Virologa

Cultivo de Virus
Entidades Civiles
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Unidad de Capacitacin a
Curso Bsico de Virologa para Civiles

Rough Cibernus
Supervisor: Tte.1: Arturo Martnez

2 Z.M. Tegucigalpa 1996

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Cubierta de Proteinas
RNA

Nucleo

Cubierta Viral

Human Immunodeficency Virus

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CULTIVO DE LOS VIRUS

1. ANIMALES EXPERIMENTALES 2. TCNICAS DE CULTIVO EN EMBRIN
DE POLLO.

3. TCNICAS DE CULTIVO CELULAR

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CULTIVO DE LOS VIRUS

1. ANIMALES EXPERIMENTALES
a) Siempre ha sido importante en virologa b) Es un medio para aislar y desarrollar a muchos de los virus c) Pero.. La etica sobre el buen trato hacia los animales ha sido un problema (financiamiento, aceptacin de artculos en las publicaciones etc etc)

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CULTIVO DE LOS VIRUS

1. ANIMALES EXPERIMENTALES
d) Solo bajo las siguientes circunstancias: i. Virus que no puedan replicarse en embriones de pollo o en cultivos celulares. ii. Para el estudio de la patognesis de la enfermedad y es aqu donde es de gran utilidad. iii. En casos de investigaciones epidemiolgicas. iv. Para atenuar virus de humanos: Virus de la fiebre amarilla, virus Vaccinia. v. Para pruebas de seguridad y antigenicidad de vacunas para obtener las licencias. vi. Para probar agentes antivirales quimioterapeticos
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CULTIVO DE LOS VIRUS

1. ANIMALES EXPERIMENTALES
d) Solo bajo las siguientes circunstancias: vii. En la produccin de anticuerpos policlonales y monoclonales. viii. Son fuente de rganos para los cultivos celulares. ix. Son fuente de sangre (eritrocitos y PMN) para muchas pruebas. EJEMPLOS: PICORNAVIRUS Virus de la Fiebre aftosa RATN LACTANTE. RABDOVIRUS Virus de la Rabia RATN LACTANTE

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CULTIVO DE LOS VIRUS

1. ANIMALES EXPERIMENTALES
EJEMPLOS: ADENOVIRUS CANINO Virus de la Hepatitis Infecciosa Canina (IHC) CUYES en altas dosis. PERROS, ZORROS por las vas subcutnea (S/C); intraperitoneal (I/P); oral; intravenosa (I/V)

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CULTIVO DE LOS VIRUS

1. ANIMALES EXPERIMENTALES
EJEMPLOS: CORONAVIRUS Virus de la Bronquitis Infecciosa Aviaria (BIA) EMBRIONES DE POLLO Gastroenteritis Transmisible del Cerdo ((GET) LECHONES de lactantes a varios das

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1. ANIMALES EXPERIMENTALES
EJEMPLOS: HERPESVIRUS Virus de la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (IBR) CUYES recin nacidos Rinoneumonitis Equina (ER) LECHONES de lactantes a varios das HAMSTERS recin nacidos
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1. ANIMALES EXPERIMENTALES
EJEMPLOS:

HERPESVIRUS Virus de la Enfermedad de Aujeszky (VEA) CONEJOS; CUYES; RATONES, CABRAS; CABALLOS; PERROS; Y MUCHOS ANIMALES MAS LOS MAS SUSCEPTIBLES LOS GATOS ORBIVIRUS. Virus de la Lengua Azul CORDEROS; RATONES Y HAMSTERS lactantes a varios das

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1. ANIMALES EXPERIMENTALES
EJEMPLOS: ORTHOMYXOVIRUS Virus de la Influenza PORCINA: RATONES Y HURONES: neumona EQUINA: RATONES Y HURONES: neumona AVIARIA: POLLUELOS, PATOS: signos respiratorios y muerte

PAPOVAVIRUS Virus del Papiloma oral del Conejo: CONEJOS Virus del Papiloma de Shope: CONEJO COLA DE ALGODN Virus del Papiloma Bovino: BECERROS Virus del Papiloma Genital Porcino: CERDOS
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2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO.

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2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL: 1. Raza o lnea de Gallina de postura (huevo frtil) a) Plymonth Rock b) Rhode Island c) New Hamshire d) Wyandotte

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2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL: 2. Huevo frtil a) Cascarn delgado malformado defectos, protuberancias, spero
Al golpear

NO

Resonancia (+) BUENOS Resonancia (-) MALOS

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2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL: 2. Huevo frtil b) Tiempo de puestos - Mximo 5 das - Se almacenan

HACIA ARRIBA A 13C HUMEDAD 40%

CAMARA DE AIRE

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2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL:
A LAS 3 HORAS DE FERTILIZADO EN EL OVIDUCTO LA YEMA PRESENTA ENTRE 2 Y 4 CELULAS, EL DISCO DELGADO (GASTRULACION) SE FORMAN DOS CAPAS: HACIA ARRIBA EXTERNA=ECTODERMO DE 16 A 20C INTERNA=ENDODERMO SE INICIA LA EL BLASTODERMO APARECE COMO UNA INCUBACION MEMBRANA FORMADA POR SEGMENTACIONES VOLTEO DIARIO SUCESIVAS SE FORMA UNA AREA CENTRAL= ZONA PELUCIDA Y BORDES GRUESOS= AREA OPACA DE AQU A LA POSTURA= ES AQU DONDE SE DETIENE EL PROCESO DE DIVISION
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2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL: 2. Huevo frtil C) Seleccin - Tamao: UNIFORME - Forma: UNIFORME - Peso: 56 a 65g

HACIA ARRIBA A 13C HUMEDAD 40%

CAMARA DE AIRE

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2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL: 2. Huevo frtil d) Manejo - Adecuado - Con mucho cuidado - Movimientos bruscos la cmara de aire

HACIA ARRIBA A 13C HUMEDAD 40%

CAMARA DE AIRE

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CULTIVO DE LOS VIRUS

2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CONDICIONES DE INCUBACION DEL HUEVO FERTIL:
1. Colocacin con la cmara de aire hacia arriba 2. Limpieza: solo mecnica, no Con trapos hmedos ni lavarlos 3. Temperatura: 37.7C +/-1 4. Humedad relativa: 50 a 60C 5. Voltea varias veces al da: de 2 a 8 veces en un ngulo de 45 6. Ventilacin:. Relacin optima: O2 del 21% y CO2 del 0.5%
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Inoculacin en huevo embrionado

1 embrin 3 Yema 2 cavidad amnitica 4 Albmina 5 cavidad alantoidea 6 cavidad corioalantoidea 7 Membrana corioalantoidea 8 cascarn 9 cmara de aire
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RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO

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RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO

1. CAVIDAD ALANTOIDEA Edad del embrin: 9 a 11 das Vol. 0.1 a 0.2 ml

VIRUS: Virus de la Enfermedad de Newcastle Virus de la Bronquitis Infecciosa Virus de Influenza Virus de las Paperas Virus de la Encefalitis Equina del Oeste Virus de la Encefalitis Equina del Eeste Virus de la Encefalitis Equina de Venezuela EFECTO: Muerte embrionaria
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RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO 2. CAVIDAD AMNIOTICA Edad del embrin: 7 a 10 das Vol. 0.1 a 0.2 ml VIRUS: Virus de la Enfermedad de Newcastle Virus de la Bronquitis Infecciosa Virus de Influenza Virus de las Paperas Virus de la Encefalitis Equina del Oeste Virus de la Encefalitis Equina del Este Virus de la Encefalitis Equina de Venezuela EFECTO: Muerte embrionaria
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RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO 3. MEMBRANA CORIOALANTOIDEA Edad del embrin: 11 a 13 das Vol. 0.1 a 0.5 ml VIRUS: Virus de la Enfermedad de Aujeszky Virus de la Laringotraquetis Infecciosa Virus de la Viruela aviaria EFECTO: Pstulas en la membrana
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RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO 4. CAVIDAD O SACO VITELINO Edad del embrin: 6 a 8 das Vol. 0.1 a 1.0 ml BACTERIA: Chlamidias Rickettsias EFECTO: Muerte embrionaria
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3. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR
El termino de cultivo de tejidos es hoy en da sinonimo de cultivo celular. Es el crecimiento y mantenimiento del tejido o clulas vivas in vitro.

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Cultivo celular:
Tipos de cultivo celular Cultivo celular primario Cultivo celular secundario Cultivo clulas diploides Establecimiento de lnea celular Origen del cultivo celular humanos animales
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Tipos de clasificacin del cultivo celular Estacionario

Rotatorio Suspensin

Perfunsin
Explante o cultivo de rganos

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Monocapa de cultivo celular

Clulas epiteliales

Clulas fibroblsticas
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CULTIVO DE LOS VIRUS

3. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR
Los Cultivos de organos es el mantenimiento de piezas de tejidos organizados (explantes traqueales membrana sinovial) in vitro. Esta tcnica es muy til para el aislamiento de infecciones persistentes tales como el virus de la Artritis-Encefalitis-Caprina (Retroviridae: Gnero:Lentivirus): Co-cultivos de leucocitos o PMN de la sangre o la leche con clulas de la membrana sinovial. O explantes traqueales como los Coronavirus
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CULTIVO DE LOS VIRUS

3. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR
Los Cultivos de tejidos es el mantenimiento de piezas de tejidos desorganizados embebidos en coagulos y plasma in vitro. A partir de estos cultivos, las clulas en forma individual se pegaban en el fondo del cristal o plstico y empezaban a desarrollarse hasta formar un monoestrato celular. Hoy en da es una tcnica obsoleta.
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3. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR
Los Cultivos de clulas es el mantenimiento de clulas in vitro. Es un tejido disociado en una suspensin de clulas en forma individual, por un tratamiento enzimtico como lo es la TRIPSINA Las clulas se lavan con medio de cultivo celular; se cuentan y se mantienen en ese medio para clulas. Se colocan en botellas de vidrio o de plstico y estas se pegaban en el fondo y empiezan a desarrollarse hasta formar un monoestrato celular.
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CULTIVO DE LOS VIRUS

Medio de cultivo celular para crecimiento:
Nutrientes requeridos para el crecimiento celular. 1. Es una solucin salina isotnica 2. Glucosa

3. Vitaminas, coenzimas; aminocidos

4. Sol. bufferada a pH 7.2 a 7.4 o con bicarbonato, ambos buffer a base de fosfatos pueden sustituirse con HEPES: cido N-2hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfonico TES cido N-tris-(hidroximetil)metil-2aminometanosulfonico; proven mejor estabilidad del pH y reducen lo requerimentos de CO2. 5. Adems contiene antibioticos para inhibir el crecimiento bacteriano 6. Suero fetal bovino mximo 10 %.

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Medio de cultivo celular para mantenimiento:
El medio contiene los nutrientes requeridos para el crecimiento celular. 1. Es una solucin salina isotnica 2. Glucosa 3. Vitaminas, coenzimas; aminoacidos 4. Sol. tamponada o bufferada a pH 7.2 a 7.4 o un sistema tamponado con bicarbonato, ambos buffer a base de fosfatos pueden sustituirse con HEPES: cido N-2hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfonico TES cido Ntris-(hidroximetil)metil-2-aminometanosulfonico; prooven mejor estabilidad del pH y reducen lo requerimentos de CO2. 5. Adems contiene antibioticos para inhibir el crecimiento bacteriano

6. Suero fetal bovino al 2 al 5 %.

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CULTIVO DE LOS VIRUS

Cultivo celular primario:
1.
Tejidos de fetos o de jvenes se colectan aspticamente. A) B) C) D) Rin de mono verde Rin de embrin humano Tejido amnitico Embriones de ratn, pollo

2. Clulas epiteliales y fibroblastos 3. Se parten en pequeas piezas de cerca de 2 mm3. 4. Se incuba en presencia de tripsina durante 30 minutos. 5. Se produce una suspensin de clulas. 6. Se centrifuga a baja velocidad para remover el exceso de tripsina. 7. Se suspenden en medio de cultivo celular, 8. Se incuban a 37C en tubos con tapan 9. Durante varios das de forma un capa continua confluente 10. Solo se mantienen durante 5 a 10 generaciones Curso Bsico de Virologa para Civiles

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Cultivo celular primario:
1.
Tejidos de fetos o de jvenes se colectan aspticamente. A) Rin de mono verde B) Rin de embrin humano C) Tejido amnitico D) Embriones de ratn, pollo 2. Clulas epiteliales y fibroblastos 3. Se parten en pequeas piezas de cerca de 2 mm3. 4. Se incuba en presencia de tripsina durante 30 minutos. 5. Se produce una suspensin de clulas. 6. Se centrifuga a baja velocidad para remover el exceso de tripsina. 7. Se suspenden en medio de cultivo celular, 8. Se incuban a 37C en tubos con tapan de vaquelita o de plstico. 9. Durante varios das de forma un capa continua confluente 10. Solo se mantienen durante 5 a 10 generaciones 11. Se utilizan mucho para la elaboracin de vacunas Curso Bsico de Virologa para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS

Cultivo de clulas diploides: 1. Clulas de los mismos tejidos de fetos o de jvenes. A) B) C) Rin de embrin humano Tejido amnitico Embriones de ratn, pollo

2. Clulas de tipo fibroblstico y epiteliales 3. Solo se mantienen durante 100 generaciones 4. Se utilizan mucho para la elaboracin de vacunas o para estudios experimentales 5. Se almacenan en Nitrgeno liquido a -70 a -196C
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CULTIVO DE LOS VIRUS

Cultivo de lneas celulares continuas:
1. Clulas inmortales originadas de clulas cancerigenas o bien transformadas A) Rin de embrin humano B) Tejido amnitico C) Embriones de ratn, pollo 2. Son clulas epiteliales de origen tanto del ectodermo como del endodermo indiferenciables 3. Son clulas fibroblsticas de origen mesodrmico indiferenciables 4. Se almacenan en Nitrgeno liquido a 70 a -196C

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Cultivo de lneas celulares continuas

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Efecto citoptico
Clulas
normales Infeccin con poliovirus

RhMK cells

HEp-2 cells

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Cultivo de lneas celulares continuas

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Hemadsocin:
Eritrocitos de cuye adsorbidos en clulas de rin infectadas con virus de las paperas

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TIPOS DE CULTIVOS CELULARES

Lneas celulares continuas:
Cell Culture Collection Committe, CCCC
LINEA CELULAR
HeLa

ESPECIE ORIGEN
HUMANA

TEJIDO ORIGEN
CARCINOMA CERVIX

MORFOLOGIA EPITELIAL

DETROIT-6
L-132 KB AV3

HUMANA
HUMANA HUMANA HUMANA

MEDULA OSEA ESTERNAL

PULMON EMBRIONARIO CARCINOMA ORAL AMNION

EPITELIAL
EPITELIAL EPITELIAL EPITELIAL

Hep-2
CHO B14-FAF-G3 NCTC, Clona 2555

HUMANA
HAMSTER CHINO HAMSTER CHINO RATON

CARCINOMA LARINGE
PULMON, OVARIO RION TEJIDO CONECTIVO

EPITELIAL
FIBROBLASTO FIBROBLASTO FIBROBLASTO

CCRF-S-180II
BHK-21

RATON
HAMSTER

SARCOMA 180
RION

FIBROBLASTO
FIBROBLASTO
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Cuerpos de inclusin

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Cuerpos de inclusin

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Cultivo de lneas celulares continuas

EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

INFECCIN POR UN ENTEROVIRUS EN UNA LINEA CONTINUA DE CLULAS EMBRIONARIAS DE PULMN HUMANO (HEL): reas de clulas redondeadas, secas entre islotes de clulas normales (ver flecha)
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Cultivo de lneas celulares continuas

EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

INFECCION POR HERPES SIMPLEX TIPO 2 EN CELULAS RENALES: Clulas en contraste de fase en donde las clulas afectadas (ver flecha) estn agrupadas y refrctiles
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Cultivo celular de lneas celulares continuas

EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

CELULAS INFECTADAS CON EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO. En la lnea continua de clulas epiteliales humanas
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Cultivo de lneas celulares continuas

EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

CELULAS INFECTADAS CON EL VIRUS SICITIAL RESPIRATORIO. (A MAYOR AUMENTO). En la lnea continua de clulas epiteliales humanas. Se observan clulas gigantes multinucleadas

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Cultivo de lneas celulares continuas

EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

INFECCION CON EL VIRUS HVI-1 EN LA LINEA DE LINFOCITOS HUMANOS. Clulas gigantes multinucleadas, adems de espacios sin clulas.
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Efecto de los virus sobre los cultivos celulares

VIRUS
EFECTO CITOPATICO Picornavirus Herpesvirus Adenovirus Clulas redondeadas, muerte y destruccin de la monocapa celular Englobamiento celular, mas con el tipo 2 que con el tipo 1 Agrupacin de clulas redondeadas parecidos a racimos de uvas

EFECTO

Paramyxovirus
NO EFECTO CITOPATICO

Clulas gigantes multinucledas SINCITIOS (fusin celular)

Orthomyxovirus
Togavirus Rhinovirus

Clulas afectadas capaces de adsorber a los eritrocitos HEMOADSORCION

Interferencia viral, previene ECP de otros virus Interferencia viral, previene ECP de otros virus tales como ECHOvirus
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Usos del cultivo celular

Diagnstico Produccin de Antgenos Produccin de biolgicos

Produccin de anticuerpos monoclonales

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Anticuerpos monoclonales

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