenLes caunlcos:
8romuro de CaulLrlmeul Amonlo (C1A8)
L[emplos ueLergenLe no-lnlcos
1rlLon x-100
1ween
Spam
<#+$#1Q/&/J1-/F0 -'0 *#.#+G#0.#(
A ba[as concenLraclones no se produce
degradacln de llpldos.
A alLa concenLracln se produce una degradacln
que resulLa llneal a la concenLracln de deLergenLe,
[unLo a esLa varlable Lamblen se alLera la Lensln
superclal de la solucln.
<#+$#1Q/&/J1-/F0 -'0 *#.#+G#0.#(
rocedlmlenLo:
1. Se coloca un deLermlnado volumen de
deLergenLe concenLrado por un volumen de
celulas. CeneralmenLe la mlLad de volumen de
deLergenLe
que de volumen de celulas.
2. Ll deLergenLe rompe la membrana celular.
3. La suspensln resulLanLe se cenLrlfuga para
remover los fragmenLos de celulas y se pasa por
eLapas de exLraccln para alslar el producLo.
<#+$#1Q/&/J1-/F0 -'0 *#.#+G#0.#(
1raLamlenLo de las celulas con soluclones alcallnas
(kCP, naCP, pP 11.3-12.3, 20-30 mln)
venLa[as:
Slmple y baraLo
Apllcacln a gran escala
uesvenLa[as:
1raLamlenLo fuerLe, los llpldos son converudos en
deLergenLes
no selecuvo
Apllca unlcamenLe sl las enzlmas a alslar son
esLables a pP alcallno
;&.+1('0/I-1-/F0
lrecuenclas >20 kPz produclendo vlbraclones
que provocan el fenmeno de cavlLacln.
- Se producen zonas de ba[a presln en el
llquldo
- Ll llquldo se Lransforma en gas formndose
pequenas burbu[as
- Las burbu[as colapsan debldo a los camblos
de presln.
- Se producen fuerLes esfuerzos de corLe en el
llquldo que rompen las celulas.
;&.+1('0/I-1-/F0
uesvenLa[as:
roduccln de radlcales llbres
uesLruccln del producLo por las ondas
uesLruccln del producLo por la
LemperaLura
Llevados requerlmlenLos de energla
AlLos cosLos
P'$'G#0#/J1-/F0
Pomogenelzadores: el maLerlal blolglco
se someLe a una fuerLe presln
hldrosLuca (300 aLm) y la presln se
llbera bruscamenLe que el llquldo salga
por una vlvula.
La ldea es generar alLos esfuerzos de corLe
que produzcan la rupLuras. LsLos se pueden
obLener por:
1. Lmbolos
2. Cuchlllas
3. lsLones
3'0G#&1-/F0X*#(-'0G#&1-/F0
lormar y deshacer los crlsLales de hlelo
venLa[as:
Muy slmple de reallzar
Se reallza a ba[as LemperaLuras
uesvenLa[as:
1lempos largos
Algunos mlcroorganlsmos son reslsLenLes
Senslbllldad de las enzlmas a congelacln/
descongelacln
2'&/0' *# %#+&1(
Cperacln lnLermlLenLe: Ll romplmlenLo celular
con perlas aglLadas a alLas velocldades slgue una
clneuca de prlmer orden.
Ll balance de masa llberada puede ser expresado
medlanLe la ecuacln:
L[emplo 1:
CbLencln y purlcacln de la enzlma monxldo de
carbono deshldrogenasa, a parur de exLracLos celulares
de la bacLerla !"#$%&'%()* ,*'-%.#/%0%'*123 cepa CM3.
Las bacLerlas con llsozlma se colocaron en un bano marla
duranLe 12 horas a 40C. osLerlormenLe, se compleL el
romplmlenLo celular por sonlcacln en un equlpo
8ranson Sonlfer (vW8 Company), con la slgulenLes
lndlcaclones:
CuLpuL conLrol: 7, uuLy cycle: 60, 1lme: 10 mlnuLos
osLerlormenLe se solublllz con el deLergenLe 1rlLn
x-100 debldo a que la enzlma que se desea obLener
esLaba llgada a la membrana.
La meLodologla uullzada conslsu en agregar a cada
600mL de exLracLo celular despues de la sonlcaclon,
200mL de 1rlLn x-100, se de[ homogenlzar la solucln.
Se de[ acLuar por una hora y se cenLrlfug a 10000 rpm
duranLe 43 mln en una cenLrlfuga refrlgerada.
Se Lom el sobrenadanLe y el deLergenLe remanenLe fue
reurado medlanLe dlllsls.
L[emplo 2: 8upLura celular de 4*,,)*'%56,72
,7'70#2#*7 por medlo de meLodos qulmlcos.
Se basan en el uso de solvenLes orgnlcos y
deLergenLes para acelerar los procesos de auLllsls
de 48 ,7'70#2#*78 Ll slsLema se basa en la auLllsls
celular por medlo de una plasmllsls orlglnada por
LraLamlenLo de las celulas con solvenLes orgnlcos.
ara segulr la llberacln del conLenldo
lnLracelular mlden la canudad de la proLeasa
vacuolar carboxlpepudasa. ? llberada por la
celula, requlrlendo el proceso un no conLrol
del pP alrededor de 8. LnLre los solvenLes
orgnlcos desLacan los alcoholes de cadena
enLre 6 y 9 carbonos de longlLud.
Los deLergenLes con me[ores resulLados son el
1rlLn x-100 y n-laurllsarcoslna.
venLa[as a nlvel lndusLrlal:
no requlere aparaLos especlales
8esLos celulares fclles de separar por cenLrlfuga
CosLo de los producLos lnducLores ba[o.
uesvenLa[as:
ulculLad para ellmlnar compuesLos qulmlcos
8lesgo de desnaLurallzacln
Largos uempos para lograr la auLllsls 20-30h.
AumenLan el rlesgo de las proLelnas de lnLeres por
la proLeasas presenLes.
L[emplo 3: 8upLura celular de 48 ,7'70#2#*7 por
medlo de enzlmas llucos comblnado con el uso
de esLablllzadores osmucos.
Con esLos LraLamlenLos se ha logrado la llberacln
selecuva de enzlmas y proLelnas locallzados en
dlferenLes comparumlenLos celulares. Ll comple[o
empleado procede de !7'29%:#* .*1&)#1%"6;,*. Se
LraLa de una mezcla de enzlmas llucos con
acuvldades en beLa-1,3-gluconasa, proLeasa,
beLa-1,6-glucanasa, mananasa y qulunasa.
1odas acLuan en forma slnerglca en la
degradacln de la pared celular, la acuvldad
mananasa que degrada la capa exLerna de
manano de la pared y la beLa-1,3-glucanasa para
la degradacln de la capa lnLerna de glucano.
La producclon de esLas enzlmas obLenlda en un
fermenLados de 2000 llLros es suclenLe para
llsar un fermenLador de 100,000 llLros de 48
,7'70#2#*7.