12/09/2018

Técnicas histológicas Procesamiento convencional

PROCESAMIENTO CONVENCIONAL 1. Fijación

En general •Es el primer paso del procesamiento

1. Fijación microscópico habitual
2. Inclusión
3. Corte •Objetivo de la fijación: conservar la
4. Tinción/contraste (ya explicado) estructura y composición celular
-Detener la actividad enzimática
Algunos materiales (sangre, epitelio oral,….) -Inmovilizar macromoléculas (proteínas, etc..)
1. Fijación -Evitar la pérdida de sustancias
2. Extensión o frotis
3. Tinción/contraste

Tipos de fijación Fijación química

1. Fijación química (la más generalizada) Fijadores de M. de luz : más suaves

Se realiza mediante la reacción • Formol (muy habitual)
química entre las moléculas
Un grupo reactivo
biológicas y el fijador

Fijadores de M. electrónico : más fuertes

2. Criofijación (estudios especiales) • Tetróxido de osmio • Glutaraldehído
Se realiza mediante la congelación
del tejido

Varios grupos reactivos

Ejemplos de reacciones de fijación MO y ME

La ME necesita mejor fijación
• Formol
Un enlace
Ej: mitocondrias
ML ME Molécula fijada,
inactivada

• Tetróxido de osmio Varios enlaces

Fijación más fuerte

Moléculas unidas

Otra ventaja del OsO4

A la vez, da contraste
REACCIONES QUÍMICAS:
Glauert-Lewis Fawcett COMPRENDER (átomo de osmio)

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La fijación habitual para ME utiliza dos fijadores

Sin fijación multifuncionales secuencialmente
• Glutaraldehído. Fija proteínas → conserva el
citoplasma

Fijador Con Sin glutaraldehído

glutaraldehído
monofuncional

Fijador multifuncional •Tetróxido de osmio. Fija lípidos insaturados

→ membranas fijadas y electrodensas (Os)
(varios grupos reactivos)

Inmovilizan las macromoléculas y C=C

conservan la arquitectura celular Sin OsO4
Con OsO4
Koehler

Fijación física: fijación por frío Tras la fijación (paso 1)

Estudios no rutinarios (muestras sensibles a 2A. Inclusión y corte 2B. Extensiones
fijación química, biopsias intraoperatorias….) (lo habitual) (algunos tejidos)
Inmersión de la muestra en gases líquidos a muy
bajas temperaturas → congelación muy rápida

INCLUSIÓN M. Luz: se utiliza parafina (una cera)

 Qué es: sustitución del agua por una 1º. Deshidratar: sustituir el agua por un alcohol
sustancia dura
Muestra
 Objetivo: poder cortar la muestra, deshidra-
obteniendo secciones delgadas Agua 75% Alcohol tada
Alcohol 25% absoluto

2º. Sustituir el alcohol por otros alcoholes

Las células son blandas (tienen mucho
más hidrófobos y finalmente por parafina
agua), por lo que las secciones que se
pueden obtener directamente son Muestra
demasiado gruesas. incluída
Alcohol/xilol Xilol/parafina Parafina

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Se infiltra la parafina líquida (en estufa) Tras la inclusión → cortes (Microtomía)

Estufa Las secciones del bloque de parafina se obtienen
Frío con el microtomo (cuchilla de acero)
Parafina
líquida Bloque sólido

Grosor de los cortes de 5-10 m

parafina: varias micras 2-3 m

Los cortes se recogen en portaobjetos de vidrio Medios de inclusión para

(transparentes) microscopía electrónica

La parafina no vale (demasiado blanda)

2-3 m: corte mínimo

Se quita la parafina Encima se pone un

y se tiñe cubreobjetos (transparente)
> 0,5 m: opacidad
100-10 nm: calidad

Medios de inclusión para Muestra incluida en resina

microscopía electrónica

Se utilizan sustancias plásticas (resinas),

mucho más duras

1. Inclusor líquido
(monomérico)

2. Tras la inclusión: el
medio inclusor se
polimeriza  bloque sólido

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Las secciones del bloque de resina se obtienen Los cortes se recogen en redes metálicas
con el ultramicrotomo (portaobjetos de ME)
(cuchillas de vidrio o diamante)

Los cortes caen en

una balsa de agua
3 mm

Atlas de ultraestructura celular (Fig. 1) Contraste en redes

Las redes se colocan sobre gotas de la
solución del colorante (sales metálicas)

Primera gota: acetato de

uranilo (30 min)
Segunda gota: citrato de
plomo (15 min)

Procesamiento convencional MO (resumen)

Microtomía de material criofijado
1. Fijación (formol) 2. Inclusión (parafina)
-Criostato -Crioultramicrotomo
(M. luz) (M. electrónica) Resultado

3. Corte 4. Tinción

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Procesamiento convencional ME (resumen) Información de

1. Fijación (glut/osmio) 2. Inclusión (resina) extensiones (3D) y cortes (2D)

Directa Hay que interpretar

Resultado

3. Corte 4. Contraste(U/Pb)

Ejemplo: eritrocitos

Interpretación (3D) de los cortes (2D) Interpretación (3D) de los cortes (2D)
¿Corresponden a la misma o diferente estructura? ¿Corresponden a esferas de igual o de diferente
tamaño?

Artefactos Ejemplos de artefactos (ML y ME)

«Persiana» Roturas Pliegues
Alteraciones en la estructura original.
Producidos por el procesamiento histológico
(fijación, inclusión, corte, tinción)

-Cambios dimensionales
-Pérdida de sustancias
-Membranas alteradas
-Espacios dilatados

-Marcas de la cuchilla
-Precipitados Marca de la Pérdida de Precipitado
-Pliegues, arrugas cuchilla material (sal de uranio)