PROCESO DE PURIFICACIÓN DEL POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB)

Operaciones de separación en bioprocesos

Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá
Nicolas Felipe Reina Parrado; Marco Daniel Rodriguez Rodriguez; Victor Alejandro Serrano
Echeverry; Daniel Felipe Suárez Fonseca

Tabla de contenido

1. Introducción ........................................................................................................................ 1
1.1. Producción de PHAs: .................................................................................................. 2
1.2. Aplicaciones ................................................................................................................ 3
1.3. Mercado....................................................................................................................... 4
2. Procesos de separación de PHAs ..................................................................................... 4
2.1. Centrifugación ............................................................................................................. 5
2.2. Homogeneización........................................................................................................ 6
2.3. Extracción .................................................................................................................... 8
2.4. Secado ........................................................................................................................ 9
3. Costos ............................................................................................................................... 10
4. Conclusiones .................................................................................................................... 11
Bibliografía ............................................................................................................................... 12
Anexos ..................................................................................................................................... 14

1. Introducción

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son una diversa familia de bio-poliésteres producidos por
algunas bacterias como un almacenamiento intracelular de carbono y energía para lidiar con
periodos de estrés con alta escasez de nutrientes. Se ha reportado que algunos
microorganismos pueden alcanzar a tener hasta un 80% en peso seco de PDAs. Por su
parte, el polihidroxibutirato (PHB) fue el primer PHA descubierto y estudiado (Wang et al.,
2019) La Figura 1 muestra las estructuras poliméricas en unas bacterias de la cepa
Cupriavidus necator, que corresponden a cerca del 60% de composición másica de las
células.

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 Figura 1. Cúmulos de PHAs dentro de células de C. necator (Koller et al, 2020).

Los PHAs son térmicamente procesables, tienen altos grados de biodegradabilidad y diversas
propiedades químicas y mecánicas que los hacen atractivos como un producto con valor
comercial, siendo que su producción está considerada como sostenible.

1.1. Producción de PHAs:

Ya que los PHAs son producidos dentro de las bacterias, el proceso como tal consiste en
realizar un cultivo de microorganismos y asegurarse de que estos se multipliquen de manera
exponencial, garantizando que usen la energía disponible en reproducirse y formar biomasa
(González-Contreras et al., 2015). Afortunadamente, existe una gran variedad de bacterias,
tanto Gram negativas como Gram positivas, que son capaces de producir PHAs, destacan
los géneros Pseudomona, Clostridium, Escherichia, Rhodobacter, y Bacillus. También se
incluyen algunas cianobacterias, las cuales, al ser fotosintéticas, requieren de luz solar (Wang
et al., 2019).
Como se mencionó anteriormente, para que las bacterias puedan producir los PDA es
requerido que sufran de un estrés, el cual, después de la etapa de crecimiento, es inducido
mediante diferentes técnicas, dependiendo del tipo de inóculo que se tenga. Dichas técnicas
pueden ser la limitación de nutrientes como fósforo o el nitrógeno, o alterar los niveles de pH
o las tasas de oxigenación. En algunos casos, el exceso de sustrato también puede llevar a
la formación de PHAs (González-Contreras et al., 2015).

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 Figura 1. Ciclo de producción de PHAs. Adaptado de (González-Contreras et al., 2015)

Debido a la gran cantidad de fuentes de carbón y nutrientes que existen para las bacterias,
existen también una amplia variedad de sustratos que pueden ser utilizados para el
crecimiento de los microorganismos y la producción de biomasa, dentro de los cuales se
encuentran aceites vegetales, melazas, sueros, jarabes, así como residuos industriales y
agroindustriales, y lodos de aguas residuales (Arumugam, 2020). Esto último, sumado a la
propiedad biodegradable de los PDAs, hace que una industria enfocada en este método de
producción sea muy prometedora debido a los incentivos y tendencias medioambientales que
existen hoy en día en el mundo, por lo que se siguen llevando a cabo investigaciones que
buscan superar los obstáculos económicos y técnicos de este proceso.

1.2. Aplicaciones

En cuanto a las aplicaciones de los PHAs, estas se han centrado en la producción de

productos de empaque, envolturas, pañales, toallas de higiene femenina, contenedores de
cosméticos, utensilios médicos, y tapicería. También, los investigadores en biomateriales han
demostrado que los PHAs podrían ser usados para la elaboración de dispositivos y utensilios
médicos, como suturas, sujetadores, remaches, placas óseas, mallas quirúrgicas, parches
cardiovasculares, injertos, sustitutos de piel, apósitos para heridas, hemostatos, entre otros
(Wang et al., 2019).
El uso de los PHAs también puede ser de carácter energético, ya que, si un PHB y PHA de
cadena media pasan por un proceso de esterificación, se obtiene (R)-3-hidroxibutirato metil
éster (3HBME) y un hidroxialcanoato de cadena media (3HAME), los cuales tienen poderes
caloríficos de entre 20 y 30 kJ g -1, siendo muy similares a los del etanol y el lignito. Sin
embargo, debido a que los costos de la producción de PHAs y los del proceso de esterificación
son bastante elevados, su uso como aditivo en gasolina, diesel y alcoholes carburantes ha
cobrado relevancia en los últimos años (Wang et al., 2019).

3
 1.3. Mercado

Las principales aplicaciones del PHB dentro de la industria se encuentran en áreas como
alimentos, bolsas, insumos médicos, materiales descartables, films utilizados en la
producción agrícola y otros. (Mena y Puggioni, 2015). Sin embargo, el principal inconveniente
es el alto costo de producción en comparación con los plásticos derivados del petróleo. De
acuerdo con lo indicado por Napathorn (Suchada, 2010) el costo de producción de PHB fue
entre USD 2,13 y 6,25 por kg, mientras que el de los plásticos convencionales fue de USD
1,45 por kg. A continuación, se presenta la demanda mundial de los principales biopolímeros,
en donde se puede observar que el PLA y el almidón tienen los porcentajes más altos de
demanda, debido a que han sido los más estudiados e implementados a nivel industrial.

Figura 2.Demanda mundial de biopolímeros (Roland-Holst et al, 2013)

El PHA se mantiene aún en un porcentaje bastante bajo, ya que su costo de producción es

alto, por lo que se debe investigar en disminuir este costo, utilizando diferentes operaciones
unitarias y materias primas.

2. Procesos de separación de PHAs

Después de la obtención de la biomasa, son requeridos procesos corriente abajo con el

objetivo de separar la biomasa rica en PHA del caldo de fermentación. Esta separación
generalmente se lleva a cabo ya sea por sedimentación o por centrifugación y, en algunos
pocos casos, por filtración. En caso de cultivos continuos, la separación también puede
realizarse en separadores operados de manera continua. Después de este primer paso, la
biomasa usualmente es secada, y se emplean técnicas avanzadas para recuperar el
biopolímero de la biomasa seca, propendiendo siempre por garantizar viabilidad económica,
técnica y ambiental. En ese orden de ideas, existen extracciones basadas en solventes,
destrucción de las membranas celulares mediante acción mecánica o el usos de enzimas,

4
químicos o la combinación de estos. Cada método tiene sus ventajas y desventajas, las
cuáles se pasarán a describir a continuación.

2.1. Centrifugación

La centrifugación se trata de la primera etapa en la purificación del PHB, y es principalmente

implementada para concentrar el caldo rico en biomasa, separando el exceso de agua que
existe en la mezcla. Es necesario la eliminación del agua, ya que los residuos de agua en la
biomasa obstaculizan la eficiencia del proceso de extracción, lo que resulta en una escasez
hidrolítica en la masa molar del PHA (Koller, Niebelschütz & Braunegg, 2013).
La centrífuga a utilizar será una centrífuga decantadora, la cual tiene un esquema general el
cual es presentado a continuación:

Figura 3. Esquema general de centrífuga decantadora

Según la ley de sedimentación de Stokes, hay dos factores principales que afectan a las tasas
de sedimentación de las partículas: las diferencias en la densidad y el tamaño de las
partículas en suspensión. Estos factores controlan independientemente la eficiencia de
separación del proceso de fraccionamiento (Noda, 1999). Las principales variables a tener en
cuenta en esta operación, son el tiempo de residencia y la velocidad de centrifugación.
Además es importante evaluar los demás parámetros de la centrífuga por medio del análisis
Sigma. Desarrollando las ecuaciones, y tomando como referencia las medidas que tiene la
centrífuga decantadora, se logra llegar a la siguiente expresión:

𝑄𝑓 = 𝑣𝑠 ∗ 𝛴

𝜋𝐿𝜔2 𝑟22 − 𝑟12

𝛴= ∗
𝑔 𝑙𝑛(𝑟2 /𝑟1 )

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 Figura 4. Parámetros de centrífuga decantadora

El tiempo de residencia depende principalmente del grado de separación que se desea

alcanzar dentro de la operación. Tanto en este, como en la mayoría de los casos se desea
alcanzar una eficiencia bastante alta, en la que se busca eliminar la mayor cantidad de agua
posible para que esta no tenga ninguna incidencia en la etapa de extracción. Con respecto a
la velocidad de centrifugación se tiene en cuenta que la velocidad cumpla con el tiempo de
residencia además de tener en cuenta que no dañe de ninguna manera la célula de la bacteria
utilizada. Como ejemplo, cuando el E.coli sobrepasa velocidades superiores a 15000G son
perjudiciales para la integridad de las células (Peterson et al. 2012). En 3,5 horas de período
de centrifugación, se puede lograr el 99,5% de recuperación de la biomasa (Ling et al, 1997).
Tomando como base calculó una producción aproximada de 4,200 ton PHB/año, y que
además de la etapa de producción de PHB resulta una capacidad de aproximadamente
45,000 L/h con una concentración de PHB de 186 g/L, siendo lo demás agua del proceso.

2.2. Homogeneización

El proceso de homogeneización busca extraer el PHB intracelular y que este se convierta en

PHB extracelular para proceder con la purificación del mismo, hay una gran variedad de
métodos de rompimiento celular sea químicos o mecánicos, en el anexo 1, se presenta una
tabla con los diferentes métodos junto con un costo aproximado de implementación, pero sólo
algunos de estos métodos han sido usados en escala industrial, ya que la mayoría de los
métodos se limitan a su uso en laboratorios. Con base en la tabla 1 del anexo 1, se determina
el uso de “Bead mills” o también conocidos como molino de perlas de alta velocidad, ya que
su costo es menor comparado con otros métodos y adicionalmente el material obtenido
presenta un tamaño de partícula fino, lo cual es beneficio para los procesos de purificación.(
Raja Ghosh, 2006)

El equipo consta de un cilindro horizontal o vertical llamado cámara de molienda, para generar
el movimiento del contenido que se encuentra en la cámara hay un agitador sobre el que se
monta un sistema de discos, en este se ingresa cierta cantidad de perlas de vidrio que son
los activos de la molienda, en la figura 5 se muestra un esquema típico de un “bead
mill”.(Armando Tejeda Mansir, 2011).

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 Figura 5. Esquema de un típico molino de bolas (bead mill)

La biomasa que viene del proceso de centrifugado se introduce por uno de los extremos de
la cámara de molienda. El agitador produce el movimiento necesario de la masa
celular(biomasa) y las perlas de vidrio, adicionalmente los discos presentan perforaciones
cubiertas con membranas que permiten el paso del material celular pero no el de las perlas.
El proceso de homogeneización en bead mill produce una cantidad importante de calor,
motivo por el cual mediante la chaqueta de enfriamiento se puede hacer un control de la
temperatura. (Roger G. Harrison, 2015)

Para el dimensionamiento de la operación, con un flujo de alimento de 30000 kg/batch

presenta una eficiencia del 99% para un tiempo de operación de 600 minutos, por el tamaño
del batch precedente del reactor y de la centrífuga la corriente se dividió en dos, y de cada
una de estas se pueden recuperar 13000 kg/batch de PHB extracelular y aproximadamente
192 kg/batch permanece dentro de la célula y el excedente de masa se compone por los
residuos celulares, durante esta operación la temperatura se controla para mantenerla a
18°C. La correlación que rige para un molino de perlas operado en modo por lotes es:

𝑙𝑛(1 − 𝑅) = −𝑘𝑡

Donde R es el grado de rompimiento, k es una constante que depende de la temperatura de

operación para este caso 18°C es la temperatura.

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 2.3. Extracción
Para los procesos de absorción de PHAs se suelen utilizar solventes como el cloroformo, el
diclorometano y el dicloroetano a temperatura ambiente, los cuales suelen ser bastante
efectivos y presentan altos niveles de recuperación y pureza debido a su selectividad pues
únicamente recuperan el polímero y algunas impurezas de la célula. La suspensión tarda
entre 12 y 24 horas, y generalmente se requieren cantidades muy grandes de solvente, cerca
de 20 ml por cada gramo de biomasa que se va a suspender (Koller et al., 2013). Después
de la aplicación de este solvente, la solubilidad de los PHAs se reduce aplicando un “anti-
solvente”, por lo general alcoholes de bajo peso molecular (principalmente etanol y metanol),
haciendo que los polímeros precipiten y sea más fácil recuperarlos. De igual manera, se
requieren cantidades de “antisolvente” bastante elevadas, cerca de 10 L por cada libro de
solvente extractor. La solubilidad de la mezcla también puede ser reducida y lograr la
precipitación mediante la reducción de la temperatura hasta 4°C o menos.

Figura 6. Esquema de un proceso convencional de extracción de PHB

El uso del cloroformo y otros solventes halogenados presenta varias desventajas, como su
alta toxicidad para los seres humanos y su impacto negativo sobre el medio ambiente, por lo
que, en la actualidad, gran parte de la investigación se centra en encontrar mejores
alternativas a estos solventes (Ramos, 2019). En la Tabla 1 se muestran algunos solventes
usados para la extracción de poli-3-hidroxibutirato, según la revisión hecha por Ramos (2019).

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 Tabla 1. Solventes usados para la extracción de poli-3-hidroxibutirato (P3HB)
Solvente Microorganismo Recuperación (%) Temperatura de operación
(°C)
Acetato de Butilo R. eutropha 41 50
Ácido Acético C. necátor 37 100
Carbonato de Etileno C. necátor 98 -
Anisol B. sacchari 97 120
Ciclohexanona B. sacchari 93 130
Heptano R. eutropha 99 90

Para la extracción de PHBs, específicamente para el P3HB, se han estudiado métodos de

extracción basados en el uso de hexano, o de 2- propanol, mostrando resultados muy
prometedores pues estos solventes pueden ser utilizados a temperaturas medias (50 °C), y
permite recuperar un polímero de alta pureza 97% (Furrer et al., 2007). El hexano es una
excelente opción ya que las partículas desprendidas de la lisis celular son casi insolubles en
él, y, por el contrario, los PHBs tienen gran afinidad con este solvente.

2.4. Secado

Luego de la extracción se obtiene una mezcla líquida de PHB y el solvente, por lo cual es
necesario separar el producto de interés mediante secado. En este caso en específico se
aprovecha el hecho de que el solvente es altamente volátil y se emplea un secado por
aspersión o spray, el cual es una opción atractiva económicamente debido a que presenta
altas eficiencias y es fácilmente escalable. Para este proceso se emplea una corriente
gaseosa, normalmente aire, a altas temperaturas que extraen el solvente de la mezcla y luego
de esto se condensa para poder ser recirculado al proceso de extracción. Debido a que el
proceso es batch, el alimento proveniente de la extracción se almacena en un tanque,
después del cual se suele usar un filtro para eliminar algún tipo de residuo no deseado y
posterior a este una bomba, la cual va a elevar la mezcla hasta el atomizador del tambor
secador. El solvente es arrastrado por una corriente de aire caliente que posteriormente se
suele pasar por un ciclón para recuperar algún residuo sólido.

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 Figura 7. Esquema de un secador atomizador (spray dryer)

Para establecer las condiciones del aire de secado se requiere realizar balances de masa y
energía y conocer las propiedades fisicoquímicas del solvente. La selección del atomizador
se hace teniendo en cuenta principalmente las propiedades físicas de la mezcla líquida, como
viscosidad y densidad, y los flujos se establecen con el balance de masa del proceso y la
cabeza de presión disponible para el proceso. A continuación, se presentan algunas de las
especificaciones y condiciones de operación para este proceso.

Tabla 2. Condiciones de operación para el secado

Especificación Valor Unidades
Temperatura de entrada del aire de 80 °C
secado
Temperatura de salida del aire de 65 °C
secado
Humedad del aire de secado 0.005
Flujo de aire de secado 3.2 m/s
Temperatura de ebullición del 61.2 °C
Cloroformo
Presion de operacion 69 atm
Eficiencia térmica 48%

3. Costos
Finalmente se calculan los costos de los equipos que se plantearon para utilizar en la
purificación del producto. Los costos se calcularon según las fórmulas que se encuentran en
el libro del Towler:

𝐶 = 𝑎 + 𝑏 ∗ 𝑆𝑛

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En donde a y b son constantes para cada tipo de equipo, S es la unidad de medida en
referencia como variable de diseño en cada uno de los casos, y n es un factor exponencial
que depende del tipo de equipo y sus diferentes variaciones (por modelo, material, geometría,
etc. Los resultados se muestran a continuación:
Tabla 3. Costos de equipos
Equipos Cantidad Costo 2010 ($ USD) Costo 2019 ($ USD)
Centrífuga decantadora 1 $ 315,000 $ 347,300
Molino 2 $ 92,000 $ 101,434
Tanque de extracción 1 $ 114,000 $ 125,690
Secador Spray-dryer 1 $ 78,000 $ 85,998

El costo total de la zona de purificación del PHB sería de aproximadamente $660,000 USD.

4. Conclusiones
Los PHBs son una alternativa prometedora para reemplazar el plástico y conformar una
industria fuerte y sustentable a futuro, sin embargo, aún requiere de mucha investigación,
sobre todo en las etapas de separación y purificación.

El rompimiento celular es una operación unitaria de gran importancia industrial, ya que con
esta se logra extraer PHB que se encuentra en la célula, hay diferentes técnicas para lograrlo,
se seleccionó el molino de bolas para hacer el rompimiento celular por su bajo costo y
eficiencia sobre la operación.

Para el proceso de extracción con solventes, a pesar de contar con altas eficiencias, estas
aún son replicables únicamente a escala de laboratorio, pues industrialmente, la demanda de
químicos y sus altos niveles de toxicidad son un obstáculo tanto económico, como ambiental.
Varios solventes de menor impacto han sido investigados, sin embargo, todavía no existe una
promesa de escalabilidad sólida al respecto.

Dentro de los bioplásticos que son escasamente producidos a nivel industrial se encuentra el
PHB, debido a que su costo de producción es muy alto a comparación con otro tipo de
bioplásticos. Es por esta razón que se hace necesario encontrar el proceso de producción
más eficiente y con un óptimo en costos, especialmente en el área de la purificación.

Se seleccionó el proceso de secado por aspersión debido a la facilidad de escalabilidad, la

alta eficiencia de la operación y a la capacidad de recuperar el solvente usado en la
extracción. También este proceso presenta tiempos de operación más bajos y la capacidad
de realizarse de manera continua,

11
 Bibliografía

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González-Contreras, M., Anaya-Reza, O., Sales-Cruz, M., & Lopez-Arenas, T. (2015).

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310). https://doi.org/10.1016/B978-0-444-63578-5.50046-3

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Engineering in Life Sciences, 13(6), 549–562. https://doi.org/10.1002/elsc.201300021

Koller, M., Niebelschütz, H., & Braunegg, G. (2015).Extraction of short-chain-length poly-[(R)-

hydroxyalkanoates] (scl-PHA) by the ‘‘anti-solvent’’acetone under elevated temperature and
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12
Noda, I. (1999). PROCESS FOR RECOVERING POLYHYDROXYALKANOATES USING
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Raja Ghosh (2006). PRINCIPLES OF BIOSEPARATIONS ENGINEERING. Londres: World

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Ramos, A. F. (2019). Extracción, purificación y modificación de un biopolímero del tipo poli

(3-hidroxibutirato) obtenido de la fermentación de ácidos grasos con B. cepacia. Universidad
Nacional de Colombia.

Roger G. Harrison, P. W. (2015). BIOSEPARATIONS SCIENCE AND ENGINEERING. New

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444-64046-8.00163-4

13
 Anexos
Anexo 1. Métodos más usados para la recuperación y purificación de PHAs. Adaptado de (Koller et al., 2013).

¿Adecuado para
Demanda de Demanda de Rendimientos de Pureza del
Método Clase escalado
Tiempo Químicos recuperación Producto
industrial?
Extracción con cloroformo I Media Alta No Altos Alta
Método “Agroferm” basado en
I Media Media Sí Medios Alta
carbonatos
Extracción de
Método “PHB/ISA” usando alcoholes I Alta solventes Sí Altos Baja/Media
disponible
Extracción con esteres de ácido
I Media / Alta Alta Sí Bajos / Medios Media
láctico
Extracción GBL I Media Alta No Bajos Media
Extracción con ciclohexanona I Media Alta Sí Medios Media
Media (Solvente No (únicamente a
Acetona a elevadas temperaturas y
I Baja fácilmente escala de Altos Alta
presiones
recuperable) laboratorio)
Investigación
Líquidos iónicos I Baja Alta Medios Media
requerida
Digestión del material no polimérico
de las células usando cocteles de II Baja Alta Sí Altos Baja
enzimas (Proceso ICI)
Digestión alcalina combinada con
II Media Media Sí Altos Alta
tratamiento SDS
Digestión con hipoclorito del material
II Media Media No Medios Medios
no polimérico de las células
Desintegración mecánica de las Sí (La ultra
células ricas en PHAs sonicación es
III Baja No Medios Baja
(homogenización a alta presión, adecuada para
ultra-sonicación, molinos de perlas) bacterias frágiles)
Destrucción de celular en medios
hipotónicos IV Baja No Sí Altos Media
(Sólo para bacterias osmófilas)

14
 Anexo 2. Métodos de ruptura celular (Roger G. Harrison, 2015)

Método Técnica Principio Estrés Costo

Choque Rotura osmótica de la Suave Barato

osmótico membrana

Pared celular digerida

Digestión
causando ruptura Suave Costoso
enzimática

Los detergentes
Solubilización Suave Moderado
solubilizan la membrana

Químico

Disolución de El solvente orgánico se

lípidos disuelve en la Moderado Económico
membrana,
desestabiliza

El solvente orgánico se
disuelve en la
Tratamiento
membrana, Fuerte Económico
Alcalino
desestabiliza

Homogenizació Células picadas en

Moderado Moderado
n licuadora o cortadas

Células rotas por

Molienda Moderado Económico
trituración con abrasivos

Células rotas por

Ultrasonido Fuerte Costoso
cavitación sónica
Mecánicos
Células rotas por
Celda de cizallamiento cuando se
Fuerte Moderado
presión fuerzan a pasar a través
de un orificio pequeño

Células aplastadas entre

Molino de bolas bolas o perlas de vidrio Fuerte Económico
o acero

15
Anexo 3. Diagrama de operaciones

16