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FACULTAD DE BIOLOGIA
TESIS
QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE
BIOLOGO
PRESENTA
Con todo mi amor y cario dedico este trabajo a las personas que me impulsaron
a buscar nuevas metas y sobre todo a cumplirlas, Mis Paps.
Rodolfo Barajas Moreno
Y
Soledad Garca Medina
AGRADECIMIENTOS
A las M.C Alma Laura Daz Prez y M.C Erendira Vargas Zepeda, por su
ayuda en la fase experimental de este trabajo, gracias por compartir su
conocimiento conmigo.
Gracias a todos!!
Y EN EL:
Abreviaturas
GC-MS
NMP
PUR
PS-PUR
PE-PUR
TDI
PURasa
MB+PURh
YES
LB
CL
AL
RESUMEN
I. I N T R O D U C C I N
de
eliminacin
(http://www.ine.gob.mx/ueajei/publicaciones/gacetas/422/envases.html?id_pub=422).
Aunque la va para el catabolismo para el poliuretano ha sido propuesta
mediante la identificacin de algunos de sus intermediarios y caracterizacin de algunas
de sus actividades enzimticas, aun se carece de informacin sobre los determinantes
gnicos implicados en tal proceso degradativo. Por lo cual el objetivo de este trabajo
consisti en identificar genes involucrados en el catabolismo del poliuretano en una
cepa identificada como degradadora del PUR, con la finalidad de contribuir al
conocimiento de los mecanismos degradativos microbianos involucrados.
1.2. Biodegradacin del Poliuretano
De manera general la biodegradabilidad de un compuesto depende de las
condiciones ambientales y su estructura qumica, ya que se ha observado que un
nmero elevado de grupos funcionales enlazados a estructuras comunes o en una
(PURasa),
Corynebacterium
sp.,
se
Enterobacter
encuentran
cepas
agglomerans,
de
Pseudomonas
Comamonas
acidivorans,
sp.,
C.
Figura 2. Posibles sitios de reaccin de actividades enzimticas capaces de atacar la estructura del
poliuretano (Oceguera-Cervantes, 2005)
1.3. Proteasas
Santerre et al., (1994) describieron que a partir de un estudio de mejoramiento de
poliuretano con fines mdicos, enzimas hidrolticas tales como la papaina o la
colesterol-esterasa eran capaces de atacar el poliuretano in vitro, pero que este ataque
no era considerable. Howard y Blake (1998), fueron los primeros en identificar una
actividad extracelular de tipo proteasa en P. fluorescens y posteriormente (Howard,
1999) describieron sus caractersticas a partir de la enzima purificada.
1.4. Ureasas
Pathirana (1983), detectaron actividades de tipo Ureasa relacionada con la
degradacin de PUR en hongos. Sin embargo, no existen reportes de actividades de
este tipo detectadas en bacterias. Un estudio posterior demostr que este tipo de
enzimas son capaces de degradar PUR, pero hasta ahora no se ha reportado su
purificacin (Santerre et al., 1994).
1.5. Esterasas
Akutsu y et al., (1998), identificaron una enzima que degrada un polister de
poliuretano, derivada de Comamonas acidovorans TB-35, la cual es una bacteria que
utiliza un PS-PUR como nica fuente de carbono. Esta enzima es un tipo de esterasa
donde la hidrlisis del polmero libera como productos de degradacin cido adiptico y
dietilen-glicol, los resultados indican que estas enzimas degradan el PUR en una
reaccin de 2 pasos: Absorcin hidrofbica por la superficie del PUR y mediante
hidrlisis del enlace ster del PUR.
Dada la estructura del PS-PUR las actividades enzimticas que podran actuar
sobre los diferentes enlaces del PUR seran de tipo proteasa, ureasa, esterasa y lipasa.
(Oceguera-Cervantes, 2005) En la Figura 2 se muestran los sitios de la molcula de
PUR en los cuales podran actuar dichas actividades enzimticas.
II. O B J E T I V O
GENERAL
10
III. M A T E R I A L E S
METODOS
b) Agar Luria-Bertani (AL): compuesto por CL, ajustado con un pH final de 6.8,
adicionando agar bacteriolgico 15 g/L.
c) Medio mnimo M9 con glucosa 20 g/L: Compuesto por Na2 HPO4 6 g/L, KH2
PO4 3 g/L, NaCl 0.5 g/L, NH4 Cl 1 g/L, ajustando el pH A 7.2, MgSO4 2mM y
CaCl2 0.01mM. Cuando se utilizo en medio slido se adicion 15 g/L de agar
bacteriolgico.
El poliuretano utilizado en este trabajo se obtuvo bajo la forma comercial de
Hydroform, el cual corresponde a un PS-PUR o PE-PUR.
Solucin A (10x)
KH2 PO4
20.0 g
K2 HPO4
70.0 g
11
Solucin B (100X)
NH4NO3
g
MgSO4 7H20
g
100.0
10.0
10.0
g
CuSO4 7H2O
g
FeSO4 7H2O
g
MnSO44-6H2O
0.10
10.0
2.0
g
12
Solucin A
K2HPO4
g
KH2PO4
g
Agua c.b.p
ml
50
25
1000
Solucin B
MgSO4
50 g
Agua c.b.p
ml
7H2O
1000
Solucin C
MnCl2 4H2O
1.000 g
CuCl2 2H2
0.014 g
ZnCl2
0.011 g
CoCl26H2O
0.020 g
Na2
MoO4
2H2O
FeCl3 6H2O
0.013 g
Agua c.b.p
0.075 g
500 ml
13
Solucin A
Agar
Peptona
NaCl
CaCl2
Tween 80
Agua destilada
c.b.p.
12.0 g
10.0 g
5.0 g
0.1 g
10 ml
1,000 ml
Preparacin:
Se adicionaron los componentes a un matraz, se calentaron hasta ebullicin y se
agitaron hasta disolucin total. Se tomaron alcuotas para su esterilizacin a 121 C por
15 minutos.
3. 3. Cepas y plsmidos.
Las cepas y los plsmidos que se utilizaron para la realizacin de este trabajo se
enlistan a continuacin en las tablas 1 y 2
14
Cepas
Comamonas
testosteroni CBQ1
P. aeruginosa
PAO1SR
Caractersticas
Referencias
Escherichia coli
JM101
Cepa estandar de laboratorio supE, thi, (lacproAB) [F, traD36, proAB, laclq Z M15]
Comamonas
testosteroni.
BGN-8
Este Trabajo
Comamonas
testosteroni.
BGN-5
Este Trabajo
Comamonas
testosteroni.
BGN-9
Este Trabajo
Comamonas
testosteroni.
BGN-14
Este Trabajo
Comamonas
testosteroni.
BGN-38
Este Trabajo
15
Plsmidos
pFac
pBluescriptII Sk
pRK2013
pB-82
pB-51
pB-91
pB-141
pB-381A
Caractersticas
Referencias
16
Figura 3. Mapa del plsmido suicida pFAC. El transposn (Tn) Himar1:: Gm contiene un gen de
resistencia a gentamicina (Gm) flanqueado por dos secuencias de repetidos invertidos (IR). Tasa, gen
que codifica la transposasa. Ap, gen de resistencia a ampicilina. OriC, origen de replicacin para
Escherichia coli (Wong y Mekalanos, 2000).
17
Figura 4.- Diagrama del vector de clonacin pBluescript II SK (-). Fl (-) ori, origen de replicacin del fago
filamentoso fl. lacZ, porcin que codifica la - galactosidasa. MCS, sitio mltiple de clonacin, a la
derecha se indican los sitios de reconocimiento por las enzimas de restriccin. Plac, promotor del operon
de lactosa. ColE ori, origen de replicacin para Escherichia coli. Ap, gen de resistencia a ampicilina.
18
19
20
21
22
23
c) Se incub a 50C por 15 min, mezclando cada 3 min y se dejo incubar por 5 min
ms.
les
fueron
realizados
corrimientos
24
0.04 M EDTA 0.001 M. Los geles fueron colocados en una cmara de electroforesis
horizontal, y se sumergieron en el mismo amortiguador. Las muestras de DNA se
mezclaron con buffer de carga (azul de bromofenol al 0.25% y xylene cyanol FF al
0.25% en solucin de glicerol al 30%) y se descarg en los orificios del gel. El
corrimiento electrofortico procedi aplicando de 90 a 110 voltios por 40 a 60 min.
Posteriormente el gel fue teido con una solucin de bromuro de etidio al 0.01%
durante 5 a 10 min. Las bandas de DNA teidas se observaron en un transiluminador
de luz UV de onda corta. Las fotografas de los geles se tomaron por medio de un foto
documentador BioCaptMw Vilber Loumat.
El DNA del fago lambda digerido con la endonucleasa HindIII o con las
endonucleasas EcoRI y HindIII fue usado como marcador de tamao molecular de DNA
lineal.
25
3.11.2. Ligacin de DNA. El DNA cromosmico de las mutantes digerido con la enzima
PstI fue ligado al el vector pBluescript II SK(-) linearizado con la misma enzima, en una
proporcin 5:1 (DNA cromosmico:vector) utilizando 500 ng del vector y la enzima DNA
ligasa del fago T4 (Promega). La reaccin de ligacin se llev a temperatura ambiente
por un periodo de 16 h (Sambrook et al., 1989). Esta mezcla de ligacin se utiliz para
transformar clulas competentes de E. coli JM101.
590 nm =0.6-
0.8)
26
transferencia se hizo por el mtodo de capilaridad usando una solucin SSC 6X. El gel
se retir de la solucin de neutralizacin y se coloc invertido en el sandwich de
transferencia (Sambrook et al, (1989). La membrana de nylon hmeda se coloc sobre
el gel, se eliminaron las burbujas de aire que se formaron entre el gel y la membrana.
Se colocaron encima de la membrana 2 piezas de papel filtro del mismo tamao del gel
humedecidas en solucin SSC 2X.
Fueron colocadas sobre el papel filtro toallas de papel absorbente un poco mas
pequeas que el papel y se coloc un objeto de aproximadamente 1,500 g encima de
las toallas de papel. La transferencia transcurri durante toda la noche, reemplazando
ocasionalmente las toallas hmedas por secas.
Los residuos de agarosa fueron eliminados de la membrana enjuagndola en la
solucin SSC 2X, y la membrana se coloc sobre papel filtro durante unos segundos. El
DNA se fijo a la membrana con luz ultravioleta (UV) utilizando un crosslinker (UVC 500
UV Crosslinker Hoefer) mediante 2 ciclos a 700 k.J.
with
28
3.13.3. Tcnica de hibridacin. Una vez que el DNA fue transferido, se procedi a la
prehibridacin, que consisti en bloquear los sitios de unin no especfica a cidos
nucleicos en la membrana, con el propsito de obtener el menor fondo posible. La
membrana se humedeci durante algunos segundos en SSC 2X y se coloc dentro del
tubo de hibridacin adicionandole 20 ml de la solucin de hibridacin (12.5 ml de
amortiguador 1 estril) (cido malico 0.1 M/NaCl 0.15 M, pH 7.5) y 5 ml de solucin de
bloqueo al 10 % (reactivo bloqueador del kit disuelto en el siguiente amortiguador 6.25
ml SSC 20X, 0.25 ml N-laurilsarcosina, 0.025 ml de SDS al 20%, 0.975 ml de agua
destilada). Finalmente se incub con agitacin lenta a 55C durante 4 horas.
Procedimiento:
Se abri el tubo de hibridacin con la membrana para adicionar 10 l de la sonda
desnaturalizada a la solucin; posteriormente la membrana se incub con agitacin
lenta durante toda la noche a 55 C. Al cabo del tiempo de incubacin, la membrana fue
lavada a temperatura ambiente con 50 ml de solucin SSC 2X/SDS 0.1 % durante 5
min y 2 veces a 60C durante 15 min con solucin SSC 0.1X/SDS 0.1%.
3.13.4. Deteccin. Para la deteccin se utilizo el kit DIG Luminescent Detection Kit
(Boehringer Mannheim). La membrana se lav durante 5 min en solucin de lavado
Tween-20 al 0.3% disuelto en amortiguador 1(cido malico 0.1 M NaCl 0.15 M, pH
7.5). Se incub durante 30 min en solucin 2 (solucin de bloqueo al 1% diluida en
amortiguador 1). El concentrado de anticuerpos (anti-digoxigenina) se diluy 1:10,000
en la solucin 2. La membrana se incub durante 30 min en la solucin del paso
anterior. Se elimin la solucin de anticuerpos y se incub por 15 min 2 veces con 100
ml de la solucin de lavado. Despus de eliminar la solucin de lavado se incub
durante 5 min en 20 ml de la solucin 3 estril (Tris-Hcl 0.1 M NaCl 0.1 M, MgCl2 6H2O
50 mM, pH 9.5). La solucin concentrada de CSPD (Disodio 3-(4-metoxipiro{1,2dioxetano-3,2-(5 cloro) tricloro[3.3.1.113, 7 n) decan{ 4-il)fenil fosfato) se diluy 1: 100
(100 l ) en solucin 3 (10 ml).
29
3.14. Secuenciacin
3.14.1 Oligonucletidos empleados. Para la secuenciacin de los fragmentos
interrumpidos por el transposn Himar1::GmR y clonados en el plsmido pBluescriptII
SK- se empleo el oligo MarOUT, (5-CCG GGG ACT TAT CAG CCA ACC-3), el cual
esta diseado de un extremo del transposn (Wong y Mekalanos, 2000).
30
31
32
IV. R E S U L T A D O S
33
Figura 5.- Estrategia general de mutagnesis por transposicin. El plsmido suicida pFac (circulo azul)
R
contiene al transposn Himar1:: Gm (barras rosas) es transferido por conjugacin de la cepa donadora
E.coli S-17 (pFac) al cromosoma de la cepa receptora Comamonas testosteroni CBQ1. Las
transconjugantes se seleccionaron en los antibiticos Sm y Gm.
4.3. Identificacin de las actividades enzimticas producidas por las bacterias que
crecen en PUR, empleando medios diferenciales
Para conocer qu actividad enzimtica presentaba la cepa silvestre de
Comamonas testosteroni CBQ1; la cual deba ser diferente a la presentada por las
mutantes, y que pudiera estar relacionada con la degradacin del poliuretano, cada una
de las mutantes fue cultivada en dos medios diferenciales, por triplicado, para la
deteccin especfica de las actividades de proteasa y esterasa.
35
Tanto las mutantes como la cepa silvestre fueron sembradas por estra en este
medio y la tincin fue aplicada despus de 48 h de incubacin. Se utiliz como control
positivo a P. aeruginosa PAO1SR la cual presenta el halo de hidrlisis y como control
negativo se utiliz a E. coli JM101, la cual no presenta halo de hidrlisis. (Figura 6).
Figura 6. Prueba de actividad de Proteasa. Las mutantes fueron sembradas por estria en medio YES. El
halo transparente alrededor de la colonia indica la hidrlisis de la protena. (1) Cepa silvestre (+); (2)
Mutante 38 (-); (3) Mutante 5 (-); (4) Mutante 9(-); (5) Mutante 14 (+); Mutante 8 (+)
y CaCI2. El Tween80
es una
36
ACTIVIDAD ENZIMATICA
CEPA
PROTEASA
ESTERASA
Comamonas testosteroni
CBQ1
Mutante 38
Mutante 5
Mutante 9
Mutante 14
Mutante 8
37
Figura 7. Prueba de Actividad Esterasa. Las mutantes fueron sembradas por estra en placas de medio
Tween 80 . El halo de precipitacin indica una prueba positiva. (1) Cepa silvestre (+); (2) Mutante 38(+);
(3) Mutante 5 (+), (4) Mutante 9 (+); (5) Mutante 14(-); (6) Mutante 8(+).
38
6 7
8 9 10 11 12 13 14 15
Pb
23,200
8,300
7,510
2,300
2,050
1,300
947
819
Fotografa del gel de agarosa mostrando los fragmentos amplificados por PCR. Carriles (1 y 4), marcador
de peso molecular de HindIII EcoR1, 2, amplificacin procedente de la mutante 38; (3), amplificacin a
partir de la mutante 5; (9), amplificacin a partir de la mutante 8,. (10), cepa silvestre la cual no muestra
banda de amplificacin. (11), amplificacin procedente de la mutante 14; y 14, amplificacin a partir de la
mutante (9). Muestras sin amplificacin (5, 6, 7, 8,10,12,13 y 15).
39
presencia de una sola insercin del transposn Himar1::GmR se realiz hibridacin tipo
Southern empleando como sonda al mismo transposn amplificado por PCR y marcado
con digoxigenina.
Para realizar el anlisis tipo Southern, el DNA total de cada una de las mutantes
se aisl (Material y Mtodos) y posteriormente se cuantific por espectrofotometra. Se
digiri el DNA total de cada mutante con la enzima PstI, la cual no tiene sitios de
reconocimiento dentro del transposn, y se realiz un corrimiento electrofortico en gel
de agarosa, a la par con el DNA total de Comamonas testosteroni CBQ1 digerido con la
misma endonucleasa. Como controles positivos de la hibridacin se utiliz el plsmido
pFAC y un fragmento de 1 kb amplificado por PCR correspondiente al transposn
Himar1::GmR. Posteriormente, el DNA se transfiri a una membrana de nylon para
despus realizar la hibridacin DNA-DNA.
Una vez revelada la pelcula, en el carril correspondiente al DNA total de
Comamonas testosteroni CBQ1 no se observ banda de hibridacin (Figura 9, Carril 4),
como se esperaba, indicando que en su genoma no se encuentra ninguna secuencia de
DNA complementaria al transposn Himar1::GmR. Mientras que en los controles
positivos correspondientes al plsmido pFAC y el producto de PCR correspondiente a la
sonda presentaron bandas de hibridacin (figura 9, carril 2), En los carriles
correspondientes al DNA de las mutantes (Figura 9. Carriles 4-7) se observaron bandas
de hibridacin de tamaos diferentes sugiriendo que ocurrieron eventos de
transposicin en cada una de las mutantes de Comamonas testosteroni CBQ1 debido a
que contienen un fragmento de DNA complementario al transposn Himar1::GmR
(sonda) se observaron manchas de hibridacin de diferentes tamaos. Esto sugiere que
ocurrieron eventos de transposicin en distintos loci del cromosoma de Comamonas
testosteroni CBQ1, por lo que el transposn esta interrumpiendo diferentes genes.
40
Figura 9. Deteccin del transposn Himar1::Gm por hibridacin tipo Southern. Carril 1, DNA del fago
(HindIII); carril 2, plsmido circular pFAC; carril 3, fragmento de PCR correspondiente al transposn
Himar1:: Gm
(sonda). Las flechas azules indican la mancha de hibridacin. Carriles de 4 a 7 DNA total
de las mutantes digerido con PstI (cepa silvestre, Mutante 8, Mutante 9 y Mutante 38).
Figura 10. Caracterizacin de los plsmidos recombinantes procedentes de las mutantes de Comamonas
testosteroni CBQ1 a PUR, las cuales contienen las regiones gnicas interrumpidas por el transposn
R
Himar1::Gm . Gel de agarosa mostrando el anlisis de restriccin de los plsmidos recombinantes con la
enzima PstI. Carriles (1), Marcador de tamao molecular -HindIII, (2), pB-8.2, (3) pB-38. (4) pB-5; (5)
marcador de tamao molecular de -HindIII; (6) pB-9, (7), marcador de tamao molecular de -HindIII; (8)
pB-14.
42
43
Figura 11.- Secuencia de nucletidos obtenida a partir del plsmido pB-91 procedente
de la mutante BGN91. En azul se indica la secuencia de la fraccin del gen (B) y en rojo
la fraccin del gen (A), indicndose con verde el sitio de insercin del transposn
Himar1::GmR . En negro se muestra la secuencia no codificante.
Title
PssmId
Figura 12.- A) Imagen representativa de la fraccin del Gen A y el gen B. B) Alineamiento de la protena
codificada por el gen B se observa los dominios con los que existe un mayor grado de identidad o
similitud.
44
(A)
5
LDRFVKAQDGIFDNAIEEILAGKKQTHWMWFIFPQLRGLGQSENAHFYGIRTLNEARNY 63
L+RFV AQ + D A+ E+ G+KQ+HWMWF+FPQ RGLG S A FYG+R+L+EAR Y
9 LERFVMAQTPLLDTALAELRQGRKQSHWMWFVFPQARGLGSSSTARFYGLRSLDEARAY 67
1
2
3
(B)
75
MPGYVSGLTVNARVFVLNKRFVPDRSTGLFDCGHEFHLVNNPNQWVADYSEFIATQISSI 60
MP YV GLTVNAR+FVLNKRFVPDRSTGLF CG EFHL NNP QW ADYSEFI QI S
MPSYVGGLTVNARIFVLNKRFVPDRSTGLFGCGQEFHLANNPEQWSADYSEFIVAQIGST 134
1 61
2
3 135
APKPKNVVLVGVSEGALPAAKVAGLSPAITHLAIIGSGGYSMRKSLATLRQKGAIQFDVN 120
AP P+N+VLVGVSEGAL A KVAG +PA+THLAIIGSGGYSMRKSL+TLR+KG I FDV
APTPRNIVLVGVSEGALTATKVAGSNPAVTHLAIIGSGGYSMRKSLSTLREKGLIWFDVE 194
1 121
2
3 195
SGWEKITADPRSIEKNWYGNSYRWWTDIMDIDPIADLLKLNIPVLIGIGEQDQSVPVESV 180
SGW+KI D RSIEK+WYGN YRWW+D+MDI+P+ D LKL IP+L+GIGEQD+SVPV+S
SGWKKIATDSRSIEKSWYGNPYRWWSDVMDIEPLPDFLKLYIPILVGIGEQDESVPVDSA 254
1
2
3
1
2
3
181
255
NFLETKFKEAGKDNLIVRVYPSADHRLNANGASYRNEFFAELGRLL
FLE+KFKEAGK+NL +RVYP+ADHRLNA G SYR EFFAEL +L
RFLESKFKEAGKNNLTLRVYPAADHRLNAAGTSYRGEFFAELSDIL
226
300
Figura 13.- Identificacin de los genes (A-B). A) Alineamiento de la secuencia de aminocidos obtenida
de la mutante BGN91, correspondiente a la fraccin del Gen A de R. rubrum, con nmero de acceso
GeneBank YP 428240.1, el cual muestra un 59% de similitud entre las secuencias. B) Alineamiento de la
secuencia correspondiente al Gen B, perteneciente a Geobacter sp. con nmero de acceso al GeneBank
ZP01388702.1, el cual muestra un 75% de similitud.
45
Tabla 4. Extensin nucleotdica secuenciada del total de las regiones clonadas en los plsmidos
recombinantes.
Mutante
Plsmido
Nmero de nucletidos
fragmentos clonados a
secuenciados
BGN-8
pB-8
1005
BGN-5
pB-5
710
BGN-9
pB-9
8.1
948
BGN-14
pB-14
4.4
910
BGN-38
pB-38
963
46
la
digestin
la
reduccin
de
protenas
no
deseadas
47
bacteria produce esterasas que atacan los enlaces ster del polmero, es decir la
enzima rompe estos enlaces y eso le permite aprovechar el polmero como nutriente.
(Figura 14).
Figura 14.- Modelo de degradacin del poliuretano PUR. Estructura del poliuretano, las flechas en rojo
indican los enlaces peptdicos, los cuales pueden ser atacados por enzimas de tipo esterasas, dichos
enlaces una vez hidrolizados, los subproductos obtenidos pueden ser utilizados por la bacteria para su
crecimiento.
48
V. DISCUSIN
49
50
51
Posteriormente,
se
prosigui
realizar
la
secuenciacin
utilizando
el
52
de agua, clasificndose como hidrolasas, estas enzimas pueden romper ya sea enlaces
peptdicos
especficos
hidrolizar
un
pptido
completo
aminocidos
(http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidasa).
53
Akutsu et al., (1997) descubri que las molculas del poliuretano contenan
enlaces de ster, lo que significa que la bacteria produce esterasas que atacan los
enlaces ster del polmero, es decir la enzima rompe estos enlaces en pedazos ms
pequeos y eso le permite aprovechar el polmero como nutriente (Figura 14).
54
VI. CONCLUSIONES
55
VII. BIBLIOGRAFA
Akutsu, y Nakajima-Kambe T, Nomura N, T Nakahara . 1998. Purification and properties
of a polyester polyurethane-degrading enzime from Comamomas acidovorans
TB-35. App Environ Microbiol, 64: 62:67
Corton, E., A. Viale. 2006. Solucionando grandes problemas ambientales con la ayuda
de pequeos amigos: las tcnicas de Biorremediacin. Ecosistemas. 2006/3
56
Howard, G.T., R. C Blake. 1998. Growth of Pseudomonas fluorescens on a polyesterpolyurethane and the purification and characterization of a polyurethanaseprotease enzyme. Int Biodeterioration and biodegradation. 42:213-220.
Howard, G. T., N. P Hilliard.1999. Growth of Pseudomonas chlororaphis on a polyesterpoyurethane and the purification and characterization of a polyurethanaseesterase enzyme. Int Biodeg Biodet, 49:245-252.
Madigan, M.T., J.M. Martinko y J. Parker. 1998. Ecologa Microbiana. En Brock Biologa
de los microorganismos. Madigan, M. T., J. M
57
polyester-polyurethane.
elastomers.
Biodeterioration,
5:679-689.
Biodeterioration 5ed. Oxley, T.A y S. Barry. Chichester: John Wiley and Sons.
58
Zhang, Y., Edward, L., Pohlmann, y P.R Gary. (2005). GlnD Is Essential for NifA
Activation,
NtrB/NtrC-Regulated
Gene
Expression,
and
Posttranslational
(http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidasa)
59
INDICE
I. I N T R O D U C C I N ............................................................................................... 1
1.1. Sntesis y usos del PUR........................................................................................ 2
1.2. Biodegradacin del Poliuretano ............................................................................ 4
1.3. Proteasas .............................................................................................................. 7
1.4. Ureasas................................................................................................................. 7
1.5. Esterasas .............................................................................................................. 8
II. O B J E T I V O
G E N E R A L .............................................................................. 10
M E T O D O S ............................................................. 11
60
62
63