Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

CAPTULO 1 1. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIN 1.1 Introduccin

Desde el inicio del desarrollo de la microbiologa como ciencia, a finales del siglo XIX, se han realizado diversas investigaciones, con el fin de comprender tanto la diversidad microbiana como su potencial utilidad (Madigan y col., 2007). De particular inters fue el estudio de los organismos capaces de adaptarse a ambientes cuya presin, temperatura, pH, alcalinidad, acidez o salinidad fueran extremos, respecto a las condiciones que caracterizan los hbitats considerados aptos para el ser humano. Los mecanismos utilizados por estos organismos para resistir y responder apropiadamente al estrs

fsico, mecnico o qumico de los medios extremos y la aplicacin de estos desde una perspectiva industrial han sido durante dcadas los temas preponderantes de investigacin (Rossi y col., 2003). Los organismos vivos capaces de habitar ambientes extremos son conocidos como extremfilos; entre estos, aquellos denominados halfilos, por su capacidad de habitar ambientes hipersalinos, han sido durante los ltimos 25 aos objeto de diversos e importantes estudios. (Prescott y col., 2002). En la actualidad, se sabe que los mecanismos por los cual estos organismos se adaptan a su medio se basa en la acumulacin de materiales intracelulares, como iones inorgnicos (K+, Cl-) y compuestos orgnicos compatibles, que proveen un balance osmtico con las elevadas

concentraciones de NaCl del medio (Quillaguamn, 2005; Ramrez y col., 2006). Los microorganismos halfilos han sido considerados interesantes desde el punto de vista biotecnolgico, debido a su capacidad de producir una amplia variedad de compuestos tiles para la industria, como enzimas, solutos compatibles, y polmeros, como resultado del desarrollo de mecanismos de adaptacin y proteccin frente al estrs provocado por los factores caractersticos de los medios en los que habitan (Ramrez y col., 2006). Entre los polmeros de mayor inters producidos por halfilos se encuentra el poli (3hidroxibutirato) (PHB), un polmero sintetizado intracelularmente y acumulado en forma de grnulos (Quillaguamn, 2005). El PHB posee caractersticas fsicas y mecnicas

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similares al poliestireno y otros plsticos y elastmeros derivados del petrleo, aunque por su naturaleza biolgica el PHB es biodegradable, biocompatible y no txico, caractersticas por las que es considerado un potencial sustituto de los plsticos convencionales, derivados del petrleo. Sin embargo, su fabricacin a escala industrial es limitada, principalmente por los costos elevados que implica su produccin (Choi y Lee 1999). Si bien los factores que afectan los costos totales de produccin son varios, el principal es el costo referido a la fuente de carbono a partir de la cual el microorganismo sintetiza el PHB, este representa aproximadamente el 40-50% de los costos totales de produccin (Quillaguamn y col., 2006). Por ello, en el presente trabajo de investigacin se estudi el uso de hidrolizados de almidn de yuca como una fuente alternativa de carbono considerando que estos tienen un costo inferior, por lo menos cinco veces menor al de la glucosa (el sustrato ms utilizado en la produccin de PHB). Las pruebas experimentales fueron realizadas, utilizando H. boliviensis (una bacteria halfila) como microorganismo productor; en una primera etapa, los ensayos se realizaron en frascos agitados como sistemas batch. Posteriormente, en un bioreactor operado en sistemas batch y fed-batch bajo condiciones controladas de temperatura, pH y aireacin.

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1.2 Antecedentes

El estudio de los polmeros de origen microbiano, denominados polihidroxialcanoatos, se inici probablemente el ao 1888 cuando Beijerinck, microbilogo holands, report por primera vez la presencia de grnulos de poli (3-hidroxibutirato) (PHB) en clulas bacterianas. Dcadas ms tarde, en 1927, Lemoigne describi la composicin de los grnulos observados por Beijerinck, dando lugar al descubrimiento del homopoliester conocido hoy como poli (3-hidroxibutirato), los siguientes 50 aos diversas

investigaciones cientficas derivaron en la determinacin de la funcin del polmero en la clula, el estudio de su estructura cristalina, sus propiedades fsicas y qumicas y su metabolismo, y el desarrollo de mtodos de deteccin y cuantificacin (Slepecky y Law, 1961; Braunegg y col., 1998)

Aunque durante muchos aos se analiz y report la presencia de PHB en diferentes microorganismos, el inters en su estudio se limit a su importancia fisiolgica como sustancia microbiolgica. No obstante, el reconocimiento de biopoliester como material til para la fabricacin de envases biodegradables y artculos de uso diario se dio durante la primera mitad de los aos 60. Desde entonces, diferentes industrias y centros de investigacin en el mundo (Chemie Linz GmbH, Petrochemia Danubia, Biomer, Tianjin Northern Food Inc./China, Instituto de Microbiologa de la Academia China,

Laboratorio de Microbiologa de la Universidad Tsinghua, Centro Guangdong Jiangmen para el desarrollo de biotecnologa/China, etc.) han promovido el estudio de la

produccin de PHB utilizando nuevas especies de microorganismos, desarrollando nuevas tcnicas de purificacin y mtodos de procesamiento, con el fin de lograr la optimizacin del proceso productivo del homopolmero e incentivar su comercializacin (Braunegg y col., 1998).

En Sud Amrica, y en Bolivia especialmente los estudios que se han llevado a cabo sobre polmeros biodegradables son escasos. Las principales investigaciones realizadas, han sido desarrolladas por el Centro de biotecnologa de la U.M.S.S. y se encuentran relacionadas con el aislamiento de una nueva especie bacteriana habitante de las zonas

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hipersalinas de nuestro pas (Laguna Colorada) denominada Halomonas boliviensis, un microorganismo halfilo moderado capaz de producir poli (3-hidroxibutirato) a niveles comercialmente competitivos (Quillaguamn, 2005). Los estudios realizados, han despertado inters en la produccin de biopoliester, por lo que en la actualidad se encuentran en desarrollo proyectos de investigacin, como el presente, destinados a desarrollar estrategias que permitan mejorar el proceso productivo de PHB a fin de iniciar su produccin a escala industrial en nuestro pas. 1.3 Justificacin

Durante las ltimas dcadas el uso de plsticos sintticos derivados del petrleo ha incrementado significativamente (Figura 1.1) (Mller, 2008), gracias a sus propiedades fisicoqumicas verstiles, capacidad de produccin en masa y reducidos costos de comercializacin (1 $us/Kg) (Panda y col., 2006). Sin embargo, la rpida disminucin de recursos no renovables y la acumulacin de materiales persistentes nocivos para el medio ambiente han generado inters en la produccin de polmeros biodegradables, principalmente de origen microbiano (Braunegg y col., 1998; Philip y col., 2007).

250 183 165 175

200 Millones de Tn

150 101 77 49

141

100

50

0 1985 1990 1995 2000 Ao 2005 2006 2007

Figura 1.1: Consumo mundial de plsticos derivados del petrleo

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El poli (3-hidroxibutirato), un polmero biodegradable perteneciente a la familia de los polihidroxialcanoatos, es quiz el polister ms atractivo como sustituto de los plsticos convencionales, debido a sus propiedades fsicas y mecnicas similares a las de varios termoplsticos y elastmeros derivados de la petroqumica (Guzmn y col., 2009; Bordes y col., 2009). No obstante, su elaboracin a escala industrial es limitada por los elevados costos que involucra su produccin (4-6 $us/Kg) (Quillaguamn y col., 2006). Con el fin de viabilizar la comercializacin de PHB investigadores de diversas industrias y universidades han promovido la utilizacin de nuevas cepas bacterianas productoras del polmero, el uso de fuentes de carbono econmicas y el desarrollo de procesos de fermentacin y purificacin ms eficientes (Choi y Lee, 1999). Al presente, una cepa recombinante de E. coli, Alcaligenes latus, Capriavidus nector y Halomonas boliviensis, una bacteria halfila moderada, son los microorganismos ms estudiados en la produccin de PHB (Quillaguaman, 2005). El proceso de produccin ptimo para estos microorganismos toma como precursor a la glucosa. Sin embargo, este trabajo de investigacin consider que H. boliviensis es capaz de utilizar diferentes carbohidratos como fuentes para producir PHB; por lo que se estudi la utilizacin de una fuente de carbono alternativa (hidrolizados de almidn de yuca), que permite disminuir el costo de produccin referido al precursor, sin afectar la eficiencia del proceso. Por otra parte, se logr la optimizacin del proceso a travs de la reduccin de la concentracin de NaCl requerida, pues aunque se sabe que H. boliviensis produce el biopolmero (PHB) a concentraciones de 4,5 % (m/v) (Guzmn y col., 2009), los costos debido al mantenimiento de equipos son reducidos al utilizarse concentraciones menores de la sal. La produccin de PHB fue estudiada en reactores aireados conocidos como air-lift, siendo este el primer estudio sobre la produccin del biopoliester en este tipo de fermentadores.

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1.4 Objetivos 1.4.1 Objetivo general

- Estudiar la produccin de poli (3-hidroxibutirato) por Halomonas boliviensis (LC1) utilizando hidrolizados de almidn de yuca (mandioca) como sustrato 1.4.2 Objetivos especficos

- Estudiar el crecimiento bacteriano y la produccin del polmero utilizando mezclas de xilosa y glucosa en frascos agitados. Determinar el rendimiento y productividad volumtrica de poli (3-hidroxibutirato) usando hidrolizados de almidn de yuca como sustrato. - Evaluar la produccin del polister y la evolucin del crecimiento bacteriano en un Bioreactor operado en sistemas batch y fed-batch. - Disear Bioreactores para el escalamiento de la produccin del polister en una planta piloto. - Determinar el costo de produccin del biopolmero en una planta piloto.

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CAPTULO 2 2. MARCO TERICO 2.1 Microorganismos Extremfilos: vida en ambientes extremos 2.1.1 Caractersticas generales

Hasta hace poco se pens que los medios habitables por los seres vivos se restringan nicamente a los ambientes utilizados por los seres humanos para el desarrollo de sus actividades. Sin embargo, durante los ltimos 50 aos se ha demostrado que regiones cuyas condiciones fsicas y qumicas consideradas

poco favorables o intolerables para muchos organismos, incluidos entre estos el hombre, son el hbitat comn de otros entes vivos conocidos hoy como extremfilos (Ramrez y col., 2006). Los extremfilos son organismos que se caracterizan por su aptitud para prosperar en condiciones hostiles, en trminos de temperatura, pH, presin, radiacin, humedad y salinidad. Sus lmites de crecimiento y desarrollo involucran hbitats con temperaturas de -12 a 113 C, pH 0-13, presiones hidrostticas de hasta 1400 atm., reducida disponibilidad de agua (aW 0.6-0.65), elevadas concentraciones de NaCl de 3 a 33 %(m/v), metales pesados y compuestos recalcitrantes (Podar y Reysenbach, 2006; Prescott y col., 2002; Satyanarayana y col., 2005). 2.1.2 Clasificacin y mecanismos de adaptacin La existencia de una amplia variedad de microorganismos extremfilos, como consecuencia de la presencia de diversas condiciones ambientales en nuestro planeta, dificulta la realizacin de una clasificacin precisa de estos. (Ramrez y col., 2006) No obstante, se ha establecido un criterio principal para la

categorizacin, este criterio, considera el parmetro ambiental al que se refiere la extremofilia del organismo (Ramrez y col., 2006; Satyanarayana y col., 2005). La tabla 2.1 presenta un resumen de la clasificacin y descripcin de los organismos extremfilos en funcin al parmetro ambiental al que se encuentra ligada su extremofilia.

Captulo 1

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Tabla

2.1:

Clasificacin

descripcin

de

microorganismos

extremfilos en funcin al parmetro al que est referida su extremofilia Parmetro Ambiental Tipo Crecimiento ptimo Ejemplo Pyrolobus fumarii Synechococcus lividus Pseudoalteromonas atlntica Spirulina laxa Ferroplasma acidiphilum

Hipertermfilos Temp. 80-113C Termfilos Temp. >45C

Temperatura

Psicrfilos Alcalfilos pH Acidfilos

Temp. < 15C pH>9 pH < 5 Organismos capaces

Humedad

Xerbilos

de

sobrevivir

en de

condiciones

Metallogenium

extrema sequedad. Organismos Concentracin de metales Metalfilos que Ralstonia metallidurans

crecen en presencia de concentraciones metales. Organismos que altas de

pesados

Presin

Barfilos

requieren

elevadas Methanococcus

presiones (> 1 atm) jannaschii para prosperar

Concentracin de

Halfilos

Concentraciones de 15% NaCl (m/v) o mayores

Halobacterium salinarum

sales extremos Halfilos

inorgnicas

Concentraciones de Halomonas

Captulo 1

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Moderados

3-15% NaCl (m/v)

boliviensis

Fuente: Elaboracin propia Con frecuencia los extremfilos viven en biotopos, que combinan dos o ms factores extremos, por lo que pueden pertenecer a ms de un grupo. As por ejemplo, existen microorganismos capaces de prosperar a bajas temperaturas y tolerar altas presiones o habitar medios acdicos y soportar elevadas temperaturas (Prescott y col., 2002; Podar y Reysenbach, 2006). Los mecanismos utilizados por los extremfilos para adaptarse a sus hbitats, varan en funcin del parmetro ambiental que causa mayor estrs en el medio. Estos mecanismos, pueden involucrar la acumulacin o sntesis de compuestos al interior de las clulas o la presencia de variaciones en la estructura y composicin de las biomolculas del organismo (Castillo, 2005). 2.1.3 Aplicaciones biotecnolgicas de los microorganismos extremfilos Desde su descubrimiento, los microorganismos extremfilos han sido estudiados con el fin de explotar, desde una perspectiva industrial, las propiedades y caractersticas especiales que les permiten habitar en condiciones consideradas letales para otros seres vivos (Satyanarayana y col., 2005). La mayora de los procesos industriales que involucran organismos extremfilos se basan en el uso de sus biomolculas, principalmente protenas estructurales, lpidos y enzimas. Debido a su elevada termoestabilidad y resistencia a la accin de agentes desnaturalizantes, muchas de estas biomolculas son utilizadas en la produccin de detergentes, en la industria alimentaria, textil, y qumica, y en el tratamiento del cuero (Podar y Reysenbach, 2006). Otras aplicaciones de extremfilos en procesos biotecnolgicos implican al microorganismo en s; por ejemplo, en biominera se utilizan poblaciones de microorganismos para la extraccin de metales como cobre, cobalto, oro y uranio de los minerales (Podar y Reysenbach, 2006), mientras en el rea del tratamiento biolgico de la contaminacin (bioremediacin) los extremfilos son empleados

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Antecedentes y Justificacin

para la

biodegradacin de petrleo y algunos compuestos xenobiticos, la

descomposicin de hidrocarburos y la transformacin de metales pesados (Madigan y col., 2007). La tabla 2.2 muestra a continuacin un resumen acerca de algunas aplicaciones actuales y potenciales de extremfilos en biotecnologa.

Tabla 2.2: Aplicaciones actuales y potenciales de extremfilos en biotecnologa Fuente Termfilos / Hipertermfilos ADN polimerasa Proteasas y Lipasas -amilasas, glucosidasa, xilosa/glucosa isomeras Alcohol deshidrogenasa Xilanasas Psicrfilos Proteasas, amilasas Alcalino fosfatasa Lipasas, proteasas cidos grasos poli-insaturados Alcalfilos Proteasa, celulasa, xilanasa y lipasa Ciclodextrinas Xilanasas y proteasas Pectinasa Microorganismos Detergentes Productos alimenticios, qumicos y lipasas, celulasas y Detergentes Biologa molecular Produccin de queso Aditivos dietticos alimentarios y suplementos glucoamilasas, Amplificacin de ADN por PCR Suplementos en detergentes - Industria del almidn, obtencin de Uso

pululanasa, edulcorantes (ej.: glucosa, fructosa) Sntesis qumica Blanqueamiento de papel

farmacuticos Blanqueador de pasta Tratamiento de residuos y desengomado Recuperacin de aceites, produccin

Captulo 1

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antibiticos Acidfilos Microorganismos sulfuro-oxidantes Recuperacin de metales y desulfurizacion de carbono Enzimas cido-tolerante Catalizadores en sntesis de compuestos en disoluciones cidas Metalfilos Microorganismo Halfilos PHAs Solutos compatibles Amilasas, nucleasas y proteasas cido extracto celular Microorganismos -linoleico, Plsticos biodegradables Protectores de clulas y protenas Aplicacin industrial (ej.: agentes -caroteno, saborizantes) Suplementos dietticos, colorantes Remocin de metales pesados

alimentarios, y materias primas Transformacin residuos, y degradacin de

Fuente: Elaboracin propia 2.2 Microorganismos halfilos: vida en ambientes hipersalinos 2.2.1 Caractersticas generales Los halfilos son organismos extremfilos, capaces de prosperar en ambientes hipersalinos considerados inhspitos para otros seres vivos (Prescott y col., 2002), crecen ptimamente a concentraciones de sal mayores o iguales a 5 % (m/v) y toleran por lo menos 10%(m/v) de NaCl (Quillaguamn y col., 2009). 2.2.2 Clasificacin y mecanismos de adaptacin El principal problema para la existencia de distintos tipos de microorganismos en ambientes hipersalinos es la prdida de agua citoplasmtica a causa de la elevada osmolaridad del medio. Para adaptarse y lidiar con las condiciones hostiles de este tipo de hbitats, los halfilos han desarrollado mecanismos que les permiten alcanzar un balance osmtico con las altas concentraciones de NaCl del entorno

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sin interferir en su propio metabolismo; estos mecanismos, involucran la acumulacin intracelular de compuestos orgnicos compatibles, sintetizados por el propio microorganismo, o iones inorgnicos, procedentes del medio y depositados en el interior de la clula gracias a mecanismos de transporte de membrana especficos (Meseguer y col., 2004). La acumulacin de iones inorgnicos, es considerada un estrategia de osmoadaptacin tpica de las Arqueas mientras la acumulacin de compuestos orgnicos compatibles es ms utilizada por especies halfilas de los dominios de Bacteria y Eucaria, aunque se ha reportado tambin el uso de este mecanismo de adaptacin en algunas Arqueas metanognicas (Oren, 2002; Quillaguamn y col., 2009). Los microorganismos halfilos pueden clasificarse segn sus requerimientos de sal, aunque no se ha establecido aun un criterio especfico para esta divisin, se considera tpicamente la existencia de dos tipos: - Halfilos moderados: Capaces de prosperar en medios con concentraciones de 3-15% (m/v) de NaCl. - Halfilos extremos: Crecen ptimamente en ambientes que presentan concentraciones de 15-30% (m/v) de NaCl.

Es posible tambin, encontrar organismos halotolerantes, aptos para desarrollar tanto en ambientes salinos como en medios carentes de sal (Kushner, 1978; Quillaguamn, 2005). 2.2.3 Aplicaciones biotecnolgicas de los microorganismos halfilos Los microorganismos halfilos han encontrado aplicaciones diversas e

interesantes en el rea biotecnolgica, no slo porque producen compuestos de inters industrial, sino tambin porque presentan propiedades fisiolgicas que facilitan su explotacin comercial (Oren, 2002). Se utilizan microorganismos halfilos en la produccin de alimentos fermentados, salsa de soya, enzimas extra e intracelulares (amilasas, nucleasas, fosfatasas, lipasas, gelatinasas y proteasas), solutos compatibles como glicina betana y ectonas que son utilizados como protectores de estrs y estabilizadores de

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

enzimas, cidos nucleicos y membranas, sntesis de biopoliesteres (PHAs), exopolisacridos, liposomas, lectinas y tratamiento biolgico de residuos en medios salinos (Castillo, 2005; Oren, 2002; Ventosa y col., 1998). La tabla 2.3 muestra algunas de las aplicaciones biotecnolgicas de actual y potencial explotacin de Arqueas, Bacterias y Eucarias halfilas.

Tabla 2.3: Usos biotecnolgicos actuales y potenciales de microorganismos halfilos. Producto Arqueas Bacteriorodopsina Halobacterium salinarum Material de almacenamiento memorias unidades de de Microorganismo Productor Uso

halogrfico, computadora, procesamiento, Pigmentos carotenoideos Diferentes miembros de fotoelctricos. Halobacteriaceae

convertidores

Absorcin de luz, aumento de evaporacin en tanques de

Haloferax mediterranei PHAs Polisacaridos extracelulares Diferentes halfilas Enzimas (amilasas, Haloferax mediterranei

cristalizacin de sal. Plsticos biodegradables. Recuperacin de petrleo de

arqueas pozos petroleros. Industria farmacutica, qumica, de cosmticos y alimentaria.

amiloglucosidasas, proteasa, lipasas) Bacterias Ectoina e hidroxiectoina Halomonas elongata Producida estabilizadora, PHAs Diferentes miembros de la cosmticos. como enzima en

hidratante

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

familia Halomonadaceae Enzimas nucleasas, proteasas) Eucarias -caroteno Especies de Dunaliella (amilasas, Diferentes fosfatasas, halfilas bacterias

Plsticos biodegradables

Diferentes industriales

aplicaciones

Producido como antioxidante y agente colorante de alimentos.

Biomasa

Especies de Dunaliella

Dunaliella aditivo arrugas. en

es

utilizada cosmticos

como anti

Fuente: Elaboracin propia

2.3 Polmeros biodegradables Los polmeros biodegradables son macromolculas qumicamente sintetizadas o biosintetizadas durante los ciclos de crecimiento de diversos organismos (Avrous, 2004; Bordes y col., 2009), su caracterstica principal es su capacidad de degradarse al ser incorporados en ambientes biolgicos, sufriendo modificaciones qumicas que conducen a su ruptura y a la posterior formacin de fragmentos de menor masa molecular (Platt, 2006). Los polmeros biodegradables presentan una estructura qumica diferente a la de los plsticos convencionales; sin embargo, muchas de sus propiedades fsicas y mecnicas son similares (Bordes y col., 2009). Los polmeros biodegradables pueden ser producidos a travs de diversas tecnologas, a partir de recursos renovables de origen animal o vegetal, o a partir de recursos fsiles, por lo que su clasificacin puede darse en funcin a los procesos y las materias primas utilizadas para su sntesis (Platt, 2006; Avrous, 2004; Bordes y col., 2009). La figura 2.1 muestra un esquema de dicha clasificacin.

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

Polmeros Biodegradables

Agropolmeros

Biopolisteres

Obtenidos a partir de la biomasa

Obtenidos a partir de recursos agrcolas

Obtenidos a partir de recursos fosiles

Polisacridos

Protenas

Lpidos

Polihidroxialcanoatos (PHA)

Polilctidos

Policaprolactona (PCL)

Celulosa

Animales: colgeno, casena

Poli (3-hidroxibutirato) (PHB)

cido polilctico (PLA)

Poliesteramidas (PEA)

Almidones y fculas

Vegetales: zeina, gluten

Co-polisteres alifticos

Co-polisteres aromticos

Figura 2.1: Clasificacin de los polmeros biodegradables

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

Agropolmeros Los agropolmeros son polmeros compostables y renovables, obtenidos de la biomasa a travs de procesos de fraccionamiento; entre los ms importantes se encuentran los polisacridos, los lpidos y las protenas (Avrous, 2004).

Los polisacridos son macromolculas formadas por azucares simples unidos a travs de enlaces glucosdicos, que constituyen el 75% de la materia orgnica de la biosfera (Madigan y col., 2007). Entre los polisacridos ms abundantes en la naturaleza se encuentran la celulosa, un biopolmero lineal, semicristalino sintetizado por plantas y bacterias que a pesar de no ser procesado con facilidad puede convertirse en un material biodegradable a travs de modificaciones

qumicas que alteren su estructura ordenada, y el almidn, un termoplstico altamente hidroflico de bajo costo y alta disponibilidad que puede ser utilizado como aditivo biodegradable o material de sustitucin en plsticos biodegradables (Avrous, 2004). La figura 2.2 ejemplifica este tipo de polmeros.

Figura 2.2: a) Amilosa, b) Amilopectina constituyentes del almidn

Las protenas, son biomolculas conformadas por aminocidos enlazados por medio de uniones peptdicas (Madigan y col., 2007). Las protenas de origen animal de ocurrencia ms comn son el colgeno, un biopolmero fibroso e insoluble que constituye aproximadamente el 30% de las protenas corporales de

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Antecedentes y Justificacin

las especies vertebradas, y la casena, una fosfoprotena presente en la leche y en algunos de sus derivados fermentados como el yogurt y el queso.

La protena de origen vegetal de mayor abundancia es el gluten, una glucoprotena amorfa presente en la semilla de la mayora de los cereales (Avrous, 2004). Biopolisteres

Los biopolisteres son una categora de biopolmeros que contienen el grupo funcional ester en su cadena principal. Su estructura general es la mostrada en la figura 2.3 (Ashby y col., y col., 2005).

O C R O

Figura 2.3: Estructura general de un biopoliester (Ashby y col., 2005)

Los biopolisteres pueden ser obtenidos a partir de recursos agrcolas o recursos fsiles. Entre los principales, biopolisteres, producidos en base a recursos del agro se encuentran los polilctidos y lo polihidroxialcanoatos. Entre los biopolisteres sintetizados a partir de recursos fsiles ms conocidos se encuentran la policaprolactona, las poliesteramidas, los co-poliesteres alifticos y los co-poliesteres aromticos (Avrous, 2004). Los cidos polilcticos (Figura 2.4) son biopolisteres alifticos, obtenidos mediante la polimerizacin del cido lctico (Ashby y col., 2005). Las

propiedades de los polilcticos pueden variar en funcin del proceso utilizado para la sntesis del acido lctico. Los polmeros obtenidos de monmeros naturales (LPLA) presentan un elevado grado de cristalinidad, alta resistencia a la tensin y baja elongacin por lo que son adecuados para aplicaciones que requieran

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Antecedentes y Justificacin

soportar carga (suturas, fijaciones ortopdicas), mientras aquellos obtenidos de monmeros qumicamente sintetizados (L,D-PLA) son amorfos, muestran baja resistencia a la tensin y alta elongacin lo que los hace tiles para los sistemas de liberacin de frmacos (Ashby y col., 2005; Wolf y col., 2005).

O C

CH3 C H O

Figura 2.4: Poli (cido lctico) PLA (Avrous, 2004)

La policaprolactona (Figura 2.5) es biopolister aliftico semicristalino, preparado mediante la polimerizacin por apertura de anillo de la -caprolactona (Avrous, 2004), posee una buena resistencia al agua, aceite y otros solventes. La policaprolactona se comporta como un material biocompatible, por lo que es utilizado como dispositivo para la liberacin contralada de frmacos y como sutura biodegradable (Wolf y col., 2005).
O C CH3 (CH2)5 O

n
Figura 2.5: Policaprolactona (Avrous, 2004)

Las poliesteramidas son polmeros que contienen enlaces tipo ester (COO-) y enlaces tipo amida (-CONH-) en la cadena principal. A escala industrial, las poliamidas son obtenidas por la copolimerizacin de monmeros de poliamida (PA 6 o PA 6-6) y cido adpico Las poliesteramidas ms conocidas, a pesar de haberse suspendido su produccin, son las poliesteramidas BAK1095 (cuya estructura se observa en la figura 2.6) y BAK2195, producidas por la empresa

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

qumico-farmacutica Bayer. La utilidad de BAK destacaba en la horticultura, la agricultura y la industria alimentaria (Avrous, 2004).

O C (CH2)4

O C O (CH2)4 O

O C (CH2)5 NH

x
Figura 2.6: Poliesteramida BAK 1095 (Avrous, 2004)

Los co-polisteres alifticos son biopolisteres obtenidos por la combinacin de dioles y cidos dicarboxlicos (Avrous, 2004; Bordes y col., 2009). El inters en estos polmeros se ha incrementado desde la presentacin del polmero Bionolle (Figura 2.7), comercializado por Showa Highpolymer, en 1990. La aplicacin del material abarca desde bolsas de basura y compostaje a envases para alimentos, cosmticos y espumas.
O C (CH2)4 O C O (CH2)4 O O C (CH2)4

O C O (CH2)4 O

Figura 2.7: Co-poliester aliftico BIONELLI (Avrous, 2004)

2.3.1 Polihidroxialcanoatos

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son polisteres alifticos de hidroxicidos (Naik y col., 2008), sintetizados de forma natural por una extensa variedad de procariotas

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Antecedentes y Justificacin

(Braunegg y col., 1998) a travs de la transformacin de diversos sustratos de carbono bajo condiciones de cultivo especficas, que generalmente incluyen la limitacin de nutrientes esenciales(O, N, P, S) o elementos traza (Mg, Ca, Fe) (Naik y col., 2008). Los PHAs se encuentran ampliamente distribuidos en el mundo natural; en la actualidad, se sabe que son sintetizados por ms de 300 microorganismos (Braunegg y col., 1998).

Entre los que se hallan especies de Bacterias Gram positivas y Gram negativas (ej.: Pseudomonas, Bacillus, Rolstonia y Aeromonas) y algunas Arqueas (ej.: Haloferax sulfurifontis y Haloferax mediterranei,) (Philip y col., 2006). Los PHAs se encuentran en los microorganismos en forma de inclusiones citoplasmticas, tiles como reservas de carbono y energa (Anderson y Dawes, 1990; Kessler y Witholt, 2000; Philip y col., 2006). Una vez extrados de las clulas exhiben propiedades termoplsticas y elastomricas similares a las de varias poliolefinas aunque a diferencia de estas ltimas los PHAs son biodegradables y biocompatibles, lo que permite su aplicacin en biomedicina, agricultura y en la elaboracin de envases (Guzmn y col., 2009; Bordes y col., 2009). La estructura general de un PHA es la expuesta en la figura 2.8. En esta, tanto el valor de x como la composicin del radical R determinan la identidad de la unidad monomrica (Braunegg y col., 1998). Normalmente x equivale a 1 para PHAs de relevancia comercial, R puede representar un tomo de hidrgeno o cadenas hidrocarbonadas de hasta 16 tomos de carbono y n (nmero de veces que se polimeriza el monmero) puede adquirir valores entre 100-30000 (Wolf y col., 2005).

O C (CH2)x

R C H O

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

Figura

2.8:

Estructura

general

de

los

polihidroxialcanoatos

(PHAs)

(Braunegg y col., 1998).

En funcin del nmero de tomos de carbono presentes en la cadena lateral R, los PHAs se clasifican en dos grupos: - De cadena lateral corta: el radical R est conformado por 3-5 tomos de carbono. - De cadena lateral media: el radical R est compuesto por 6-14 tomos de carbono (Quillaguamn, 2005; Naik y col., 2008).

Las diferencias en el tamao de la cadena lateral R se presentan debido al tipo de sustrato utilizado para la produccin del PHA y a la especificidad de la enzima PHA polimerasa y dan lugar a la variacin de las propiedades fsicas de los PHAs. As por ejemplo, los polihidroxialcanoatos de cadena lateral corta (termoplsticos) son tiesos, quebradizos y tienen un alto grado de cristalizacin, mientras polihidroxialcanoatos de cadena lateral mediana (elastmeros) son flexibles, de baja cristalizacin y temperatura de fusin (Philip y col., 2007).

Dependiendo del sustrato utilizado y el metabolismo del microorganismo productor pueden obtenerse monmeros de diferente estructura, lo que da lugar a una extensa variedad de polihidroxialcanoatos de cadena lateral corta y/o mediana (Bordes y col., 2009).

La tabla 2.4, a continuacin, muestra la estructura de los polihidroxialcanoatos bsicos y de mayor inters comercial.

Tabla 2.4: Estructura de los PHAs bsicos y de mayor inters comercial PHA Estructura de la cadena lateral Poli (3-hidroxipropionato) -H

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

(PHP) Poli (3-hidroxibutirato) (PHB) Poli (3-hidroxivalerato) (PHV) Poli (3-hidroxicaproato) (PHC) P(3HB-co-3HV) P(3HB-co-3HH) P(3HB-co-3HO) -CH3 -CH2CH3 -(CH2)2CH3 -CH3 y -CH2CH3 -CH3 y -(CH2)3CH3 -CH3 y -(CH2)4CH3

Fuente: Elaboracin propia

2.4 Poli (3-hidroxibutirato)

El Poli (3-hidroxibutirato) (PHB) (cuya estructura qumica se muestra en la figura 2.9) es uno de los miembros ms estudiados de la familia de los polihidroxialcanoatos (Anderson y Dawes, 1990; Bonartsev y col., 2005). Es considerado como un homopolmero de cadena lateral R corta; est constituido por unidades monomricas de 3-hidroxibutirato y es sintetizado intracelularmente por varias especies de Arqueas y Bacterias en presencia de un sustrato de carbono en exceso y, generalmente, cuando el crecimiento celular se encuentra limitado por la falta de un nutriente como: O, P, N o S (Quillaguamn, 2006).

O C (CH2)

CH3 C H O

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

Figura 2.9: Estructura qumica del PHB

La principal funcin del PHB en los microorganismos es la de constituirse en un reservorio de carbono y energa; su presencia garantiza el almacenaje de grandes cantidades de carbono reducido sin afectar significativamente la presin osmtica de la clula. Adems, con frecuencia permite retardar la degradacin de los componentes celulares importantes durante periodos de escases de nutrientes (Anderson y Dawes, 1990). El PHB se presenta en las clulas en forma de grnulos lbiles y amorfos cuyos dimetros alcanzan entre 0,2 - 0,7 m y se encuentran aislados del citoplasma gracias a la presencia de una membrana de 2 nm de espesor compuesta por lpidos y protenas (Braunegg y col., 1998). La figura 2.10 muestra a continuacin una fotografa de grnulos de PHB en clulas de la bacteria halfila moderada Halonomas boliviensis.

Grnulos de PHB

Figura 2.10: Grnulos de PHB en H. boliviensis. Fotografa tomada con un microscopio electrnico de transmisin (Quillaguamn, 2005).

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

2.4.1 Vas biolgicas para la sntesis de PHB

La biosntesis del poli (3-hidroxibutirato) se da a partir del uso de diversos sustratos como carbohidratos, cidos grasos, dixido de carbono y alcoholes y el desarrollo de diferentes vas biosintticas (como se muestra en la figura 2.11) (Quillagua mn J., 2005). La va metablica utilizada por la mayora de los microorganismos productores de PHB, hoy conocidos, involucra la formacin de molculas de acetil-CoA y el desarrollo de tres reacciones sucesivas catalizadas por tres enzimas especficas: 3-Cetoacil-CoA tiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y PHB polimerasa (Via I) (Anderson y Dawes, 1990; Quillaguamn J., 2005). La primera reaccin, catalizada por la 3-Cetoacil-CoA tiolasa, permite la formacin de una molcula de acetoacetil-CoA a travs de la condensacin reversible de dos molculas de acetilCoA. La segunda reaccin, en la que acta la enzima NADPH dependiente acetoacetil-CoA reductasa, da lugar a la transformacin estreo-selectiva de una molcula de acetoacetil-CoA en D-(-)-3-hidroxibutiri-CoA. Finalmente, la tercera reaccin, catalizada por la PHB polimerasa, permite la polimerizacin va esterificacin de 3-hidroxibutiril-CoA a Poli (3HB) (Braunegg y col., 1998; Kessler y Witholt, 2000; Philip y col., 2007).

Una variacin de la va metablica antes descrita se presenta en las bacterias de la especie Rhodospirillum rubrum. En esta, la sntesis de PHB involucra la formacin de L-(-)-3-hidroxibutiri-CoA por la accin de la acetoacetil-CoA reductasa y la posterior conversin del L-estereoismero al R-estereoismero va crotonil-CoA gracias a la accin de las enzimas estereoespecficas enoil-CoA reductasa y enoil-CoA hidratasa (Via II) (Anderson y Dawes, 1990; Quillaguamn, 2005). Por otra parte, el uso de acido butrico como precursor en la sntesis de PHB, da lugar a la formacin directa de una molcula de acetoacetil-CoA, omitiendo la

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

degradacin del sustrato a acetil-CoA y desestimando la participacin de la 3Cetoacil-CoA tiolasa en la sntesis (Va III) (Braunegg y col., 1998).

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin
III

OH
ATP AMP CoASH

SCoA
I
O

FAD FADH2
O

SCoA

SCoA

II
OH O
NADH2 NAD

CoASH

3-Cetoacil-CoA tiolasa

2H2O

NAD NADH2

OH

SCoA
Enoil-CoA reductasa Acetoacetil-CoA reductasa

SCoA

SCoA
AcetoacetilCoA reductasa

2H2O
O
Enoil-CoA hidratasa

NADPH NADP
OH O

SCoA

2H2O
CoASH

SCoA
PHB polimerasa

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

Figura 2.11: Vas para la biosntesis de PHB: (I) A partir de acetil-CoA, (II) a travs de una ruta alternativa a la va I para la conversin del estereoismero, (III) A partir de acido butrico. (Quillaguamn, 2005) 2.4.2 Propiedades

Propiedades fsicas, trmicas y mecnicas El PHB es un poliester estereoregular, pticamente activo, con el centro quiral de la unidad monomrica siempre en configuracin R, por lo que puede alcanzar un alto grado de cristalinidad (Anderson y Dawes, 1990). Su peso molecular puede adquirir valores entre 500000 a 2000000Da, dependiendo de las condiciones del proceso de fermentacin, el microorganismo y la fuente de carbono utilizada para la sntesis (Eggink y col., 1994).

El Poli (3-hidroxibutirato) es un material termoplstico, por lo que a temperaturas prximas a su punto de fusin se convierte en una resina viscosa y moldeable mientras al enfriar cristaliza rpidamente hasta convertirse en un material plstico rgido y frgil cuyas propiedades se asemejan a las del polipropileno (Tabla 2.5) (Anderson y Dawes, 1990; Braunegg y col., 1998; Marchessault y Yu; 2000).

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

Tabla 2.5: Propiedades fsicas y mecnicas del PHB comparadas con las propiedades del polipropileno Propiedades Peso molecular Densidad (g/cm3) Temperatura de fusin (C) Temperatura vtrea (C) Temperatura de utilizacin (C) Cristalinidad (%) Mdulo flexular (MPa) Fortaleza ante la tensin (MPa) Resistencia a la rotura (%) de transicin Polipropileno 2105 0.905 176 -10 -60 a 120 70 1700 38 400 PHB 5105 - 20105 1.18 -1.25 180 -5 - +5 -30 a 120 80 3500 40 5

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

Permeabilidad (cm 3/m2/tomo/da)

al

O2.

1700

45

Transmisin de vapor de H2O (g/m2/da)

----

60-70

Fuente: Elaboracin propia

Propiedades Qumicas Debido a su alto grado de cristalinidad el PHB tiene una resistencia aceptable a la presencia de solventes, grasas y aceites (Anderson y Dawes, 1990). En comparacin con el polipropileno (PP), exhibe mayor resistencia a la radiacin ultravioleta aunque, es ms susceptible al ataque de cidos y lcalis; posee baja permeabilidad al oxgeno, vapor de agua y dixido de carbono por lo que puede ser utilizado en aplicaciones que requieran la proteccin de productos sensibles a los gases (Hocking y Marchessault, 1998).

El PHB es insoluble en agua y relativamente resistente a la degradacin hidroltica. Esto, lo diferencia de otros biopolesteres que se muestran sensibles a la humedad y/o son solubles en agua (Wolf y col., 2005). Otras propiedades Debido a su naturaleza biolgica el PHB es biodegradable, biocompatible y no txico. Su degradacin completa puede realizarse tanto en condiciones aerobias como anaerobias, y a travs de medios trmicos o por hidrlisis enzimtica

(Braunegg y col., 1998; Wolf y col., 2005). En el medio ambiente el polister puede ser degradado por una amplia diversidad de microorganismos principalmente pertenecientes a las familias Pseudonocardiaceae, Micromonosporaceae,

Termomonosporaceae, Streptosporagiaceae y Streptomicetaceae. En organismos vivos el PHB se degrada principalmente por la accin de enzimas presentes en la sangre y en los tejidos (Philip y col., 2007). El ritmo de biodegradacin en el medio ambiente como en organismos vivos depende tanto de las condiciones ambientales (temperatura, humedad, pH) como

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

de las caractersticas intrnsecas del polmero (composicin del monmero, cristalinidad) (Braunegg y col., 1998; Philip y col., 2007). 2.4.3 Aplicaciones

Durante los ltimos aos el poli (3-hidroxibutirato) ha sido estudiado con el fin de explotar comercialmente todas las propiedades y caractersticas especiales que posee. Su aplicacin se ha expandido a diversas reas entre las que se incluyen la medicina y la agricultura (Philip y col., 2007).

Aplicacin industrial

En el rea industrial el principal inters en el PHB se debe a su biodegradabilidad, caracterstica que le permite ser utilizado para la elaboracin de todo tipo de materiales de embalaje, incluyendo bolsas de compost y envases para alimentos, y la fabricacin de objetos de uso diario como peines, lapiceros y artculos sanitarios desechables (Hocking y Marchessaul, 1998; Philip y col., 2007).

Por otra parte, debido a su naturaleza piezoelctrica, el biopolmero es empleado en la fabricacin de sensores de presin para teclados, instrumentos de medicin de aceleracin y elasticidad, sensores de ondas de choque, encendedores, micrfonos, detectores ultrasnicos, instrumentos de medicin de presin sonora, auriculares y parlantes (Philip y col., 2007).

Aplicacin mdica El rea mdica es quiz uno de los campos principales y ms desarrollados de aplicacin de los polmeros biodegradables, especialmente del PHB; material que por su biodegradabilidad, biocompatibilidad y no toxicidad es utilizado en medicina regenerativa o ingeniera de los tejidos, en el rea cardiovascular para la

fabricacin de parches pericardios, vlvulas de corazn, injertos y endoprtesis vasculares (Philip y col., 2007), en el rea farmacutica como films o

microcapsulas que permiten la liberacin controlada, por degradacin y difusin

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

simultanea, de drogas y hormonas (Rojas y col., 2008) y para la elaboracin de dispositivos mdicos como placas y tornillos para la fijacin de huesos y cartlagos, materiales seo-sintticos, e hilos para suturas quirrgicas (Bonartsev y col., 2007).

2.4.4 Produccin industrial

En la actualidad, la produccin a escala industrial de Poli (3-hidroxibutirato) y otros polihidroxialcanoatos es limitada, principalmente debido a los elevados costos que implica (Naik y col., 2008). Sin embargo, algunas empresas y entidades

investigadoras han estudiado el uso de nuevas cepas y han desarrollado procesos productivos y de recuperacin ms eficientes, que permiten reducir los costos de produccin de estos biopolisteres. Aunque existe un gran nmero de microorganismos productores de PHB, solo algunas cepas poseen caractersticas que pueden ser explotadas en la produccin a gran escala (Tabla 2.6); entre estas Alcaligenes latus, Capriavidus nector, Halomonas boliviensis, Azobacter vinelandii,y cepas recombinantes de Echerichia coli. Alcaligenes latus es una cepa bacteriana capaz de crecer en medios con

sacarosa, glucosa o melaza y almacenar hasta 88% de PHB en relacin a su peso seco. Fue utilizada por la compaa Chemie Linz GmbH en colaboracin con Petrochemia Danubia (PCD) para la produccin de biopoliester, de 1982 a 1988, la produccin alcanz 1000Kg/semana utilizando sacarosa como precursor. En la actualidad la compaia Bioemer de Alemania posee la tecnologa de produccin de PHB por Alcaligenes latus y los derechos de su uso. Hoy en da, el polmero obtenido es utilizado en la elaboracin de artculos de uso diario como peines y lapiceros. Capriavidus nector, es una bacteria Gram-negativa, utilizada por el Instituto de Microbiologa de la Academia china de ciencias en colaboracin con Tianjin Northern Food Inc./China, para investigar la produccin de PHB en medios con glucosa.

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

Azobacter vinelandii, es una bacteria Gram-negativa quimiorganotrofa capaz de crecer rpidamente en medios con melaza y acumular PHB hasta 90% de su peso seco. Es utilizado por el laboratorio de microbiologa de la universidad Tsinghua y el centro Guangdong Jiangmen para el desarrollo de

biotecnologa/China para la produccin de PHB, utilizando melaza como sustrato, en una planta piloto. El PHB producido alcanza masas moleculares de 1-4 millones de Da. Y es en la actualidad estudiado para su aplicacin en ingeniera de tejidos. Tabla 2.6: Produccin de PHB en sistema de cultivo fed-batch por bacterias con potencial aplicacin industrial (Quillaguamn y col, 2006). Fuente de Densidad carbono celular (g/L) Contenido de %(p/p) 81.0 PHB Concentraci n PHB (g/L) Productividad Volumtrica (g/L/h) 1.10

Organismo

Halomonas boliviensis Alcaligenes latus Echerichia coli Cupriavidus nector Cupriavidus nector Azobacter vinelandii Pseudomon as extorquens

Glucosa

44

35.4

Sacarosa

111.7

88.0

98.7

4.94

Glucosa

194.4

73.0

141.7

4.63

Glucosa Dixido de carbono Glucosa

164.0

76.0

121.0

2.42

91.3

67.8

61.9

1.55

40.1

79.8

32.0

0.68

Metanol

233.0

64.0

149.0

0.88

Fuente: Elaboracin propia

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

2.4.5 Produccin de PHB por Halomonas boliviensis

Halomonas boliviensis (Figura 2.12) es una bacteria Gram-negativa, aerbica, heterotrfica, halfila moderada, alcalinotolerante y psicroflica, a la fecha nicamente aislada a partir de muestras de suelo procedentes de orillas de Laguna Colorada, presenta un crecimiento ptimo a concentraciones de NaCl de 4.5 % (m/v), pH 7.5 y temperatura de 25-30 C en medios de cultivo complejos, no obstante, es capaz de prosperar en medios con concentracin de NaCl de 0-25 % (m/v), valores de pH de 6-11 y temperaturas entre 0-40 C (Quillaguamn, 2004).

Figura 2.12: Clulas de Halomonas boliviensis. Fotografa tomada con un microscopio electrnico de escaneo a 9500 veces de magnificacin respecto al tamao original de la bacteria (Quillaguamn, 2005).

H. boliviensis es capaz de producir Poli (3-hidroxibutirato) a partir de diferentes fuentes de carbono como glucosa, xilosa, sacarosa, acetato de sodio, maltooligosacridos y cido butrico (Quillaguamn y col., 2005; 2006; 2007). Desde su descubrimiento, se ha estudiado el efecto de las fuentes de carbono y nitrgeno en la acumulacin de PHB en H. boliviensis. Determinndose que el cultivo del microorganismo utilizando hidrolizados de salvado de trigo como sustrato, en frascos agitados, da lugar a la obtencin de una densidad celular igual

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

a 3.19g/L y un contenido de PHB de 33.8 wt%, mientras el uso de una mezcla de xilosa (0.25% m/v) y glucosa (0.75% m/v) como fuente de carbono permiti alcanzar una densidad celular de 2.2g/L y un contenido de PHB de 50 wt% (Quillaguamn y col., 2007). El cultivo del microorganismo en un medio optimizado, utilizando 1% (m/v) de hidrolizado de salvado de trigo, 0.8%(m/v) de acetato de sodio y 0.8% (m/v) de cido butrico como fuente de carbono y 0.5% (m/v) de extracto de levadura como fuente de nitrgeno, en un fermentador operado en sistema batch, dio lugar a la obtencin de una densidad celular de 8.0g/L y un contenido de PHB de 50 wt% (Quillaguamn y col., 2007). Sin embargo, la mxima concentracin de PHB (81 wt%) y densidad celular (44g/L), se obtuvieron a travs del cultivo de H. boliviensis en un fermentador operado en sistema fed-batch, utilizando glucosa como fuente de carbono, y glutamato de sodio como fuente de nitrgeno (Quillaguamn y col., 2008). Los valores obtenidos se asemejan a los valores mximos reportados hasta la fecha por otras bacterias capaces de sintetizar el biopoliester (tabla 6), por lo que se considera que H. boliviensis puede ser utilizada en la produccin de PHB a escala industrial. 2.5 Escalamiento de bioreactores

Un bioreactor es un dispositivo o recipiente en el que se lleva a cabo un proceso qumico que involucra organismos o sustancias bioqumicamente activas derivadas de dichos organismos. Si un bioreactor es utilizado en procesos de fermentacin es conocido como fermentador (Madigan y col., 2007). 2.5.1 Caractersticas de las fermentaciones a gran escala Las fermentaciones a gran escala son desarrolladas en bioreactores de acero inoxidable cuyas capacidades alcanzan entre 10000 y 500000 litros. Los fermentadores industriales generalmente se encuentran equipados con una cubierta refrigerante externa o una serie de refrigerantes internos que permiten tanto la esterilizacin del equipo y del medio de cultivo as como el control permanente de la temperatura (Madigan y col., 2007).

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

Segn el tipo de proceso (aerbico o anaerbico) en el cual van a ser utilizados los fermentadores pueden o no requerir equipamiento adicional. As por ejemplo, los fermentadores anaerbicos utilizados en la industria pueden prescindir de equipamiento especial, pues solo requieren aquel que les permita eliminar el exceso de calor generado durante la fermentacin. Los fermentadores aerbicos en cambio, necesitan un equipamiento especfico, que garantice una aireacin y mezclado adecuados Las fermentaciones a gran escala requieren de un control y monitoreo permanente. Para ello, es necesario medir el crecimiento del cultivo y la formacin del producto y realizar las modificaciones necesarias a los parmetros ambientales (temperatura, pH, concentracin de oxgeno, etc.) a medida que transcurre la fermentacin. (Madigan y col., 2007). 2.5.2 Proceso de escalado El escalamiento de un determinado proceso involucra el estudio de los problemas asociados a transferir la informacin obtenida en un laboratorio a escala de planta piloto y desde escala de planta piloto a escala industrial. El escalado involucra la realizacin y exitosa conclusin de tres etapas:

Experimentos en laboratorio: en esta primera etapa, a travs del uso de matraces y fermentadores de laboratorio (1 a 10 litros de capacidad), se lleva a cabo la seleccin de las cepas y medios de cultivo, se realizan estudios bsicos de cinticas de crecimiento, se prueban variaciones en las condiciones del medio, y se obtiene los primeros indicios acerca de la factibilidad del proceso de inters.

Pruebas en planta piloto: en esta segunda etapa, se realizan ensayos utilizando equipos de 300 a 3000 litros de capacidad; el objetivo es el de optimizar las condiciones de operacin del proceso productivo (flujos, presin, temperatura, velocidad de agitacin, etc.).

Produccin en fermentador comercial: la etapa final del escalado consiste en la elaboracin del producto deseado a niveles rentables, por medio de la evaluacin

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

de los resultados obtenidos en fases previas y la utilizacin de equipos con capacidades de 10000 a 500000 litros.

Durante cada etapa del proceso de escalado se deben controlar factores como la aireacin, temperatura, pH, etc. para determinar la forma en la que el cambio de volumen del bioreactor afecta a las variables del proceso.

2.5.3 Reactor Air-lift

Si bien en la industria existen diferentes tipos y configuraciones de bioreactores, en la mayora de los procesos biotecnolgicos, se utilizan aquellos de tipo tanque agitado, columnas de burbujeo y air-lift. De los tres tipos, el de tanque agitado es el ms utilizado, por ser capaz de suministrar altas cantidades de oxgeno por unidad de tiempo y volumen. Sin embargo, existen varias razones que hacen inadecuada su aplicacin para cierto tipo de bioreacciones; as por ejemplo, el grado de agitacin requerido para lograr suficiente transferencia de oxgeno ocasiona en algunos casos daos a las clulas que pasan a travs de las zonas de grandes esfuerzos de corte o bien, la energa mecnica suministrada para lograr una adecuada transferencia de O2 y un mezclado homogneo del medio puede resultar econmicamente inviable (Doran, 2002). Cuando se presentan este tipo de inconvenientes en la aplicacin de reactores de tanque agitado es posible emplear columnas de burbujeo o reactores air-lift. Un bioreactor air-lift es un dispositivo de contacto gas-lquido y gas-lquido-solido, agitado neumticamente (Merchuk, 1990). La estructura de este tipo de bioreactores comprende la existencia de cuatro zonas distintas, con caractersticas diferentes:

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

Zona de ascenso (riser): regin en cuya base se inyecta un gas que permite el movimiento del lquido en forma ascendente y da lugar a la mayor parte de la transferencia de oxgeno.

Zona de descenso (downcomer): regin paralela a la zona de ascenso, en la que el movimiento del fluido es descendente. La principal fuerza motriz para la circulacin del lquido es la diferencia entre las densidades o las presiones hidrostticas entre esta zona y la de ascenso.

Separador gas-lquido: seccin ubicada en la parte superior del fermentador, se conecta con la zona de ascenso y la zona de descenso permitiendo la recirculacin del lquido y la eliminacin del gas.

Base: regin ubicada en la parte inferior del bioreactor, conecta la zona ascendente y la zona descendente garantizado la circulacin continua del lquido (Chisti, 1998; Doran, 2002).

Los bioreactores air-lift se clasifican en general segn su configuracin en dos tipos: dispositivos de circulacin interna o externa. Los primeros poseen un tubo draft o deflector situado en el interior del tanque que delimita la zona de ascenso y la zona de descenso; mientras, los bioreactores con circulacin externa, en los que el movimiento del lquido se da travs de dos conductos separados, uno de dimetro menor y uno de dimetro mayor, en el que normalmente se inyecta gas. La figura 2.13 muestra, a continuacin, los esquemas bsicos de bioreactores air-lift de circulacin interna y externa.

Captulo 1

Antecedentes y Justificacin

Figura 2.13: Esquema de un bioreactor air-lift a) de circulacin interna. b) de circulacin externa (Williams, 2002).