Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
MICROORGANISMOS
MV. Fernando A. Hilal
Introduccin
La morfologa bacteriana puede examinarse
de dos maneras:
1. Preparado fresco forma y movilidad
2. Preparado coloreado forma y estructuras
Colorantes
Son sustancias qumicas que poseen afinidad por
algn componente celular, dando su color a la
clula.
Se clasifican en*:
1. Bsicos o catinicos
2. cidos o aninicos
3. Colorantes liposolubles
* Vullo D, Wachsman M, Alche L. Microbiologa en prctica. Manual de tcnicas de laboratorio para la
enseanza de microbiologa bsica aplicada. Ed. Atlante.
Colorantes
Origen y composicin
Pueden ser naturales o artificiales /sintticos.
La estructura qumica bsica es el anillo benceno
asociado con radicales cromforos.
Colorantes
Fuente: Elmer Koneman, Stephen Allen. Diagnstico microbiolgico. Ed. Mdica Panamericana.
Coloraciones o tinciones
Procedimiento por el cual se logra:
1. Resaltar los microorganismos en el fondo del
preparado
2. Diferenciarlos entre s y de los elementos y
detritos del fondo.
Coloraciones o tinciones
Clasificacin:
1. Positivas
Simples : azul de metileno
Diferenciales: Tincin de Gram
Estructurales: Tincin de Schaeffer y Fulton
2. Negativas
Se colorea el fondo pero no la clula: nigrosina
CATEDRA DE MICROBIOLOGIA VETERINARIA AO 2014
Muestra de alimentos
A partir de cultivos.
Muestras lquidas
Fuente: Gua de prcticas de microbiologa e inmunologa. Departamento de Microbiologa II. Universidad complutense de
Madrid. Ao 2011.
Secado y fijacin
Secado: al aire a temperatura ambiente o bien
sobre la llama a 30 cm de la misma.
Fijacin:
Calor: flameado o en platina a 60C durante 10
Qumico: metanol 95
Tincin de Gram
Principal tcnica usada para
el examen microscpico.
Pocas bacterias escapan a la
tcnica (clamidias,
espiroquetas por ejemplo)
Tincin de Gram
Fundamento:
las
diferencias
en
la
composicin de las paredes de las bacterias,
las cuales segn el colorante que retengan y
se observe, se denomina como GRAM + o
GRAM -
Tincin de Gram
Tincin de Gram
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Fijacin.
Cristal violeta 1 a 2 minutos.
Lavar con agua.
Lugol 1 minuto.
Volcar el excedente.
Decolorar con alcohol acetona
10 a 20 segundos.
7. Lavar con agua.
8. Safranina 1 minuto.
9. Volcar el excedente y lavar con
agua.
10. Dejar secar y observar con
objetivo de inmersin.
Tincin de Gram
Vidaver, A.K. and P.A. Lambrecht. Bacteria as plant pathogens. Departament of plant pathology. Nebraska University, NE, USA.
Tincin de Gram
Tinciones especiales
Fijacin.
Cubrir con carbolfucsina y calentar
hasta vapores blancos (tres veces).
No debe llegar a ebullicin.
Dejar el colorante cinco minutos.
Lavar con agua destilada.
Decolorar con el alcohol cido
durante un minuto, realizar
nuevamente en caso necesario.
Lavar con agua destilada.
Cubrir con azul de metileno un
minuto.
Lavar con agua destilada, secar y
observar con objetivo de inmersin.
Tincin de Kinyoun
(Tincin para AAR en fro)
Fundamento: Similar a la Tincin de Ziehl
Neelsen
La carbolfucsina al contener mayor cantidad
de fucsina y fenol, no es necesario calentar.
El procedimiento de tincin es el mismo
(exceptuando el calentamiento)
Mycobacterium avium
Nocardia asteroides
Tincin de endoesporas
Mtodo Schaeffer Fulton
Fundamento: El colorante verde de malaquita
es un colorante neutro que no posee afinidad
por ninguna estructura en particular, pero el
calor permite que este ingrese a la espora
resistiendo los lavados ulteriores. El colorante
de contraste tie el resto de la clula.
CATEDRA DE MICROBIOLOGIA VETERINARIA AO 2014
Tincin de endoesporas
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Tincin de endoesporas
Bacillus subtilis
Tincin negativa
Indicada para evidenciar la cpsula.
Tincin negativa
Puede realizarse con Nigrosina o con tinta china.
Procedimiento:
1. Colocar una gota de nigrosina en un extremo del
portaobjetos.
2. Mezclar la muestras (Bacillus o E. coli) con el ansa de
siembra sobre la gota de colorante.
3. Realizar un frotis.
4. Secar al aire.
5. Observar al microscopio con objetivo 40X y luego 100x
con aceite de inmersin.
CATEDRA DE MICROBIOLOGIA VETERINARIA AO 2014
Tincin Negativa
Coloracin de flagelos
Mtodo de Leifson
Fundamento: Tras la aplicacin de un
mordiente (c. tnico) al extendido se
incrementa el grosor de los flagelos y fimbrias
que sern teidos por un colorante bsico.
Coloracin de Flagelos
Soluciones:
1. Fucsina bsica (sol. Alcohlica al 1,2 %)
2. cido tnico (sol acuosa al 3 %)
3. Cloruro de sodio (sol. Acuosa al 15%)
Tincin de Flagelos
Procedimiento:
1. Lavar, desengrasar y flamear perfectamente un
portaobjeto.
2. Colocar 2 gotas del suspendido bacteriano
3. Dejar secar al aire
4. Colocar solucin final de colorante entre 5 y 15
minutos (hasta formacin de precipitado)
5. Lavar con agua, dejar secar y observar con objetivo de
inmersin.
CATEDRA DE MICROBIOLOGIA VETERINARIA AO 2014
Tincin de Flagelos
Mtodo de Leifson
Vibrio cholerae
Mtodo de Ryu
Proteus sp.
Tincin de espiroquetas
Impregnacin argntica por mtodo de Fontana
Tribondeau.
Fundamento: se utiliza acido tnico como
mordiente y luego se realiza la impregnacin
argntica con AgNO3 amoniacal (solucin de
Fontana)
Tincin de espiroquetas
Procedimiento:
1. Realizar el extendido (debe ser limpio)
2. Fijar con alcohol.
3. Cubrir con acido tnico al 5% y calentar hasta emisin
de vapores sin que hierva.
4. Lavar con agua desionizada
5. Cubrir con solucin de Fontana recientemente
preparada hasta color castao (de ser necesario
calentar suavemente)
6. Lavar con agua destilada, secar y observar.
CATEDRA DE MICROBIOLOGIA VETERINARIA AO 2014
Tincin de espiroquetas
La impregnacin argntica es un mtodo til
de demostracin de Leptospiras en fetos
bovinos abortados, ya que los intentos de
aislamiento a partir de material fetal fallan
frecuentemente*
*Mtodos de laboratorio para leptospirosis. Nota tcnica N 9. OPS OMS.
Tincin de espiroquetas
Treponema pallidum