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Bases de Microbiologia Industrial
Bases de Microbiologia Industrial
Aminocidos _____________________________________________________________ 30
Glutamato _____________________________________________________________________30
Otros aminocidos _______________________________________________________________30
Vitaminas________________________________________________________________ 30
Riboflavina (B2)_________________________________________________________________31
Cobalamina (B12)________________________________________________________________31
cido ascrbico (C)______________________________________________________________31
GENERALIDADES DE LA MICROBIOLOGA
Microorganismo es todo organismo vivo que no es visible a simple vista: bacterias, algas, hongos,
protozoos,...
Se subdividen segn los tipos de estructura celular:
Procariotas, que son las bacterias y arqueas (consideradas como bacterias simples y, por tanto,
las menos evolucionadas).
Eucariotas, que son hongos, levaduras, protozoos, algas,...
Los virus merecen una mencin aparte dentro de esta clasificacin, ya que no pueden ser considerados
seres vivos en el sentido estricto (no poseen metabolismo, son incapaces de autorreplicarse, etc.)
La principal diferencia entre procariotas y eucariotas es que los procariotas, a diferencia de los eucariotas,
no poseen ninguna estructura nucleada que agrupe el material gentico en una sola regin, sino que ste
se halla disperso por el citoplasma bacteriano.
Adems, los procariotas poseen una menor informacin gentica y carecen de estructuras membranosas
que delimiten orgnulos internos de funciones diferenciadas. As, constan de una nica macroestructura
que desempea mltiples funciones.
Pared bacteriana
Su principal funcin es dar rigidez a la bacteria, previniendo efectos osmticos adversos, como la
plasmlisis, adems de preservarla de otras condiciones adversas. De hecho, una bacteria sin pared slo
puede sobrevivir en un medio isotnico con su citoplasma.
La pared celular es una estructura tridimensional basada en la repeticin de dos azcares (Nacetilglucosamida y N-acetilmurano NAG y NAM-), as como de un tetrapptido.
La principal diferenciacin aplicada a las bacterias atiende al tipo de pared bacteriana: grampositivas o
gramnegativas, o sea, sensibles o no a la tincin de Gram. En bacterias grampositivas, la estructura
repetitiva es de gran tamao y compacta, con pocas molculas de otro tipo embebidas en la pared;
mientras que en las gramnegativas es de tamao notablemente menor, poseen muchas molculas
embebidas y presentan un denominado espacio periplsmico entre la pared bacteriana y la membrana
plasmtica. As, una pared gramnegativa posee ms funciones que una grampositiva.
Endospora bacteriana
Ciertas bacterias poseen dos estados en su ciclo vital: como clula vegetativa y como espora, no dndose
ambos estados simultneamente. El proceso de esporulacin (formacin de la espora) es bastante largo (810 horas). A diferencia con otras formas de vida, la espora no es un medio de reproduccin, sino un
cambio fisiolgico.
Las caractersticas ms importantes de la espora son:
- Presentan una mayor resistencia a condiciones extremas: altas temperaturas, compuestos
qumicos, desecacin, radiaciones,...
- Presenta una actividad metablica casi nula.
- Presenta una serie de capas de recubrimiento caractersticas: el exosporio, 3 cubiertas y el
crtex. El exosporio y las cubiertas son proteicas, mientras que la otra es similar a la pared
celular.
- Prcticamente carece de agua, lo que le dota de resistencia trmica.
- Contienen cido dipicolnico, que asociado a iones calcio, permite mantener la estructura.
Esta sustancia es tpica de la endospora, ya que no se presenta en la clula vegetativa.
Metabolismo microbiano
La diversidad en cuanto a rutas metablicas entre las bacterias es enorme. As, pueden obtener la energa
de la luz (fototrofos) o de reacciones de ciertos compuestos qumicos (littrofos o quimiotrofos).
Asimismo, la fuente de carbono puede ser compuestos inorgnicos (autotrofos) u orgnicos
(heterotrofos). De este modo, los microorganismos pueden ser fotoautotrofos, quimioautotrofos o
quimioheterotrofos (son muy raros los microorganismos fotoheterotrofos).
Existe un metabolismo muy importante, el del nitrgeno, ya que son ciertas bacterias los nicos
organismos capaces de efectuar las reacciones que permiten fijar el nitrgeno atmosfrico y convertirlo en
las formas en que pueden asimilarlo el resto de los seres vivos.
La forma de obtencin del ATP por parte de los microorganismos es muy variada:
los organismos fotosintticos obtienen el ATP por fosforilacin, bien sea cclica
para organismos que no producen oxgeno, o acclica para organismos que s lo
producen.
Los organismos respiratorios obtienen el ATP por fosforilacin oxidativa, ya sean
aerobios o anaerobios.
Los organismos fermentativos obtienen el ATP a travs de fosforilaciones a nivel
de sustrato, por procesos oxidativos parciales.
Crecimiento microbiano
Se refiere al aumento del nmero de clulas de un cultivo.
Este proceso se caracteriza por el tiempo de generacin, que es el necesario para que la poblacin se
duplique. Este tiempo es variable segn la especie y los factores ambientales y nutricionales.
Independientemente del tiempo de generacin, la curva de crecimiento microbiano es siempre la misma,
dividindose en cuatro fases:
- Fase Lag, de retardo o de adaptacin. Representa un tiempo variable dependiente de las
condiciones del medio, y representa el tiempo que tardan los microorganismos en adaptarse
a las condiciones del medio. Cuando finaliza, la clula est preparada para desarrollar su
actividad y multiplicarse utilizando los recursos que el medio le ofrece.
- Fase de crecimiento. Consiste en el periodo de mayor actividad de las clulas, as como una
explosin demogrfica debido a las condiciones favorables del medio.
- Fase estacionaria. Debido a la acumulacin de excreciones txicas al medio por la gran
poblacin microbiana, as como el paulatino descenso de los nutrientes del mismo, las
clulas van muriendo, hasta alcanzarse un equilibrio entre el nmero de clulas que nacen y
las que mueren, por lo que el nmero de clulas permanece aproximadamente constante.
- Fase de muerte. El equilibrio entre clulas que nacen y clulas que mueren se rompe, de
modo que va disminuyendo el nmero total de clulas hasta alcanzar un mnimo
aproximadamente constante.
Saccharomyces
cerevisiae
Kluyveromyces fragilis
Actinomicetos
(similares a hongos por
morfologa y tipo de
crecimiento, presentes
en suelos)
Bacillus
Clostridium (organismos
estrictamente
anaerobios)
Antibiticos
Enzimas
Inhibidores
enzimticos
Corinebacterias,
utilizadas en industria
quesera y en sntesis de
potenciadores de sabor
Antibiticos peptdicos
Bacillus thuringiensis
Enzimas proteasas
Insecticidas
Sntesis de disolventes
Degradacin
de
sustratos complejos en
combinacin con otras
especies
de
microorganismos
MANTENIMIENTO
Y
CONSERVACIN
MICROORGANISMOS INDUSTRIALES
DE
Dado el alto coste de obtencin de las cepas industriales, se requiere la adopcin de tcnicas de
conservacin apropiadas que permitan preservar sus propiedades. No existe un nico mtodo, ya que cada
especie presenta sus preferencias de conservacin:
Subcultivo. Consiste en el paso de un inculo de un cultivo agotado en otro fresco (preferentemente,
slido). No es la ms apropiada para la industria, ya que presenta tres grandes inconvenientes:
El tiempo de persistencia de las clulas es, por lo general, bastante bajo. Este tiempo puede aumentarse
por refrigeracin a unos 4 C.
Se puede producir contaminacin fcilmente, dada la alta frecuencia de manipulacin.
Debido a la manipulacin continua, aumenta el riesgo de variabilidad gentica en la cepa.
Desecacin. Consiste en la eliminacin de agua del microorganismo, reduciendo as el metabolismo. Para
evitar que el proceso de desecacin dae las clulas, se aaden compuestos protectores. El proceso se
produce a temperatura ambiente una vez aadidos los protectores. Finalizado el proceso, se sella el
cultivo y se conserva en refrigeracin. Un mtodo alternativo es el del L-secado. Consiste en pequeos
discos gelatinosos que se impregnan con el cultivo lquido y se secan por un proceso activo (temperatura,
etc.). Al igual que antes, al finalizar el proceso, se sella y se lleva a refrigeracin.
Congelacin. Segn la tcnica empleada, la temperatura de congelacin vara. Se usan congeladores
normales (unos 30 C), industriales (-70 C) o nitrgeno lquido (hasta 200 C). Cuanto ms baja sea la
temperatura, mejor es la conservacin, pero tambin es mayor el coste. Para evitar la formacin de
cristales en el interior de las clulas, que pueden producir daos en sus estructuras, se usan dos tcnicas:
Adicin de compuestos protectores, como dimetilsulfxido.
Congelacin lenta, de modo que se formen primero los cristales en el medio exterior. Esto provocar la
prdida de agua de la clula por smosis. El inconveniente de este mtodo es el gran aumento de la
concentracin de sales en el proceso de descongelacin, a la que las clulas pueden ser muy vulnerables.
Para evitarlo, se usan medios de congelacin poco salinos.
Liofilizacin. Se hace una congelacin previa antes de pasar al liofilizador. En l, el agua se sublimar
por bajada de presin y el cultivo microbiano queda en el seno de una matriz porosa protectora (que por
lo general es leche descremada o sacarosa). Debido a las caractersticas del mtodo, se sella a vaco. Este
mtodo, junto con la congelacin, es el ms valorado, ya que permite unos tiempos de conservacin
bastante altos.
Subcultivo
Desecacin
Congelacin
Liofilizacin
Escasa supervivencia y Saccharomyces - Para levaduras, 50 % - Para levaduras, hay una
de supervivencia y alta supervivencia aceptable
alta
variabilidad cerevisiae.
y
alta
estabilidad
gentica.
- Para esporas de mohos estabilidad gentica.
y
tambin - Para mohos, se usa la gentica.
congelacin
en - Para esporas de mohos,
actinomicetos,
da buenos resultados
suspensiones en tierra, nitrgeno lquido.
Actinomicetos
y
arena estril o silica gel. - En bacterias lcticas, - En tierra o arena da buenos resultados en clostridios.
lquido
estril, da resultados nitrgeno
de
una
intermedios
en precedida
actinomicetos
y desecacin.
Actinomicetos
y
clostridios.
clostridios
10
la clula)
2.
Las clulas producen dos tipos de compuestos qumicos: metabolitos primarios y secundarios. Los
primarios son aquellos que la clula produce porque son imprescindibles para efectuar sus funciones
vitales; mientras que los secundarios son aquellos que la clula produce y no son vitales para que ella
realice sus funciones vitales, aunque en determinadas condiciones la sntesis de estas sustancias le
confiera algn beneficio.
En general, los productos de inters industrial son metabolitos secundarios, por lo que es importante
conocer los detalles del proceso de sntesis, para poder mejorarlo y aumentar la produccin. Las
principales caractersticas de los metabolitos secundarios son:
Suelen ser producidos en exclusiva por un nmero limitado de especies, por lo general
relacionadas entre s.
Las condiciones ambientales determinan mucho su sntesis.
En general, las rutas metablicas que los sintetizan estn reguladas por mecanismos distintos a
los de los metabolitos primarios y son, por lo general, ms complejos.
Algunos metabolitos secundarios se obtienen como una familia de sustancias estrechamente
relacionadas.
La teora ms aceptada sobre el origen del metabolismo secundario es la de Zhner. Segn sta, el
metabolismo secundario es un campo de pruebas de la clula. As, cuando una determinada sustancia
producida por dicho metabolismo resulta beneficiosa para la clula, se mantiene la informacin gentica
que define la ruta metablica que la origina, dando lugar a una nueva caracterstica de la especie. De este
modo, cuando un metabolito secundario otorga a una clula una gran ventaja sobre otras que no lo tienen,
ste pasa a ser un metabolito primario.
11
12
C.E. =
ATP + 0.5ADP
AMP + ADP + ATP
13
Para evitar desechar cepas que puedan presentar caractersticas interesantes, es aconsejable efectuar
tratamientos cclicos con distintos agentes mutgenos sobre las cepas mutadas.
Para hacer una seleccin de mutantes selectiva, podemos adicionar antibiticos o antimetabolitos a los
que slo la cepa mutada es resistente, por lo que slo ellas permanecen activas en el cultivo.
Para el caso de auxotrofos se aplica la tcnica de los dobles cultivos: uno en medio completo (contiene
todas las sustancias que pueda requerir la clula) y otro en medio mnimo, que no contiene los nutrientes
necesarios para las especies auxotrofas (por lo que stas no se desarrollarn).
La tcnica consiste en que las colonias de microorganismos estn en el mismo sitio en ambos medios;
para ello, se usa un taco de madera de igual forma que el fondo del cultivo y recubierto de terciopelo. Una
vez efectuado el cultivo sobre el medio completo, se impresiona ste en el terciopelo y se inocula ste en
el medio mnimo. Por comparacin tras la incubacin de ambos cultivos, localizamos en el medio
completo las colonias que no se han desarrollado en el mnimo, y que son las colonias auxotrofas. Para
reducir el nmero de pruebas de este proceso y aumentar el nmero de auxotrofos de partida, es frecuente
tratar primero la muestra con penicilina en medio mnimo. Como la penicilina acta slo sobre clulas en
crecimiento, las cepas auxotrofas (que no se desarrollarn en medio mnimo) no se vern afectadas,
mientras que el resto morirn.
Otra forma de detectar los mutantes deseados es alterar algn carcter enzimtico que origine una
propiedad fcilmente observable, lo que se consigue a travs de mecanismos genticos.
La ingeniera gentica aplicada a la microbiologa industrial permite introducir secuencias especficas de
DNA en una clula. Para ello, las etapas a seguir son:
Obtener la secuencia gentica a clonar. Esto se realiza por accin de las endonucleasas de
restriccin. Una vez delimitado el gen a clonar en el genoma, se hacen coincidir las zonas
adyacentes al gen con las secuencias de corte de las distintas enzimas de restriccin, eligiendo la
que mejor se ajusta al proceso.
Insercin del gen en un plsmido, un fago o un csmido (plsmido que contiene los genes que
codifican la sntesis de la cpsida de un fago ). stos sern los vehculos a travs de los cuales
se introducir el DNA en la clula.
Introduccin en la clula hospedadora. Para facilitar este proceso, se aumentar la competencia
por presencia de iones calcio y/o electroporacin.
Seleccin de mutantes.
Las tcnicas de ingeniera gentica tienen diversas aplicaciones, sobre todo en biotecnologa (prevencin
de enfermedades gnicas, obtencin de medicamentos,...) y proteccin ambiental (degradacin de
productos xenobiticos, etc.).
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Melazas
Extracto de
malta
Almidn y
dextrinas
Desechos de
madera
e
industrias
papeleras
Aceites
vegetales
Alcoholes
de
bajo
nmero de
carbonos
15
Alcanos de
12 a 18
carbonos
16
2.
3.
Biorreactores
Estn fabricados en materiales capaces de mantener las condiciones ptimas de presin, temperatura, etc.,
que en la mayora de los casos es acero inoxidable. Los criterios bsicos de diseo de un biorreactor son:
Caractersticas bioqumicas del cultivo a realizar.
Caractersticas hidrodinmicas del reactor: es necesario minimizar los fenmenos de
transporte en el reactor, para evitar gradientes de nutrientes, temperatura,...
Cintica de crecimiento y produccin del microorganismo.
Asegurar la estabilidad gentica del microorganismo, impidiendo que se estimulen
mutaciones.
Esterilizacin lo ms barata posible, hasta el punto de que, a pesar de su importancia,
y segn el proceso, se llega a obviar.
Control de las condiciones ambientales.
Diseo y modo de operacin.
Potencial para el escalado creciente de produccin.
Inclusin de sistemas de oxigenacin adecuados a las exigencias del
microorganismo.
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Tipos de biorreactores
1.
2.
3.
4.
5.
18
Escalado
Es el proceso de conversin de un proceso productivo de pequea escala a escala industrial. Las
condiciones de produccin a pequea escala no son, por lo general, extrapolables a la escala industrial,
debido a que la fluidodinmica del sistema, los procesos de transporte y el comportamiento celular son
diferentes. Por ello, se aplica un proceso gradual, manteniendo una velocidad de transferencia de oxgeno
constante, as como la potencia consumida por unidad de volumen, al tiempo que el tamao del cultivo se
va aumentando en proporcin 1:10.
Tcnicas de esterilizacin
Del medio de cultivo
Se usan preferentemente mtodos trmicos y filtros.
1.- Esterilizacin discontinua. Consiste en la inyeccin de vapor a la camisa del fermentador o los
serpentines internos, o bien la aplicacin directa del vapor sobre el medio de cultivo. Requiere grandes
periodos de tiempo, es de alto coste (si no se puede reaprovechar el agua) y altera la composicin del
medio.
2.- Esterilizacin continua. Consiste en la obtencin de altas temperaturas (140 oC) durante 120 s por
inyeccin de vapor (intentando evitar su dilucin) o cambiadores de calor (evitando la formacin de
depsitos de sales insolubles). Sus ventajas son que permiten reutilizar el agua y no alteran la
composicin del medio.
Proceso fermentativo
1.
2.
3.
4.
Preservacin del inculo por medio de prcticas de conservacin que permitan que las cepas
mantengan su capacidad biosinttica. stas son, principalmente, el almacenamiento a baja
temperatura (poco til), congelacin (aunque rpida, no es viable) o liofilizacin (consigue un
mayor nmero de clulas viables al usar agentes protectores).
Crecimiento del inculo, que consiste en la recuperacin de las clulas conservadas en
condiciones adecuadas para su aplicacin industrial.
Precultivo, que consiste en obtener la cantidad suficiente de clulas para poder usar como
inculo en la fase de produccin. Si esto no se consigue, se producen menores concentraciones
de producto y unos mayores tiempos de retardo de los esperados. Estas cantidades son entre 0.1
y 3% para bacterias, de 5 a 10% para hongos y actinomicetos y de 1 a 500000 esporas por litro
de cultivo.
Produccin. Se coloca el inculo en contacto con los nutrientes que le servirn de sustrato y las
condiciones en las que crecer, estando stas en los rangos:
Temperaturas para mesfilos (de 20 a 45 oC) y para sicrfilos (de 5 a 20 oC).
Entre 0.25 y 1 vvm de O2.
Sobrepresin (de 0.2 a 0.5 atm sobre la atmosfrica), lo que evita las contaminaciones.
Agitacin en funcin del tamao del fermentador, ya que permite homogeneizar el
medio de cultivo, pero si es demasiado alta puede inhibir el crecimiento bacteriano.
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Centrifugacin
Es ms verstil, ya que se puede aplicar a ms casos y condiciones que la filtracin. Se usan sobre todo en
panadera y produccin de protena unicelular (SCP). Los tipos de centrfuga ms usados son:
De filtro de criba. En ellas, las suspensiones se proyectan sobre un material filtrante,
lo que impulsa la filtracin a travs de la membrana.
De cmara y disco, que separan las partculas en funcin de su gravedad especfica.
Como las clulas son las ms pesadas, se depositan en la parte inferior. La gran
ventaja de este tipo de centrfugas es que, adems, permiten efectuar separaciones
lquido-lquido en funcin de la densidad.
Rotura celular
El proceso a seguir es:
1. Se diluyen las muestras en tampn.
2. Se efecta entonces la rotura:
a. Tcnicas mecnicas (molienda). Consiste en molinos de cuchillo, bolas,...
20
b.
Aislamiento preliminar
Se aplican tres mtodos principalmente:
1.
Extraccin. Permite separar el producto en funcin de su solubilidad en diferentes
lquidos inmiscibles. Dichos disolventes han de ser econmicos, de baja volatilidad
y viscosidad, no corrosivos y no alteren el producto.
2.
Precipitacin. Consiste en la adicin de alguna sustancia en alta concentracin o
modificar las condiciones, de modo que se provoca la precipitacin de compuestos.
As, por ejemplo, los polisacridos pueden precipitar por adicin de alcohol, las
protenas por alteracin del pH ms all del punto isoelctrico y en ocasiones por
temperatura, aunque puede provocar alteraciones sobre el producto.
3.
Adsorcin. Se usa para metabolitos hidroflicos (con capacidad para ionizarse).
Consiste en hacer pasar el caldo de fermentacin por resinas de intercambio inico.
Purificacin
Se utilizan principalmente tcnicas cromatogrficas, que aunque son caras, son muy eficientes e inertes
para los compuestos. Los tipos de cromatografa usados son:
De exclusin molecular.
De afinidad (adsorcin selectiva).
De inmunoadsorcin, que usa el carcter antignico de los productos y una matriz de
anticuerpos especficos, lo que le permite una altsima selectividad.
De isoelectroenfoque, que consiste en modificacin del pH hasta alcanzar el punto
isoelctrico de la protena, que al no disociarse se fija a la fase estacionaria de la
columna cromatogrfica.
Secado
Es el punto final de la purificacin en la mayora de los casos. En el proceso no debe haber prdida de
actividad. El caso ms extendido es el uso de calor hmedo, para posteriormente desprender la humedad
por una corriente de gas. En el caso de que se requiera la presencia de clulas en el producto, se usa la
liofilizacin.
21
Rendimiento
Las prdidas producidas en la purificacin del producto dependen del nmero de etapas de la purificacin
y la sensibilidad del producto frente a este tratamiento. Aun as, el coste del proceso de purificacin suele
ascender al 20% del total.
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PRODUCCIN DE ALCOHOLES
Dado que los residuos agrcolas son buenos sustratos para producir etanol (excepto el destinado a la
alimentacin), los pases con grandes superficies cultivadas son los principales productores de etanol por
va microbiolgica (EE.UU., Canad, Brasil,...). A nivel industrial, se sintetiza por levaduras y bacterias:
Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces fragilis o Zymomonas mobilis.
Especficamente, la sntesis de etanol requiere de medios anaerobios, pero el crecimiento de las levaduras
productoras necesita del oxgeno. Por ello, es necesario efectuar primero el crecimiento de las clulas en
un medio aerobio para luego introducirlas en otro anaerobio y as comenzar la produccin.
Bioqumicamente, la sntesis se produce por accin de la enzima alcohol-deshidrogenasa sobre el
acetaldehdo obtenido por reaccin del piruvato. Tericamente, el rendimiento de la reaccin es elevado:
0.5 g de alcohol por gramo de glucosa, con una efectividad del 91-95%.
El etanol puede inhibir el crecimiento celular cuando se alcanzan concentraciones del 5%, o incluso el
proceso de sntesis (cuando la concentracin es del 10%). Para evitarlo, se puede efectuar destilacin a
vaco o limitar los nutrientes.
Fermentacin
Se dan principalmente procesos discontinuos en tres fases:
1. Desarrollo celular: se somete el cultivo a fuerte oxigenacin durante 12-24 horas.
2. Sntesis. Se reduce la oxigenacin, lo que produce la reduccin del crecimiento celular y el inicio
de la produccin durante 24-36 h. Como consecuencia del proceso, se libera calor, que puede
elevar la temperatura hasta los 40 oC.
3. Se detiene la sntesis por aumento de la oxigenacin, lo que vuelve a aumentar el crecimiento
celular. Se puede prolongar hasta 72 horas.
Las condiciones de operacin en este proceso son:
30-35 oC
pH = 4.5
3% de inculo
600m3
Aumentos de temperatura y cantidad de inculo, pueden reducir el tiempo de fermentacin
hasta lo 2 o 3 das.
Debido a las condiciones anaerbicas, se puede producir contaminacin con bacterias lcticas,
en particular, Leuconostoc, que sintetiza dextrano (un polisacrido), lo que aumenta la
viscosidad y genera gradientes en el seno del caldo de fermentacin.
Tambin se han desarrollado procesos en continuo (en desarrollo), siendo las condiciones en este caso:
Se produce un mayor control de la temperatura y el pH.
Se usan cantidades limitantes de glucosa (< 1g/l).
Condiciones de microaerofilia (0.25-0.5 l/g de clulas).
En estas condiciones, el proceso de produccin continuo dura unas 18 horas.
23
Purificacin
El alcohol se obtiene por destilacin. Primero, han de extraerse las clulas por sedimentacin
(generalmente) o centrifugacin y se elimina el CO2 tras etapas de lavado. Entonces, se destila el caldo en
columnas de rectificacin.
Produccin de acetona/butanol
Aunque descubierta por Pasteur, fue Weizmann poco antes de la 1 G.M. quien estableci el proceso de
produccin microbiano, al estudiar la produccin de butadieno para obtener caucho sinttico. Durante la
guerra, se usa esta acetona de origen microbiano en la produccin de TNT, aunque tras la 2 GM se
prefiere la sntesis qumica.
Los microorganismos usados para la sntesis de butanol generan tambin acetona, por lo que se obtienen
ambos compuestos conjuntamente. Las especies usadas son todas del gnero Clostridium, caracterizadas
por ser:
Bacterias anaerobias estrictas.
Generan esporas.
Sintetizan butanol y otro compuesto (convertible en etanol), dependiendo de la especie usada:
C. acetobutylicum Butanol + acetona
C. butylicum
Butanol + isopropanol
C. butyricum
Butrico + actico
En la actualidad, la produccin se efecta con C. Butylicum en fermentadores de 12 90 m3, usando CO2,
que adems de proporcionar agitacin, desplaza al oxgeno, generando condiciones de anaerobiosis. El
proceso es de 36 horas de duracin, y se produce en tres fases:
1. Formacin de cidos actico y butrico (18 h), lo que causa una drstica bajada del pH hasta 5.2.
2. Conversin de dichos cidos en acetona y butanol (18 horas), con lo que sube el pH.
3. Finalizacin del crecimiento y estabilizacin del pH (5.8): otras 18 horas.
Se extraen los productos por destilacin fraccionada.
Se pueden producir contaminaciones por bacterias lcticas, en especial Lactobacillus (lo que supone una
disminucin del rendimiento) o por bacterifagos, que son ms complicadas de tratar, ya que matan las
clulas y detienen el proceso.
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cido ctrico
Es el ms importante, ya que slo se obtiene por va microbiolgica y adems es el ms utilizado.
Su sabor agradable y elevada solubilidad hacen que tenga diversidad de usos:
Alimentacin: como acidulante, aromatizante, antioxidante y saborizante para productos dulces,
como caramelos, helados, zumos,...
Farmacia: como preservante de la sangre, debido a sus propiedades antioxidantes.
Cosmtica, como integrante de diferentes preparados.
Metalurgia, ya que muchos metales se extraen ms fcilmente como citratos.
Detergentes, como sustituto de los polifosfatos. Esto es importante porque los polifosfatos son
causantes de la eutrofizacin de las aguas dulces. La abundancia de N y/o P favorece un altsimo
desarrollo de las algas, lo que causa una disminucin enorme de oxgeno en el agua y, por tanto,
la muerte de los organismos de dichas aguas. Al producirse la descomposicin anaerobia de toda
esa materia orgnica, los ros y lagos se acaban convirtiendo en pantanos. Por ello, se prefiere el
cido ctrico (aunque ms caro).
Qumica, como antiespumante y en la industria textil.
Los procesos de fermentacin se llevan a cabo con cepas modificadas genticamente para aumentar la
produccin y disminucin de compuestos colaterales, como los cidos oxlico y glucnico. Las especies
usadas son:
Aspergillus niger usando como sustrato sacarosa o melazas, hidrolizados de almidn, sueros
lcteos, etc. Las condiciones de este sustrato son:
o Limitacin del fosfato.
o Ausencia de cationes metlicos, ya que stos pueden limitar la produccin al superar los
niveles traza. Esto se consigue por adicin de ferrocianatos (con lo que los cationes
precipitan como complejos) o usando resinas de intercambio inico.
Candida lipolytica con parafina como sustrato, aunque est poco implantado.
Medio nutricional
La fuente de carbono ha de tener una concentracin de azcares del 15-25%. Para ello, se usan
almidn de patata o hidrolizados de almidn (ambos requieren hidrlisis enzimtica), jarabe de
caa de azcar, melazas o sacarosa.
Minerales en las concentraciones adecuadas, sobre todo hierro, requiriendo unas condiciones
diferentes para la fase de crecimiento y la de produccin. Si no se dan las concentraciones
adecuadas, la morfologa del hongo no ser la ptima y la produccin se ver afectada.
25
Procesos de produccin
Procesos en superficie (o koji, del japons).
Son ms sencillos, pero requieren ms mano de obra.
Como sustrato slido:
Trigo u otro cereal
Se dispone en capas delgadas (3-5 cm) donde se colocan las esporas
Se mantiene a pH entre 4 y 5 y 28 oC durante 90 horas.
Se procede a la extraccin del cido ctrico mediante 5 volmenes de agua caliente.
Como sustrato lquido:
Se usan sacarosa o melazas, complementadas con H2KPO4, MgSO4 y ZnSO4.
Se inoculan las bandejas con esporas (2-5 107 esporas / m2)
Se procede a incubacin a 30 oC con pH entre 4 y 5.
Es necesario aportar suficiente oxgeno como para desplazar al CO2 producido, ya que ste
inhibe la produccin por encima del 10% de concentracin.
Se mantiene la etapa de crecimiento durante 30 horas, y la de produccin entre 8 y 14 das.
Purificacin
Se efecta en pasos:
Se retira el micelio del hongo. Como el cido ctrico estar atrapado en el micelio (debido a la
alta densidad de ste), se efecta un lavado previo a la precipitacin o filtracin para retirar
dicho micelio.
Adicin de cationes calcio a pH 3, lo que hace que precipite oxalato clcico.
Extraccin del cido ctrico a pH neutro con temperaturas entre 70 y 90 oC, lo que hace que se
pierdan los componentes voltiles interferentes.
Al adicionar ahora calcio, precipita citrato clcico.
El citrato se purifica mediante resinas de intercambio inico, lo que permite obtener el cido
ctrico.
cido actico
Es el principal componente del vinagre. Es sintetizado por dos gneros de bacterias:
Acetobacter aceti
Acetobacter
Son cepas superoxidantes, capaces de oxidar el producto hasta CO2 y agua.
pasteureanus
Acetobacter peroxidans
Gluconovbacter
Finalizan el proceso con la obtencin del cido actico, sin una oxidacin
oxydans
mayor.
26
Produccin
Mtodo Orleans
Es el ms tradicional. Son los ms costosos, y su produccin es baja.
Mtodo alemn
Basado en procesos tradicionales, su produccin es poco satisfactoria.
Procesos sumergidos
En este caso, son menos interesantes que para el cido ctrico.
Requiere unos fuertes niveles de oxigenacin, lo que constituye su principal problema, ya que el proceso
se detiene si el nivel de oxgeno es inferior al 5%.
Presenta la ventaja de que con un coste mnimo obtiene una elevada eficacia.
Las clulas se eliminan por filtracin. Posteriormente, se aade ferrocianuro potsico, lo que permite
sustraer los subproductos responsables de colorear el cido actico.
cido lctico
Fue el primer cido obtenido por fermentacin. Se usa principalmente en alimentacin (acidulante y
saborizante, adems de hallarse de forma natural en productos lcteos) y en farmacia.
Segn las caractersticas metablicas de los microorganismos productores, se distingue entre
homofermentadores (slo producen cido lctico, por lo que son preferibles) y heterofermentadores
(producen, adems, otras sustancias). Las especies utilizadas preferentemente son:
Lactobacillus
Usa residuos lquidos de la industria papelera (licor de coccin del sulfito) como
pentosus
sustrato.
Lactobacillus
Usa sueros o suero desproteinizado procedentes de la industria lctea, sobre todo
bulgaricus
de la produccin de quesos.
Se usan procesos continuos, discontinuos y con clulas inmovilizadas, manteniendo altas temperaturas
(45-50 oC) y pH entre 5.5 y 6.5.
cido mlico
Se usa en alimentacin como acidulante.
Se obtiene por sntesis qumica (preferentemente, ya que es ms barata) o enzimtica (tradicionalmente, a
partir de extractos de zumo de manzana, dada su riqueza en este compuesto) a partir de cido fumrico.
La sntesis microbiolgica usa:
Aspergillus
Con glucosa, sales y carbonato clcico.
Brevibacterium ammoniagenes
Brevibacterium flavum
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cido fumrico
Debido a su baja higroscopicidad (tendencia a captar agua), se usa en bebidas deshidratadas y
revestimientos de golosinas (evita la entrada de agua a alimentos), como colorante (fija el color de la
carne), emulsificante, suavizante, acidulante y saborizante. Paralelamente, su baja solubilidad limita otras
aplicaciones (lo que se evita por adicin de compuestos que aumentan su solubilidad).
Se obtiene a partir del hongo Rhyzopus oryzae usando como sustratos derivados de soja o arroz.
28
Nucletidos
Por s mismos no confieren sabor, pero incrementan los sabores presentes (lo que se conoce como efecto
umami). Sin embargo, no todos presentan esta cualidad, sino slo los derivados de la purina (las
pirimidnicas no tienen esta propiedad), en concreto, el IMP (inosin-mono-fosfato) y el GMP
(guanosin-mono-fosfato).
29
Adicin de un inhibidor ante la esporulacin (como cido butrico o reduccin del oxgeno, que
evita un rpido agotamiento de los nutrientes, por lo que evita la esporulacin).
Sntesis directa
Es el menos usado.
Se usan mutantes de Bacillus subtilis en los que se ha aumentado el nmero de copias del gen que
codifica la enzima del paso limitante de la ruta de produccin de guanosina (con lo que aumenta el
nmero de enzimas del proceso y la produccin aumenta).
Se obtiene guanosina, lista para el consumo tras fosforilarla.
Aminocidos
Se usan sobre todo en alimentacin (potenciadores de sabor, antioxidantes, edulcorantes, complemento
nutricional,...) y en algunos productos cosmticos y farmacuticos. Todos se pueden obtener por va
microbiana, destacando glutamato, metionina y lisina.
Glutamato
Se usa mucho como potenciador de sabor para la comida china.
El proceso de produccin es:
1. Se usa Corynebacterium glutamicum (el ms usado) y Brevibacterium flavum, usando glucosa y
sacarosa como fuentes de carbono.
2. En el caso del Corynebacterium, es incapaz de completar el ciclo de Krebs, lo que supone que
muchos de los productos que de l se derivan siguen rutas alternativas y, como consecuencia, se
acumula cido -cetoglutrico. Debido a su similitud estructural, se transforma fcilmente en
cido glutmico, precursor del glutamato.
3. Se facilita la excrecin de cido glutmico por adicin de biotina al medio, con lo que se puede
extraer el c. glutmico y purificar.
4. El proceso se realiza en discontinuo, a 38 oC y pH de 7.8. Con una duracin de 30-35 horas se
obtienen del orden de 100 g/L.
Otros aminocidos
Aspartato
Alanina
Cistena
Fenilalanina combinado
con aspartato
Triptfano combinado con
histidina
Metionina
Lisina
Treonina
Triptfano
Otros
Se obtienen:
A partir de hidrolizados de protenas, aunque poco rentable, la nica va para obtener cistena,
cistina, leucina, asparagina y tirosina.
Por sntesis qumica, que requiere de separacin enzimtica posterior, ya que se obtienen
mezclas racmicas y slo una de las formas es la activa.
Biotransformacin enzimtica.
Fermentacin microbiana con mutantes de Corynebacterium, Brevibacterium y Esclerychia coli,
para permitirles degradar sustratos baratos (como glucosa, hidrolizados de almidn o
n-parafinas) y mejorar la produccin.
Vitaminas
Hay muchos microorganismos capaces de sintetizar todas las vitaminas necesarias para los humanos, pero
slo B2 y B12 son de sntesis microbiana rentable frente a la sntesis qumica.
30
El organismo las utiliza principalmente como coenzimas en la mayora de los casos, por lo que son
indispensables para muchos procesos.
Riboflavina (B2)
Interviene en reacciones metablicas redox y del metabolismo energtico. Se encuentra en lcteos,
verduras, hgado y suplementos nutricionales. Se emplea en suplementacin de derivados de cereales y
productos dietticos.
Hay tres vas de sntesis:
1. Sntesis qumica completa.
2. Sntesis mixta (el ms usado), usando Bacillus subtilis como productor de ribosa, que se
transforma qumicamente en riboflavina.
3. Sntesis microbiana.
a. Con Ashbya gossypii (hongo), usando aceite de soja o maz complementados con
glicina y purinas (estimulan la produccin). Es la ms tradicional, con rendimientos de
6-7 g/L.
b. Con otros microorganismos (Candida flareri, Saccharomyces cerevisiae o Bacillus
subtilis), se adaptan a una fuente de carbono concreta, con lo que los procesos se hacen
muy especficos, y la produccin es muy variable (de 21 g/L de Candida a 4.5 g/L de
Bacillus).
Cobalamina (B12)
Slo se obtiene por va microbiana, ya que la sntesis qumica es muy compleja y poco rentable.
Qumicamente, presenta una estructura central fija, pero los sustituyentes constituyen varias formas, de
las que la activa es la cianocobalamina.
1. Propionibacterium.
a. Primera fase: anaerbica. En ella se sintetizan los precursores de la vitamina.
b. Segunda fase: aerbica. En ella se sintetiza la cobalamina siempre que se aplique el
adecuado tratamiento trmico en presencia de cianuro.
2. Pseudomonas denitrificans. Se obtiene el mayor rendimiento. Sin embargo, est sujeto a
patentes, por lo que no es rentable.
3. Bacillus megaterium, en experimentacin.
31
PRODUCCIN DE ENZIMAS
El inters por los procesos enzimticos se debe a varios factores:
No necesitan condiciones especiales de temperatura y presin (los valores ambientales).
Requieren menos energa (tecnologas sencillas y ahorro al no necesitar altas temperaturas ni
presiones).
Presentan una mayor especificidad y con mayores rendimientos frente a estereoisomera,
ausencia de compuestos colaterales, etc.
Permiten el trabajo en sistemas no acuosos.
Son de bajon impacto ambiental, ya que no generan ni compuestos colaterales ni residuos de
riesgo.
Se clasifican en:
Oxidorreductasas Efectan procesos redox y transferencias de O, H o electrones.
Transferasas
Transfieren grupos qumicos.
Hidrolasas
Hidrolizan molculas.
Liasas
Rompen enlaces en procesos no redox ni hidrolticos.
Isomerasas
Interconvierten ismeros.
Ligasas
Forman enlaces mediante el gasto de ATP.
Pueden tener distintos orgenes, pero es preferible el microbiano, ya que su produccin es mayor y ms
econmica, y con menos problemas de purificacin.
Los principales usos de las enzimas son: detergentes, lcteos, procesado del almidn, textil, papel,
investigacin biotecnolgica (enzimas de restriccin, clonacin,...).
Produccin comercial
Seleccin de cepas
Los mtodos de seleccin utilizados deben permitir diferenciar las especies capaces de producir una
enzima basndose en determinados medios de cultivo, dando informacin sobre las caractersticas de la
enzima (condiciones ptimas de funcionamiento: temperatura, pH,...) y sus niveles de produccin.
El grupo microbiano ms usado al respecto son los microorganismos termfilos o termorresistentes, que
necesitan altas temperaturas para crecer (70-90 oC), por lo que sus enzimas son de gran inters, ya que
pueden ejercer su funcin a estas temperaturas. Dentro de este grupo, es preferible buscar
microorganismos de calidad GRAS, que son las autorizadas legalmente para utilizarse en alimentacin y
medicina, dada su inocuidad para el organismo humano y el medioambiente.
Hay que tener en cuenta la mejora y adecuacin de las caractersticas del proceso de produccin al
microorganismo, sobre todo si la enzima producida no es de origen microbiano. Por ello, es necesario
recurrir a manipulacin gentica para favorecer los inductores de la produccin (se prefiere intentar que la
modificacin consiga obtener la enzima sin necesidad de presencia de inductores) e inhibir la produccin
de otras enzimas y procesos.
Procesos de produccin
Sobre sustrato slido (procesos Koji)
No son muy apropiados, salvo para procesos con hongos, ya que el control de temperatura, aireacin y
humedad es difcil, adems de que son muy propensos a las contaminaciones.
Se usa como sustrato salvado, paja de trigo, cscara de arroz, pulpa de caa de azcar o bagazo (medios
slidos o semislidos porosos y sin agua libre), dispuestos en bandejas.
Procesos en biorreactores
Son ms fciles de automatizar al tratarse de medios lquidos y, por lo tanto, ser ms fcil el controlar las
variables ambientales.
Se usan sustratos de bajo coste, como melazas, cereales, hidrolizados de almidn o lactosa, junto con soja,
cacahuete, hidrolizados de levadura o geletina complementados con P, S y Ca.
Para el control del pH, se adiciona algn tamponador, por lo general, solucin de fosfato (que a la vez
acta como suplemento de fsforo).
32
Aplicaciones
Detergentes.
Se usan proteasas principalmente, paa aumentar la eficacia del detergente para atacar manchas con
componentes proteicos.
Otras ventajas son la disminucin de los costes energticos (al requerir temperaturas menores) y su
carcter biodegradable, a diferencia de los fosfatos, por lo que minimizan el impacto ambiental.
Este uso de las enzimas comenz en los 50, aunque actualmente las utilizadas son ms resistentes a la
temperatura y el pH.
Las enzimas ms utilizadas son:
Subtilisina (una proteasa), procedente de Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis.
Amilasas.
Lipasas.
Produccin de quesos.
La enzima utilizada es la renina o quimosina.
Produce la proteolisis parcial de la leche, que conduce a la formacin de la cuajada y, posteriormente, al
queso.
Anteriormente, se obtena a partir del rumen de los rumiantes, con uan produccin bastante baja.
Los microorganismos permiten obtener enzimas de las mismas caractersticas que las animales,
obtenindose principalmente de hongos (Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusilis, Aspergillus nidulans o
Aspergillus niger), debido a su mayor facilidad para la manipulacin gentica. Actualmente, se estudian
procesos usando Esclerichia coli o Kluyveromyces lactis.
Se utilizan tambin distintas lipasas, que al degradar cidos grasos generan compuestos que otorgan sabor
a los lcteos.
Industria papelera.
Se usan para degradar los principales componentes de la madera, lo que permite reducir el impacto
ambiental de esta actividad (se generan residuos muy contaminantes) y mejoran la textura y aspecto del
papel. Se usan celulasas, hemicelulasas, pectinasas y lipasas.
Elaboracin de zumos.
Se trata de pectinasas, que actan sobre la pectina, uno de los principales componentes de la materia
vegetal, clarificando y licuando el zumo.
Se obtiene de Aspergillus niger y Penicillium.
Elaboracin de vinos.
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Industria textil
Sntesis orgnica.
Se usan para la sntesis de compuestos quirales puros, al obtener productos estereoqumicamente puros,
evitando la separacin de mezclas quirales y compuestos colaterales, y aumentando la pureza. Tambin
son muy tiles para la obtencin de productos farmacuticos.
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Antibiticos -lactmicos
Se caracterizan por contener un anillo de cido -lactmico, lo que los dota de actividad frente a bacterias
gram+ por inhibicin de la sntesis de la pared celular.
Sus principales caractersticas son:
Presentan una baja toxicidad para el organismo, por lo que los efectos secundarios son
inexistentes o muy leves.
Presentan dos problemas acusados:
1. En condiciones cidas no son efectivos.
2. Ciertas especies son capaces de sintetizar -lactamasas, por lo que son resistentes a este tipo
de antibiticos, ya que hidrolizan el anillo, la estructura activa principal de la molcula.
Penicilinas
Se obtienen de cepas de Penicillium y Aspergillus.
En funcin de su origen, se clasifican en:
1. Naturales, obtenidas directamente de la fermentacin microbiana.
2. Biosintticas, caracterizadas por el aumento de la actividad por medio de la incorporacin de
grupos qumicos al anillo central. Se obtienen aadiendo precursores del grupo a incorporar al
antibitico en el caldo de fermentacin.
3. Semisintticos, obtenidos por modificacin qumica del producto microbiano.
El proceso de sntesis ms destacado es el de las penicilinas G y V, obtenidos por va biosinttica, pero
diferenciados por la cadena lateral (cido fenilactico para G y cido fenoxiactico para V). Las
caractersticas del proceso (discontinuo) son:
1. Los volmenes de los biorreactores son pequeos, debido a que los microorganismos demandan
una gran cantidad de oxgeno en la fase de crecimiento; los valores ms usuales son un volumen
de 40 a 200 m3 con una oxigenacin de 0.5-1 vvm.
2. Recuperacin del Penicillium chrysogenum esporulado y liofilizado. Esta etapa es importante, ya
que de ella depende el compactamiento o no del micelio: si el micelio es compacto, disminuyen
los rendimientos en la fase de produccin.
3. Fermentacin, realizada en dos etapas:
35
a.
b.
4.
Cefalosporinas
Se descubrieron primero en Cephalosporium acremonium, aunque se obtienen tambin de Paecilomyces,
Streptomyces (el ms usado actualmente) y Nocardia.
Su principal caracterstica es, adems de su similitud con las penicilinas, su amplio espectro de
aplicacin.
En la actualidad, se usan derivados semisintticos de 2 y 3 generacin (una o dos modificaciones
qumicas, respectivamente, lo que permite aumentar la eficiencia o recuperar una actividad perdida por
aparicin de resistencias).
El proceso de produccin es:
El sustrato es glucosa y sacarosa, lquidos de maceracin del maz, extracto de carne
(complemento) y acetato amnico.
La fermentacin se produce a 24-28 oC y pH 7, con una fase de crecimiento de 90 horas con alta
aireacin, seguida de otra de produccin de 90-160 horas.
Nuevos productos
Se obtienen por adicin de compuestos que confieren proteccin al anillo frente a las enzimas,
manteniendo su actividad o reforzndola.
Destaca el cido clavulnico, usado con la amoxicilina. Aunque no es un antibitico en s, este compuesto
confiere resistencia a la degradacin. Se obtiene de Streptomyces clavuligerus.
Antibiticos peptdicos
Destacan los lineales y cclicos, sintetizados mayoritariamente por Bacillus y Streptomyces. Sus
caractersticas son:
Son activos frente a gram- por inhibicin de la sntesis de la pared celular.
Son txicos, por lo que su uso est restringido a casos concretos.
Destaca la bacitracina, producida por Bacillus licheniformis en procesos de superficie antiguamente,
aunque ahora se sigue un proceso ms complejo.
1. Cultivo de mantenimiento a 37 oC durante 18-24 horas.
2. Recuperacin de las esporas. Se usan recipientes de 1 L con slo 200 mL de medio lquido
(peptonas), debido al alto requerimiento de oxgeno necesario (aunque es una especie anaerobia
facultativa, o sea, capaz de crecer anaerobiamente). Se aplica durante 6 horas.
3. Prefermentacin. Se pasa a reactores de 800 L con una fuerte agitacin (proporciona
oxigenacin) con el mismo medio de cultivo.
4. Segunda prefermentacin. Se efecta en reactores de 3000 L, pero se usa como sustrato sacarosa,
harina de soja, sulfato amnico y carbonato clcico.
5. Fermentacin con el mismo sustrato anterior (con el doble de glucosa), en fermentadores de 90
m3 durante 30 horas.
Antibiticos carbohidratados
Los ms destacados son los aminoglucosdicos (oligosacridos unidos a aminosacridos). Se caracterizan
por:
Son muy comunes: estreptomicina, ...
Son especficamente activos frente a gram- por inhibicin de la sntesis proteica.
Son txicos, y pueden causar daos en rin y odo.
Desarrollan resistencias rpidamente.
El proceso de produccin es:
1. Se usa glucosa complementada con almidn o dextrinas y harina de soja, adems de
NaCl, Co, Zn o Mn, segn el antibitico.
2. Fermentadores de 150 m3, 0.5-1 vvm oxgeno, 28-30 oC y pH neutro durante 4-7 das.
36
3.
Antibiticos macroldicos
Contienen un anillo lactnico, lo que les da su carcter hidrofbico y bsico.
Son eficaces frente a gram+ y son poco txicos, pero son poco demandados porque se prefieren las
penicilinas de tercera generacin. Actan inhibiendo la sntesis de protenas. Destaca la eritromicina.
El proceso de produccin es:
El sustrato es glucosa, harina de soja, sulfato amnico, cloruro sdico y carbonato clcico,
aunque se puede emplear extracto de levadura, aceites o almidn.
El proceso es aerobio y sumergido, usando Streptomyces erithreus.
Por lo general, se efectan a pH bsico durante 3-7 das a temperaturas de 25-28 oC, con
excepcin de la eritromicina (33 oC).
Tetraciclinas
El primero descubierto fue la tetraciclina, descubierta de Streptomyces viridofaciens, aunque actualmente
se usa ms S. aureofaciens.
Por lo general, se obtienen por procesos biosintticos. Son activos frente a gram+ y gram- por inhibicin
de la sntesis proteica.
La produccin se efecta en fermentadores agitados de 150 m3 con glucosa o almidn y alta oxigenacin
(1vvm) durante las primeras 12 horas. Es importante limitar el fosfato en el medio, ya que acta como
inhibidor.
Antibiticos aromticos
Cloranfenicol
Es muy activo y eficaz, pero puede causar lesiones en la mdula sea, por lo que su uso est restringido.
Tiene un amplio espectro de aplicacin, debido a que detiene el proceso de traduccin (sntesis de
protenas). Sus usos ms destacados son:
Tratamiento de las salmonelosis.
En biologa molecular, ya que detiene la traduccin, pero no la replicacin del DNA.
En medios de cultivo para hongos, evitando el crecimiento de las bacterias.
Griseofulvina
Es uno de los pocos antibiticos efectivos contra hongos.
Se obtiene de Penicillium patulum por procesos aerbicos. El sustrato es rico en glucosa, con nitrato de
sodio y cloruro potsico. El proceso se efecta durante 7-9 das, a 25 oC, pH neutro y 1 vvm.
37
Mtodos de produccin
Sistemas tradicionales
Consisten en la obtencin de la vacuna mediante el cultivo del patgeno.
1. Vacunas vivas. Son clulas con la capacidad patgena atenuada, obtenidas bien por conservacin
durante largo tiempo o por cultivo en medios no apropiados. Presentan un importante
inconveniente: el acceso del patgeno al organismo puede desencadenar la enfermedad si, por
alguna razn, recupera su capacidad patgena, debido a que el sistema inmunitario del
hospedador sea demasiado sensible o el microorganismo est poco atenuado.
2. Vacunas muertas. Consisten en clulas muertas o protenas txicas (toxoides) desactivadas. El
principal inconveniente es la posibilidad de aparicin de reacciones (ms leves que en vacunas
vivas), debidas a:
a. Posibilidad de que no todas las clulas estn muertas.
b. La enfermedad no sea causada por la actividad de las clulas, sino por alguna sustancia
de su estructura, como por ejemplo los lipopolisacridos de las bacterias gram-.
Los principales problemas de estos sistemas son:
No todos los patgenos se pueden cultivar en laboratorio.
En las vacunas vivas existe el riesgo de la reversin (recuperacin de la capacidad patgena), lo
que ocasiona la enfermedad. sta tambin puede producirse si se introducen otras especies
patgenas (sobre todo en vacunas vricas, donde la contaminacin es muy difcil de controlar) o
el hospedador presenta inmunodepresin (sistema inmune dbil).
En las vacunas muertas, las endotoxinas de las bacterias gram- pueden provocar reacciones.
38
En ocasiones, generan una escasa respuesta inmune, corta y dbil, por lo que no
constituyen una vacuna efectiva. Para paliar este efecto:
i. Aumento de la concentracin de antgenos, mediante el uso de adyuvantes.
stos son sustancias portadoras del antgeno (en general, un adyuvante es una
sustancia que favorece la accin de otro compuesto). En muchos casos, se usan
estructuras del propio patgeno, ya que la unin entre ambas estructuras est
ms favorecida.
ii. Tembin se puede aportar el antgeno usando un virus o bacteria atenuados.
Esto favorece la multiplicacin del antgeno, generando una mayor respuesta
inmune. Sin embargo, vuelve a presentar el inconveniente del trabajo con
patgenos vivos.
Vacunas peptdicas
Por lo general, el sistema inmune reconoce a los patgenos no por una estructura completa, sino por una
pequea secuencia peptdica, denominada eptope. stas, como secuencia de aminocidos, se puede
construir, lo que permitira generar la respuesta inmune sin necesidad de usar el antgeno completo, con la
evidente ventaja de la reduccin de los efectos secundarios por la inoculacin de la vacuna.
Presenta, sin embargo, varios problemas:
La identificacin del eptope es compleja. Para ello, se usan hibridomas de linfocitos B, que
reconocen el antgeno e inician la sntesis de anticuerpos monoclonales. Tembin se recurren a
perfiles de hidrofobicidad, que permiten situar la protena en una zona especfica de la clula.
Es difcil producirlos en grandes cantidades. Por un lado, es difcil que los eptopes adquieran la
estructura necesaria sin interaccionar con otras estructuras (con las que interacciona al ser
sintetizado por una clula); y por otro lado, al ser una secuencia pequea, es muy sensible frente
a las mutaciones, dada la alta especificidad que se requiere para su identificacin.
39
PRODUCCIN MICROBIOLGICA
TERAPUTICAS
DE
PROTENAS
Las protenas teraputicas son producidas de forma natural por el organismo humano, pero ciertas
enfermedades pueden disminuir la produccin de dichas protenas, generando enfermedades.
Anteriormente, se usaban protenas obtenidas de origen animal, con dos problemas principalmente: su
produccin era escasa (lo que las encareca) y suelen provocar efectos secundarios.
Con las tcnicas de ADN recombinante, se posibilit la produccin microbiolgica de protenas humanas
(ya que los microorganismos no las producen naturalmente, se tuvo que introducir en su genoma la
maquinaria necesaria para ello, proveniente de informacin gentica humana). Las protenas obtenidas, al
basarse en genes humanos, carecen de efectos secundarios (es prcticamente idntica a la protena
humana) y se puede obtener en altas cantidades.
DNAsa
Es una enzima capaz de degradar el ADN, usada en el tratamiento de la fibrosis qustica.
La fibrosis qusteca es una enfermedad gentica degenerativa, de diferente gravedad segn el rgano
afectado. En los pulmones, el caso ms grave, genera el aumento de la produccin de mucosidad,
taponando las vas respiratorias y favoreciendo las infecciones. Ante ello, el sistema inmune responde
destruyendo las clulas, con la consiguiente liberacin de su ADN. ste aumenta la viscosidad y densidad
de la mucosidad, crendose un crculo vicioso.
La DNAsa acta hidrolizando el ADN liberado, disminuyendo la viscosidad de la mucosidad. Los
preparados comerciales son muy especficos y eficaces (pulmozina de Genentech), pero sometidos a
patentes farmacuticas.
Eritropoietina (EPO)
Es una hormona glicoproteica producida en el rin que interviene en la produccin de eritrocitos. Su
carencia genera la cada del nmero de glbulos rojos, y su abuso un aumento (problemas de dopping
en deportistas).
Se obtiene mediante tcnicsa de ADN recombinante, y se usa para tratar enfermedades que causen
inmunodepresin (cncer, sida,...) anemias e infecciones renales que afecten a su produccin.
Somatropina
Es la hormona del crecimiento, producida en la glndula pituitaria y usada en casos de enanismo por
dficit hormonal y en enfermedades relacionadas con el envejecimiento.
Inicialmente se obtena de cadveres humanos, pero presentaba problemas:
Se requeran muchos cadveres para tratar un solo paciente, lo que disparaba el precio.
Hay indicios de asociacin con la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (encefalopata
espongiforme), provocada por priones y asociada al canibalismo (ingesta de cerebro humano,
con la consiguiente transmisin del prin).
Posteriormente, se obtuvo de animales, pero se obtenan bajas eficacias.
Usando recombinacin gentica sobre Escherichia Coli (por transformacin con un plsmido que
contiene el ADN de la hormona), se obtiene una somatropina idntica a la humana (slo se diferencian en
un aminocido). Actualmente se investiga su produccin con otras especies (Bacillus subtilis y
Pseudomonas aeruginosa).
Insulina
Es una hormona polipeptdica producida por el pncreas, relacionada con el metabolismo de la glucosa y
la regulacin de su cantidad en sangre. Su carencia origina la diabetes.
Tradicionalmente, se usaba isulina de origen animal (ovejas y cerdos), pero daban problemas de
abastecimiento (baja produccin) y de pureza (por lo que solan producir efectos secundarios).
Fue el primer producto obtenido por mtodos de ADN recomibnante aprobado para su empleo
teraputico, en 1981. El proceso de produccin consiste en la produccin de las subunidades proteicas que
la componen por hospedadores diferentes (Saccharomyces cerevisiae, E. coli) y de forma separada. Tras
la sntesis, se combinan qumicamente las subcadenas independientes.
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Interfern
Es una protena de la familia de las citoquininas que itnerviene en la regulacin de la respuesta inmune.
En humanos, existen tres tipos diferentes, usados en enfermedades que debilitan el sistema inmunitario:
1. El interfern , usado en casos de hepatitis C y tumores, como leucemia, cncer renal,
melanoma, mieloma mltiple o tumor genital. Se obtiene de E. coli.
2. Los interferones y , usados en procesos de esclerosis mltiple (el primero) y otros cnceres (el
segundo). Se obtienen tambin de Escherichia coli.
Interleuquinas
Son un grupo de citoquininas formado por 15 sustancias distintas. Slo una est comercializada
actualmente, y se usa en el tratamiento de carcinomas renales.
Colgeno
Se usa en suturas quirrgicas. Actualmente, se obtiene de cadveres y vacas, aunque hay procesos en
investigacin de produccin con levaduras (Pichia augusta y Pichia pastoris) que eviten los riesgos de
contaminacin por virus y priones.
41
Sustratos
Aunque son muchos los sustratos que pueden utilizarse, se elige el ms adecuado en funcin del precio de
stos.
1. Residuos de otras industrias (residuos agrcolas, sueros lcteos o la industria maderera), con el
fin de reducir los problemas ambientales que podran causar.
2. Alcoholes, muy empleados al principio, pero despus fue ms rentable usar residuos de otras
industrias. Actualmente, se est recuperando.
A la hora de buscar nuevos sustratos, se siguen los siguientes criterios:
Baratos
Alta produccin de biomasa.
Su degradacin exija poca oxigenacin.
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Procesos de produccin
Existe una gran cantidad de plantas piloto, pero hay pocas plantas industriales, debido a que surgen
problemas de escalado por la diferencia de condiciones: requerimientos de oxgeno, aparicin de
gradientes trmicos y nutricionales, influencia del CO2 o la presin hidrulica.
El empleo de sustratos ms econmicos, mejora de la eficacia, incremento del valor nutricional del
producto, disminucin de los costes de purificacin o acoplado de procesos secundarios pueden contribuir
a la extensin de estos procesos.
En general, las etapas de estos procesos son:
1. Aplicacin de tratamientos previos al sustrato para su adecuacin.
2. Es uno de los pocos procesos que operan en continuo, manteniendo las condiciones lmite
(ptimas) de crecimiento del organismo. Los biorreactores utilizados son pequeos.
3. Se efectan procesos de filtracin y purificacin, seguidos de tratamientos para reducir el
contenido en cidos nucleicos (choque trmico y adicin de RNAsa) y acondicionamiento
(pasteurizacin, deshidratacin y empaquetado).
Los procesos ms comunes son:
- Parte de suero lcteo con Kluyveromyces lactis
o K. marxianus.
- Se debe ajustar el contenido en lactosa del
sustrato a 34 g/l, y complementarlo con
La SCP obtenida se destina a consumo minerales.
Bel
- Las condiciones de fermentacin son:
humano y animal
Biorreactores de 22 m3.
38 oC y pH de 3.5.
Aireacin de 1700 m3/h.
- Se produce entre 0.45 y 0.55 g por g de lactosa.
- Desarrollado en Suecia, utiliza Candida utilis
(levadura).
Se utiliza para disminuir los efectos - El sustrato contiene gran cantidad de almidn,
ambientales de los residuos de patata, que que Candida no puede degradar, lo que exige un
Symba
necesitan un alto consumo de oxgeno tratamiento previo con Saccharomyces fibuligera.
para degradarse.
- Se obtiene un producto con un 45 % de
protenas y el poder contaminante del sustrato se
reduce un 90 %.
El primer proceso con hongos, partiendo - Destinado a la produccin de piensos, el
Finlands
de residuos de papeleras y madereras.
producto contiene un 59 % de protenas.
- Los microorganismos metangenos son slo
Importante en Noruega, donde los unas pocas especies, principalmente arqueas. El
Con
campos de gas del Mar del Norte ms utilizado es Methylococcus capsulatus.
metano
proporcionan el sustrato.
- El producto contiene un 70 % de protenas, y se
destina a la produccin de piensos.
- Se efecta en condiciones aspticas y con
nutrientes de grado alimentario.
- Se emplea Fusarium venenatum por sus
El primero aprobado para el consumo
caractersticas de estructura y textura.
humano, el nico destino de este
ICI
- El inconveniente del Fusarium es su alto
producto.
contenido en ARN, lo que obliga a la realizacin
de un tratamiento de eliminacin a 64 oC durante
30 minutos.
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2.
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