Livro Tecnologia Enzimatica - Maria Alice (2) - Convertido - Pt.es

TECNOLOGÍA
ENZIMÁTICO
MARIA ALICE ZARUR COELHO ANDRÉA

MEDEIROS SALGADO BERNARDO DIAS
RIBEIRO
Índice
1
CAPITULO 1 - INTRODUCCIÓN............................................................................... 7
1.1 - DEFINICIÓN ............................................................................................................. 7
1.2 - CALIFICACIONES .................................................................................................. 8
1.3 - MERCADO .............................................................................................................. 11
1.4 - PRINCIPALES TIPOS Y USOS INDUSTRIALES ............................................. 12
1.5 - INNOVACIONES INDUSTRIALES ..................................................................... 13
1.6 - REFERENCIAS ....................................................................................................... 15
CAPÍTULO 2 - CINÉTICA ENZIMÁTICO ........................................................ dieciséis
2.1 - ACCION ENZIMÁTICO........................................................................................ 17
2.2 - ESTRATEGIAS DE CATÁLISIS .......................................................................... 18
2.3 - MODELOS CINÉTICA .......................................................................................... 20
2.4 - FACTORES QUE INFLUYEN EN LAS REACCIONES ENZIMÁTICA ........ 28
2.5 - DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICO ...................................... 33
2.6 - REFERENCIAS ....................................................................................................... 38
CAPÍTULO 3 - PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS ........................... 39
3.1 - PASO DE OBTENER .............................................................................................. 40
3.2 - PASOS DE RECUPERACIÓN .............................................................................. 53
3.3 - PASOS DE PURIFICACIÓN ................................................................................. 62
3.4 - PASO DE FORMULACIÓN .................................................................................. 69
3.5 - REFERENCIAS ....................................................................................................... 70
CAPÍTULO 4 - ENZIMAS ACTIVOS FIJOS ............................................................. 72
4.1 - VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS ENZIMAS ACTIVOS FIJOS .......... 72
4.2 - ELECCIÓN DE MÉTODOS Y SOPORTE PARA INMOVILIZACION ......... 73
4.3 - EFECTOS CAUSADOS POR INMOVILIZACION ........................................... 80
4.4 - USOS DE LA ESCALA INDUSTRIAL ................................................................. 83
4.5 - REFERENCIAS ....................................................................................................... 86
CAPÍTULO 5 - REACTORES ENZIMÁTICA............................................................ 87
5.1 - TIPOS DE REACTORES ENZIMÁTICA ............................................................ 87
5.2 - CRITERIOS DE SELECCIÓN PARA REACTORES ........................................ 88
5.3 - CINÉTICA DE LOS REACTORES ENZIMÁTICA ........................................... 90
5.4 - REFERENCIAS ..................................................................................................... 100
CAPÍTULO 6 - INDUSTRIA DE Gustos ................................................................. 101
6.1 - CUERO ................................................................................................................... 101
6.2 - PASOS DE PROCESAMIENTO Y APLICACIÓN ENZIMÁTICO ............... 102
2
6.3 - REFERENCIAS ..................................................................................................... 104
CAPÍTULO 7 - INDUSTRIA TEXTIL ...................................................................... 105
7.1 - PASOS DE PROCESAMIENTO DE FIBRAS DE ALGODÓN ....................... 105
7.2 - SOLICITUD ENZIMÁTICO ............................................................................... 108
7.3 - REFERENCIAS ..................................................................................................... 112
CAPÍTULO 8 - INDUSTRIAS DEL PAPEL Y CELULOSA ..................................... 113
8.1 - PRODUCCIÓN DE PAPEL Y CELULOSA ...................................................... 113
8.2 - REVESTIMIENTO DE ROLES .......................................................................... 117
8.3 - RECICLAJE DE PAPEL ...................................................................................... 117
8.4 - DESTINO ............................................................................................................... 117
8.5 - TRATAMIENTO DE EFLUENTES ................................................................... 118
8.6 - REFERENCIAS ..................................................................................................... 119
CAPÍTULO 9 - HORNEANDO ............................................................................... 120
9.1 - EL ROL DE AMILASAS ...................................................................................... 120
9.2 - MANUFACTURA DE UN PAN ........................................................................... 121
9.3 - COMPLEMENTACIÓN DEL HARINA ............................................................ 122
9.4 - OTRAS APLICACIONES ENZIMÁTICA ......................................................... 123
9.5 - REFERENCIAS ..................................................................................................... 124
CAPÍTULO 10 - CERVECERÍA ............................................................................. 126
10.1 - LA CEBADA Y LA MALTA .............................................................................. 127
10.2 - ENZIMAS Y ENZIMAS DE MALTA INDUSTRIAL ..................................... 130
10.3 - PANORAMA........................................................................................................ 135
10.4 - REFERENCIAS ................................................................................................... 136
CAPÍTULO 11 - INDUSTRIA JUGO ...................................................................... 137
11.1 - MACERACIÓN Y LICUEFACCIÓN ............................................................... 138
11.2 - DIGESTIÓN DE PULPA .................................................................................... 138
11.3 - ACLARACIÓN DE JUGOS ............................................................................... 139
11.4 - ZUMOS DE CÍTRICOS ..................................................................................... 140
11.5 - REFERENCIAS ................................................................................................... 142
CAPÍTULO 12 - INDUSTRIA DE VINOS ............................................................... 143
12.1 - ELABORACIÓN EN ROJO............................................................................... 144
12.2 - ELABORACIÓN EN BLANCO......................................................................... 146
12.3 - REFERENCIAS ................................................................................................... 149
CAPÍTULO 13 - PRODUCCIÓN DE ALCOHOL .................................................... 150
3
13.1 - ALCOHOL EN BEBIDAS .................................................................................. 150
13.2 - ALCOHOL COMBUSTIBLE ............................................................................ 153
13.3 - REFERENCIAS ................................................................................................... 155
CAPÍTULO 14 - INDUSTRIA DE PRODUCTOS LÁCTEOS .................................. 157
14.1 - FABRICACIÓN QUESO .................................................................................... 157
14.2 - LECHE DESCONECTADO............................................................................... 161
14.3 - OTRAS APLICACIONES DE ENZIMAS EN PRODUCTOS LÁCTEOS ... 163
14.4 - REFERENCIAS ................................................................................................... 164
CAPÍTULO 15 - MODIFICACIÓN DE PROTEINAS............................................... 165
15.1 - PROTEASAS Y SUS APLICACIONES............................................................ 165
15.2 - PROTEÍNAS VEGETAL.................................................................................... 167
15.3 - PROTEÍNAS DE CARNE DE VACA ............................................................... 167
15.4 - PROTEÍNAS DE PESCADO ............................................................................. 169
15.5 - OTRAS APLICACIONES .................................................................................. 169
15.6 - REFERENCIAS ................................................................................................... 170
CAPÍTULO 16 - RACIONES ANIMALES ............................................................... 171
16.1 - SUSTITUTOS LECHE ....................................................................................... 171
16.2 - NUTRICIÓN DE PÁJAROS .............................................................................. 172
16.3 - NUTRICIÓN DE Cerdos .................................................................................... 173
16.4 - FACTORES IMPORTANTES EN EL USO DE ENZIMAS........................... 174
16.5 - REFERENCIAS ................................................................................................... 175
CAPÍTULO 17 - ACEITES Y GRASAS .................................................................. 176
17.1 - EXTRACCIÓN DE PETRÓLEO VEGETAL .................................................. 177
17.2 - REFINADO ACEITES........................................................................................ 187
17.3 - MODIFICACIÓN DE ACEITES Y GRASAS .................................................. 187
17.4 - REFERENCIAS ................................................................................................... 190
CAPÍTULO 18 - ENZIMAS EN ANÁLISIS ............................................................. 193
18.1 - ANALISIS CLINICO .......................................................................................... 193
18.2 - ANÁLISIS DE ALIMENTOS............................................................................. 195
18.3 - REFERENCIAS ................................................................................................... 197
CAPÍTULO 19 - PRODUCCIÓN DE DETERGENTES .......................................... 199
19.1 - TIPOS DE ENZIMAS UTILIZADAS EN DETERGENTES .......................... 200
19.2 - TIPOS DE DETERGENTES INDUSTRIAL .................................................... 204
19.3 - EVALUACIÓN DE LA EFICIENCIA ENZIMÁTICA EN LIMPIEZA ....... 206
4
19.4 - TENDENCIAS FUTURASrr! Indicador no ........ definido.
19.5 - LIMPIEZA MEMBRANAS................................................................................ 209
19.6 - REFERENCIAS ................................................................................................... 210
CAPÍTULO 20 - SENSORES ENZIMÁTICA .......................................................... 212
20.1 - APLICACIÓN DE SISTEMAS DE ANÁLISIS ENZIMAS ............................ 213
20.2 - REACTORES ANALÍTICA ............................................................................... 217
20.3 - SENSORES ENZIMÁTICA ............................................................................... 218
20.4 - REFERENCIAS ................................................................................................... 224
CAPÍTULO 21 - ENZIMAS EN INGENIERÍA GENÉTICA ...................................... 225
21.1 - INGENIERÍA GENÉTICA O TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE
225
21.2 - TÉCNICAS DE CLONACIÓN MOLECULAR ............................................... 227
21.3 - PLASMIDA, OBTENCIÓN DE GENES Y ENZIMAS DE RESTRICCIÓN 229
21.4 - ENZIMAS MODIFICADORAS DE ADN O ARN (PRODUCCIÓN HÍBRIDA)
234
21.5 - APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA Y GENÉTICA DEL ADN
RECOMBINANTE ........................................................................................................ 235
21.6 - PANORAMA FUTURO ...................................................................................... 239
21.7 - REFERENCIAS ................................................................................................... 241
CAPÍTULO 22 - ENZIMAS EN MEDICAMENTO ................................................... 243
22.1 - APLICACIONES FARMACÉUTICO .............................................................. 243
22.2 - TRATAMIENTOS TERAPÉUTICO ................................................................ 244
22.3 - REFERENCIAS ................................................................................................... 251
CAPÍTULO 23 - ENZIMAS EN MEDIO AMBIENTE ............................................... 253
23.1 - TRATAMIENTO BIOLÓGICO ........................................................................ 254
23.2 - TRATAMIENTO ENZIMÁTICO ..................................................................... 255
23.3 - REFERENCIAS ................................................................................................... 261
CAPÍTULO 24 - BIOCATÁLISIS EN MEDIOS NO ACUOSO ................................ 263
24.1 - DISOLVENTES ORGÁNICO............................................................................ 263
24.2 - FLUIDOS SUPERCRÍTICO .............................................................................. 272
24.3 - GASES DENSOS (GAS SÓLIDO) ..................................................................... 273
24.4 - LIQUIDOS IÓNICO ........................................................................................... 274
24.5 - MEZCLAS EUTÉTICAS (SÓLIDO-SÓLIDO) ............................................... 275
24.6 - REFERENCIAS ................................................................................................... 277
CAPÍTULO 25 - OTROS APLICACIONES ............................................................ 279
5
25.1 - REFINADO AZÚCAR ........................................................................................ 279
25.2 - RESUMEN ORGANICO .................................................................................... 280
25.3 - MODIFICACIÓN ENZIMÁTICA DE MATERIALES ¡Error amiláceo! .
Indicador no definido.
25.4 - FLUIDOS PERFORACIÓN ¡Error! Indicador no definido.
25.5 - INDUSTRIA DE PRODUCTOS COSMÉTICOS ............................................ 280
25.6 - REFERENCIAS ................................................................................................... 286
CAPÍTULO 26 - BIOSEGURIDAD EN LA APLICACIÓN DE ENZIMAS................. 288
26,1 - EUROPA............................................................................................................... 288
26,2 - EE.UU ................................................................................................................... 289
26.3 - BRASIL ................................................................................................................ 290
26.4 - TOXICOLOGÍA .................................................................................................. 291
26.5 - REFERENCIAS ................................................................................................... 292
http://www.actelion.com/uninet/www/www_main_p.nsf/Content/Image+Library+All - Referencia de la figura
de la portada
6
CAPÍTULO 1 INTRODUCCIÓN
Las enzimas han sido utilizadas por el hombre durante varios siglos. El uso
de malta en la elaboración de cerveza, abono para ablandar cueros y cuajo en la
elaboración de queso son ejemplos típicos del uso de enzimas desde la antigüedad.
El uso de enzimas comenzó mucho antes de que se conocieran su naturaleza y
propiedades.
En 1783, Spallanzani observó, por primera vez, la reacción de degradación
enzimática de la carne por el jugo gástrico. Kirchhoff, en 1814, se dio cuenta de que
la proteína de gluten de cebada era capaz de licuar el almidón en azúcar, siendo
posteriormente llamado diastasa, (palabra que en griego significa separación), por
Payen y Persoz, en 1833, y las amilasas en las cervecerías que ellos seguir
llamándose así.
El nombre “enzima” (palabra que, en griego, significa “en levadura”) fue
utilizado por primera vez por Kühne, en 1878, época en la que se creía que las
enzimas solo estaban activas en las células vivas, concepto que perduró hasta
1897, cuando Büchner observó que el extracto obtenido por prensado de células de
levadura aún tenía la propiedad de fermentar sacarosa.
Fue a partir de las primeras décadas del siglo XX cuando se intensificó el
desarrollo de la tecnología enzimática. El descubrimiento de nuevas enzimas que
forman parte de las vías metabólicas, el aumento del conocimiento de las
propiedades de las enzimas y el hallazgo de que casi todas las enzimas de interés
industrial pueden ser producidas por microorganismos fueron algunos de los
factores responsables de la evolución de la tecnología enzimática. .
1.1 - DEFINICIÓN
Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza principalmente
proteica, que participan en diversas reacciones bioquímicas, siendo el control
metabólico un papel fundamental. Estas moléculas aceleran reacciones
termodinámicamente favorecidas, siendo extremadamente versátiles,
estereoespecíficas y de gran importancia en los procesos biotecnológicos.
Para mostrar actividad catalítica, algunas enzimas requieren la participación
de moléculas más pequeñas (cofactores) de naturaleza no proteica, que se
subdividen en metales y coenzimas, como se observa en la Tabla 1.
Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas derivadas de vitaminas,
como, por ejemplo, el dinucleótido de flavina y adenina que se deriva de la vitamina
B2 (riboflavina), y pueden estar fuertemente unidas (grupos protésicos) o
débilmente, actuando como cosustrato.
7
Tabla 1 - Cofactores de algunas enzimas
CofactoresEnzima
Rieles
Zn2 + Anhídrido carbónico, carboxipeptidasa
Ca2 + −  
Ni2 + Ureasa
Mn2 + Superóxido dismutasa
Coenzimas
FAD Monoamina deshidrogenasa
NAD Lactato deshidrogenasa
Coenzima A Acetil CoA carboxilasa
Biotina Piruvato carboxilasa
Desde un punto de vista industrial, las enzimas tienen características

destacables, en relación a los catalizadores químicos, debido a su especificidad
tanto para un sustrato dado como en la promoción de una sola reacción bioquímica,
permitiendo la síntesis de un producto específico, sin la formación concomitante de
coproductos. Entre las ventajas que existen en el uso de enzimas, destacan su alta
especificidad, las suaves condiciones de reacción y la reducción de problemas
ambientales y toxicológicos.
En cuanto a las ventajas del uso de enzimas en la industria alimentaria,
destacan la rapidez de acción, la falta de toxicidad, la baja concentración, la acción
sobre un sustrato específico y el desarrollo de reacciones a temperaturas y pH's
suaves, que son necesarias, manteniendo el estructura deseada y otras
propiedades del alimento. Las condiciones de procesamiento suaves también
minimizan el gasto de energía.
1.2 - CALIFICACIONES
1.2.1 - Respecto a la forma de uso

Las preparaciones enzimáticas se pueden dividir, según su forma de uso, en
tres grupos. Los dos primeros grupos tienen una similitud, el hecho de que los
preparados participan en el proceso de producción; son entradas. La diferencia
radica en la modificación que se catalizará.
1er grupo: la enzima cataliza la reacción principal, a saber:
Productos de materias primas enzimáticas.
Ejemplos: almidón amilasa glucosa jarabe
sacarosa invertasa glucosa +
fructosa
8
2do grupo: las enzimas son importantes en las reacciones que complementan las
características adecuadas del producto (reacciones secundarias), es decir,
Materia prima Producto
enzima
Ejemplos: En el curtido de cueros actúan las proteasas que limpian el material
proteico adherido.
3er grupo - La enzima es el producto que se vende, normalmente, combinado con

otros componentes. No se activa en el proceso de producción.
Ejemplos: Productos farmacéuticos: enzima presente en medicamentos.
Reactivos: kits para la determinación de sustancias.
1.2.2 - Origen
Las enzimas, en cuanto a su origen, pueden ser intracelulares, se producen
dentro de la célula y necesitan un paso de disrupción celular para ser liberadas; o
extracelulares, que se producen y secretan al entorno externo de la célula.
1.2.3 - Modo de acción

En cuanto al modo de acción, las enzimas se pueden clasificar como
endoenzimas o exoenzimas. Las endoenzimas actúan escindiendo aleatoriamente
los enlaces químicos de las regiones internas de la molécula o polímero diana. Las
exoenzimas, por otro lado, actúan escindiendo los enlaces químicos en los
extremos de la molécula o polímero objetivo, generando dímeros o trímeros.
1.2.4 - Reacción química catalizada

La Comisión de Enzimas (CE) de la Unión Internacional de Bioquímica y
Biología Molecular (IUBMB) estableció, en 1961, las reglas para la clasificación y
nomenclatura de enzimas y coenzimas, con sus unidades de actividad y métodos
estándar de análisis, junto con los símbolos utilizados. en la descripción de la
cinética enzimática (más detalles en http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/).
Luego, las enzimas se clasificaron en:
1.2.4.1 - Oxidorreductasas
Las oxidorreductasas son enzimas que oxidan o reducen sustratos
transfiriendo hidrógeno o electrones, o usando grupos aceptores, como oxígeno,
NAD + y citocromo. El nombre sistemático está formado por "donador de
electrones: oxidorreductasa aceptor de electrones".
Ej .: La enzima que cataliza la siguiente reacción es -D-glucosa: oxígeno 1-
oxidorreductasa, también conocida como glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4), oxidando la
−− −         
  
9
1.2.4.2 - Transferasas
Las transferasas son enzimas que eliminan grupos de sustratos y los
transfieren a moléculas aceptoras. El nombre sistemático está formado por
"donante: grupo aceptor transferido-transferasa".
Ej .: La hexoquinasa actúa fosforilando la glucosa en la primera etapa de la
glucólisis, la cual es una vía energética común a prácticamente todos los seres
vivos, su nombre sistemático es ATP: D-hexosa 6-fosfotransferasa (EC 2.7.1.1),
quedando demostrada su actuación mecanismo en la siguiente reacción:
1.2.4.3 - Hidrolasas
Las hidrolasas son enzimas en las que el agua participa en la ruptura de
enlaces covalentes en el sustrato, y el nombre sistemático está formado por
"sustrato hidrolasa".
Ej .: La intolerancia a la lactosa en humanos es causada por la falta de lactasa, que
escinde la lactosa en galactosa y glucosa, como en la reacción a continuación. El
nombre sistemático de la lactasa es lactosa galactohidrolasa (EC 3.2.1.108).
1.2.4.4 - Liases
Las lisas son enzimas que eliminan grupos de sus sustratos, formando
dobles enlaces o que convierten los grupos agregados en dobles enlaces. El
nombre sistemático está formado por "prefijo de sustrato (del tipo de reacción
catalizada) -liase".
Ej .: Muchas bacterias y vegetales pueden crecer en medio acetato, porque utilizan
el ciclo del glioxilato, que es capaz de producir succinato para la producción de
energía y biosíntesis, donde la isocitrato liasa (isoxitrato glioxilato liasa, EC 4.1.3.1)
escinde un isocitrato molécula en succinato y glioxilato, como se muestra en la
siguiente reacción:
10
1.2.4.5 - Isomerasas
Las isomerasas son enzimas que promueven la isomerización del sustrato,
donde su nombre sistemático está formado por “prefijo sustrato (del tipo de
isomerización involucrado) -isomerasa”.
Ej .: En una de las etapas de la glucólisis, la 1,6-bisfosfato fructosa se escinde en
dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y gliceraldehído 3-fosfato (GAP), pero solo se usa
GAP en esta vía metabólica, por lo que la enzima triosa fosfato isomerasa (D-
gliceraldehído-3-fosfato aldosa-cetosis-isomerasa, EC 5.3.1.1) convierte DHAP en
GAP, como en la siguiente reacción:
1.2.4.6 - Ligasas
Las ligasas son enzimas que catalizan el enlace covalente de dos moléculas,
junto con la ruptura de un enlace altamente energético, como el enlace pirofosfato
de ATP. El nombre sistemático está formado por "sustrato X: sustrato Y ligasa
(producto formado derivado del trifosfato)".
Ej .: En la síntesis de ácidos grasos, el primer paso es la carboxilación de acetil CoA
a malonil CoA a través de la enzima acetil CoA carboxilasa (acetil CoA: dióxido de
carbono ligasa (formando ADP), EC 6.4.1.2), ilustrada en la reacción a
continuación. :
1.3 - MERCADO
Actualmente, el número de enzimas identificadas y en la lista de la Comisión
Internacional de Enzimas (CE) es de unas 3.000. Sin embargo, solo una pequeña
cantidad de estas enzimas, unas 60, tienen aplicaciones industriales y se utilizan en
cantidades apreciables. Debido a limitaciones legales (particularmente en la
industria alimentaria) y, principalmente, a los altos costos de producción
involucrados (especialmente en el caso de las enzimas intracelulares), el mercado
mundial de enzimas se limita a un volumen relativamente pequeño.
11
2500
2000
Millones de
1500
dólares
1000
500
0
1983 1995 1998 1999 2002 2003 2004 2009
Años
Figura 1 - Evolución de las ventas en el mercado mundial de enzimas
En 1998, las ventas mundiales de enzimas acumularon más de US $ 1.500

millones, con una tasa de crecimiento anual que oscilaba entre el 2% en la industria
del cuero y el 15% en la producción de papel y el 25% en la alimentación animal; y
en 1999, la tasa de crecimiento anual promedio del mercado fue de 6.5%, y
actualmente, esta tasa se mantiene en el rango de 4 a 5%.
La interpretación más clara es que el mercado de enzimas de uso industrial
ha crecido espectacularmente durante la década de 1970 y que este crecimiento ha
sido paralelo al desarrollo de un gran número de aplicaciones en la industria
alimentaria, donde muchas de las que han implementado procesos biotecnológicos
han logrado beneficios en términos de costo. y sostenibilidad, con reducciones del 9
al 90% en costos operativos, energía y materias primas. (Van Beilen y Li, 2002). En
la actualidad, esta expansión se produce más lentamente, con el crecimiento
restringido a los materiales de alto valor y bajo volumen que se utilizan en el campo
médico.
Sólo un número limitado de todas las enzimas conocidas está disponible
comercialmente e incluso menos se utilizan en grandes cantidades. Más del 75% de
las enzimas industriales son hidrolasas. Las proteasas representan casi el 40% de
las ventas de enzimas, e incluso con nuevas aplicaciones, su uso en detergentes es
su principal mercado.
El mercado se distribuye principalmente en enzimas utilizadas en
detergentes (37%), textiles (12%), almidón (11%), panificación (8%) y piensos (6%),
que utilizan alrededor del 75% de las enzimas producidas. industrialmente, con
aproximadamente el 10% del mercado total de enzimas que se produce para uso
interno.
1.4 - PRINCIPALES TIPOS Y USOS INDUSTRIALES

La Enzimología Industrial estudia el uso de diferentes preparados
enzimáticos en procesos industriales y otras actividades económicas. Con el
conocimiento de la naturaleza de las enzimas y su poder catalítico, su uso se ha
extendido gradualmente a varios campos, como en la producción de alimentos, en
la fabricación de detergentes y en las industrias textil y médico-farmacéutica, la
mayoría de las cuales se utilizan. , aproximadamente el 90%, es extracelular de
origen microbiano.
12
Las proteasas constituyen el 50% del mercado de enzimas microbianas. La
aplicación comercial dominante de las proteasas es el uso de proteasa alcalina
obtenida de Bacillus licheniformis en detergentes, seguida del uso de cuajo Mucor
miehei en la producción de quesos, y el uso en masa de pan y galletas también es
significativo.
Las principales aplicaciones de las enzimas extracelulares que degradan el
almidón consisten en convertirlo en jarabes que contienen glucosa, maltosa y
oligosacáridos, en la producción de azúcares fermentables en cervecerías, en la
obtención de bebidas alcohólicas y en la modificación de harinas de panadería
(amilasas).
Las cepas de Aspergillus niger producen principalmente pectinasas y
hemicelulasas. Los componentes principales de las pectinasas son pectinoesterasa,
pectinolasa y poligalacturonasa. En el proceso de extracción del jugo de frutas y en
la elaboración del vino, las pectinasas aumentan el rendimiento del jugo, reducen la
viscosidad y mejoran la extracción del color de la piel de las frutas y verduras
maceradas.
Las celulasas comerciales tienen actualmente aplicaciones limitadas en el
procesamiento de alimentos, la producción de alcohol, la industria textil y el
tratamiento de residuos. Su mayor potencial comercial es la conversión de
lignocelulosa y celulosa de madera en glucosa. Otras enzimas microbianas
extracelulares importantes son las lipasas de hongos y levaduras y las lactasas y
dextranasas de hongos.
La glucosa isomerasa es la enzima intracelular comercial más utilizada en la
industria alimentaria para convertir la glucosa en fructosa durante la producción de
jarabes de arroz ricos en fructosa. Las lactasas comerciales, bacterianas y de
levadura también son enzimas intracelulares. Las enzimas intracelulares se utilizan
como reactivos de diagnóstico clínico, en ingeniería genética y en la
biotransformación de productos químicos y farmacéuticos.
Las enzimas no microbianas más destacadas son la papaína, extraída del
látex de papaya papaya (Carica papaya), utilizada en cervecería y procesamiento
de alimentos, y la quimosina, extraída del cuarto estómago de novillos lactantes,
utilizada en la producción de queso. Los cereales malteados utilizados en las
cervecerías son fuentes de - y -amilasas, proteasas y -glucanasas para
licuefacción, sacarificación y extracción de azúcares fermentables y nutrientes.
1.5 - INNOVACIONES INDUSTRIALES

La evolución de la enzimología aplicada a la industrialización ha ampliado
enormemente las posibilidades de producción de nuevos alimentos, con una
marcada mejora en las características organolépticas, con un control de fabricación
más eficaz y, en determinados casos, con menores gastos operativos, en relación a
lo que se podría gastar. en el proceso uso de recursos tradicionales. Ejemplos
incluyen:
• Adición de enzimas industriales a los quesos con el fin de incrementar el efecto
de las enzimas secretadas por los cultivos originales en el desarrollo del aroma y
sabor del queso.
13
• En la cerveza normal, de 1/3 a 1/4 de los carbohidratos del mosto se encuentran
en forma de dextrinas límite, que no fermentan y permanecen como tales en el
producto final. La glucoamilasa de Aspergillus niger hidroliza estas dextrinas a
azúcares fermentables, lo que permite obtener un mosto con menor contenido
calórico, produciendo el mismo contenido alcohólico que la cerveza normal
(cerveza light).
• Mediante el uso de fases orgánicas, el agua puede ser un factor limitante y, en
estas condiciones, la dirección de la reacción se puede cambiar a síntesis en
lugar de hidrólisis. La naturaleza del solvente es crucial para mantener la capa de
agua intrínseca que rodea la enzima. Por tanto, los mejores disolventes serán los
más hidrófobos, por ejemplo, los hidrocarburos, ya que los disolventes menos
hidrófobos tendrán una mayor afinidad por el agua y podrán arrancar la capa de
agua esencial de la enzima. Como las enzimas son insolubles en casi todos los
disolventes orgánicos, forman suspensiones y operan bajo agitación en estos
sistemas orgánicos monofásicos. Las lipasas catalizan la transesterificación y
esterificación en medios orgánicos, mientras que en condiciones acuosas
predomina la hidrólisis.
• Las recientes técnicas de ADN recombinante, ingeniería de proteínas e
ingeniería metabólica permiten la optimización de los procesos fermentativos y la
producción de enzimas que tienen alta actividad y estabilidad, y características
más cercanas a las condiciones operativas del proceso en cuestión.
Enzimas no proteicas
Entre las enzimas no proteicas, las primeras en conocerse fueron las ribozimas, en
la década de 1980, de Cench y Altman, que son moléculas de ARN (ácido ribonucleico)
que catalizan la ruptura de los enlaces fosfodiéster de las moléculas de ARN de forma
selectiva. Las ribozimas participan en el ciclo de vida de algunos virus y pueden haber
sido cruciales en el mundo prebiótico, donde la molécula de ARN tendría múltiples
funciones.
Actualmente, existe el desarrollo de enzimas artificiales como ADNzimas
(desoxirribozimas), abzimas (anticuerpos catalíticos o CAbs) y ciclodextrinas
catalíticas, pero que tiene menor especificidad y velocidad de reacción que las enzimas
naturales.
Las ADNzimas catalizan la formación de enlaces lineales 3'-5 'entre dos moléculas
de ARN, en presencia de iones Mg2 + o Zn2 +.
Las abzimas reconocen y se unen de forma no covalente a su antígeno
complementario y catalizan la ruptura u otras reacciones químicas que involucran al
antígeno, tales como reacciones de eliminación, hidrólisis de ésteres, reacciones de Diels-
Alder, ciclizaciones catiónicas, reordenamiento de Cope, entre otras. Algunos estudios
sugieren aplicaciones clínicas de abzimas en el tratamiento de adictos a la cocaína y
nicotina y en la mitigación de los efectos secundarios de la quimioterapia.
A -ciclodextrinas asociadas con anillos imidazol actúan en la hidrólisis de
fosfatos cíclicos, en la epoxidación de derivados de estilbeno y en la hidroxilación de
dihidroestilbeno.
14
1.6 - REFERENCIAS
― BERG, JM; TYMOCZKO, JL; STRYER, L.; Bioquímica, 5a ed., Editora Guanabara Koogan, Río de
Janeiro, 2004.
― CABRAL, JMS; AIRES-BARROS, SEÑOR; GAMA, M.; Ingeniería Enzimática, Lidel Edições
Técnica, Lisboa, 2003.
― FENNEMA, OR; Química de Alimentos; 3ª edición; Marcel Dekker, Inc.; Nueva York, 1996.
― FIAMMENGO, R.; JÄSCHKE, A.; Enzimas de ácidos nucleicos; Opinión actual en biotecnología, 16,
614-621, 2005.
― GERHARTZ, W.; Enzimas en la industria: producción y aplicaciones; VCH Publishers, Nueva York,
1990.
― GODFREY, T.; OESTE, S.; Enzimología industrial, 2ª ed.; The MacMillan Press, Londres, Inglaterra,
1996.
― HANSON, CV; NISHIYAMA, Y.; PAUL, S.; Anticuerpos catalíticos y sus aplicaciones; Opinión
actual en biotecnología, 16, 631-636, 2005.
― LIMA, UA; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W.; Biotecnología industrial: procesos
fermentativos y enzimáticos, vol. 3; Editora Edgard Blücher Ltda., São Paulo, 2001.
― LÖNNBERG, T.; LÖNNBERG, H.; Modelos químicos para la acción de las ribozimas; Opinión actual
en biología química, 9, 665-673, 2005.
― MOTHERWELL, WB; BINGHAM, MJ; SEIS, Y.; Progresos recientes en el diseño y síntesis de
enzimas artificiales, Tetrahedron, 57, 4663-4686, 2001.
― ORGEL, LE; Química prebiótica y origen del mundo del ARN; Revisiones críticas en bioquímica y
biología molecular, 39, 99-123, 2004.
― UHLIG, H.; Enzimas industriales y sus aplicaciones, John Wiley & Sons, Inc.; Toronto, Canadá, 1998.
― VAN BEILEN, JB; LI, Z.; Tecnología enzimática: descripción general, Current Opinion in
Biotechnology, 13, 338-344, 2002.
15
CAPÍTULO 2 - CINÉTICA ENZIMÁTICA
Cada enzima es una secuencia única de aminoácidos que genera miles de

combinaciones posibles. Esta secuencia lineal corresponde a la estructura primaria
de la enzima.
La estructura secundaria corresponde a la disposición espacial de esta
cadena de aminoácidos formando regiones de estructura regular a través de
enlaces de hidrógeno, como la hélice y la hoja .
La estructura terciaria se genera plegando arreglos de estructura secundaria
e interacciones entre residuos de aminoácidos, como puentes disulfuro, y cuando la
enzima tiene más de una cadena peptídica (subunidad), su disposición espacial y
sus interacciones corresponden a su estructura cuaternaria.
El sitio activo de una enzima es una región tridimensional formada por
grupos de diferentes partes de la estructura primaria de la enzima, que se unen a
sustratos y cofactores, para promover la ruptura o generación de enlaces. Ocupa un
pequeño volumen en la molécula y puede considerarse como una grieta o cavidad
en la estructura de la proteína.
Los sitios activos están unidos a los sustratos por atracciones débiles, como
enlaces electrostáticos, interacciones hidrofóbicas, fuerzas de van der Waals y
enlaces de hidrógeno, reforzando estos últimos un alto grado de especificidad entre
la enzima y el sustrato.
Hay dos modelos que intentan explicar la unión de la enzima al sustrato. La
primera fue expresada en 1890 por Emil Fischer, haciendo una analogía entre llave
y cerradura, donde el sitio activo de la enzima tiene una forma complementaria a la
del sustrato, como en la figura 1.
Figura 1 - Modelo con cerradura de llave
En 1958, Daniel E. Koshland Jr. postuló un modelo llamado ajuste inducido,

donde el sitio activo de la enzima solo es complementario al del estado de
transición después de que se adhiere el sustrato, es decir, el sitio activo es flexible y
puede modificarse. para conectar al sustrato, como en la figura 2.
Figura 2 - Modelo de ajuste inducido
16
2.1 - ACCIÓN ENZIMÁTICA
Cuando se une al sustrato en el sitio activo, la enzima forma un complejo
activado y, al completar la reacción catalítica, libera el producto y vuelve a su forma
original. El proceso se desarrolla en dos etapas:
(1) S + EES * (paso reversible)

(2) Y SI + P (paso irreversible)
* complejo enzima-sustrato
La enzima tiene la característica de disminuir la energía de activación

necesaria para la formación del complejo activado, aumentando consecuentemente
la velocidad de reacción, como en la figura 3. La relación numérica entre la
velocidad de reacción (V) y la energía de activación ( G *) es dado por la ecuación
(1):
kT −G
V= [s] * RT
(1)
Eh
Dónd
e:
k (Constante de Boltzmann) = 1,38 * 10-23 J / K
H (Constante de Planck) = 6,63 * 10-34 Js
R (constante de gas universal) = 8,31 J / mol.KT
(temperatura, K)
S (concentración de sustrato, mol / L)
Se puede dar un ejemplo numérico de esta ecuación, considerando una

temperatura de 50 ° C, una concentración de sustrato de 1 M y una energía de
activación de 20 kJ / mol. Después de la adición de la enzima, la energía de
activación disminuyó a 15 kJ / mol. Es decir, la velocidad de reacción aumentó de
3.9 * 109 s-1a 2.52 * 1010 s-1, un aumento de velocidad de más de 6 veces,
con una disminución del 25% en la energía de activación.
Complejo activado
Potencial de Gibbs
Sin ezima
(   )
Con enzima
Sustrato
Product
o
Progreso de la reacción (t)

figura 3 - Comparación de la energía de activación en reacciones con y sin enzimas
17
2.2 - ESTRATEGIAS DE CATÁLISIS
2.2.1 - Catálisis covalente

La catálisis covalente implica acelerar la velocidad mediante la formación
transitoria de un enlace covalente sustrato-enzima, que es el mecanismo más
común en las reacciones enzimáticas. Las cadenas laterales de histidina, cisteína,
aspartato, lisina y serina pueden participar en la catálisis covalente como agentes
nucleofílicos.
Este tipo de catálisis ocurre en diferentes etapas, donde primero se produce
el ataque nucleofílico de la enzima sobre el sustrato con la formación de un enlace
covalente, luego la pérdida de electrones en el sitio activo de la enzima y la
separación de la enzima del producto formado .
Las transferasas y las hidrolasas son ejemplos frecuentes de este tipo de
estrategia, como se observa en la reacción catalizada por la quimotripsina (figura
Quimotripsina
4).
Figura 4 - Catálisis covalente
Las coenzimas piridoxal fosfato y tiamina pirofosfato funcionan

principalmente por catálisis covalente electrofílica, donde se forma un compuesto
de adición entre la coenzima y el sustrato.
2.2.2 - Catálisis ácido-básica

La catálisis ácida es un proceso en el que la transferencia parcial de
protones desde un ácido al estado de transición disminuye la energía libre del
estado de transición de una reacción, mientras que la catálisis básica hace que la
velocidad de reacción aumente con la abstracción de un protón por una base. En
las reacciones enzimáticas, los catalizadores ácidos y básicos son grupos
ionizables de la enzima ubicados en su sitio activo, lo que evita la formación de
intermedios cargados inestables en la reacción. Como ejemplos tenemos la
mutarrotación de glucosa, RNasa A y la tautomerización ceto-enólica, mostradas en
la figura 5.
La catálisis ácido-base es el mecanismo utilizado en la hidrólisis de ésteres y
enlaces peptídicos, reacciones de grupos fosfato, adición de grupos carbonilo y, en
general, pueden estar involucrados los residuos laterales de aspartato, glutamato,
histidina, cisteína, tirosina y lisina.
18
Ceto Estado de
transición
Sin
Catálisi
s
Catálisi
s ácida
Catálisi
s
básica
Figura 5 - Catálisis ácido-base
2.2.3 - Catálisis de iones metálicos

Los iones metálicos pueden funcionar en la catálisis de varias formas, como
catalizador electrófilo, estabilizando una carga negativa en un intermedio de
reacción; nucleofílico, que aumenta la acidez de una molécula cercana, como el
agua en la hidratación del CO2 por la anhidrasa carbónica; o al unirse al sustrato,
aumentando el número de interacciones con la enzima, tomando como ejemplo las
NMP quinasas.
Es importante destacar la diferencia entre metaloenzimas y enzimas
activadas por metales. Las metaloenzimas contienen enlaces fuertes con Fe + 2, Fe
+ 3, Cu + 2, Zn + 2 y Mn + 2, mientras que las enzimas activadas por metales
contienen enlaces débiles con Na +, K +, Mg + 2 y Ca + 2.
2.2.4 - Catálisis de aproximación y orientación

Muchas reacciones incluyen dos sustratos distintos, donde la velocidad de
reacción aumenta al aproximarlos a una superficie de unión en una enzima. Las
NMP quinasas se aproximan a dos nucleótidos, lo que facilita la transferencia de un
fosforilo de un grupo al otro.
La estructura tridimensional de la enzima puede llevar varias cadenas
laterales reactivas a una gran proximidad en el sitio activo. Al unirse al sustrato en
el sitio activo, la enzima guía al sustrato hacia la interacción más eficiente con estas
cadenas laterales.
Este tipo de estrategia también se utiliza en reacciones intramoleculares,
facilitando la ciclación de moléculas.
19
2.2.5 - Catálisis electrostática
La catálisis electrostática se refiere al hecho de que cuando un sustrato se
une a la enzima, el agua se excluye del sitio activo (desolvatación), lo que provoca
una disminución de la constante dieléctrica local, lo que aumenta las interacciones
electrostáticas en el sitio activo y también da como resultado la protección. de
grupos de agua reactivos, evitando la formación de productos indeseables.
La participación de grupos funcionales cargados con la enzima en la
estabilización de intermedios inestables en el mecanismo químico también se
puede llamar catálisis electrostática.
2.3 - MODELOS CINÉTICOS
2.3.1 - Con un solo sustrato

El principio fundamental de la cinética enzimática está relacionado con la
proporcionalidad de la velocidad de reacción a la concentración de enzima activa en
la zona de linealidad de la relación producto-tiempo, que puede ocurrir en una fase
homogénea (enzimas en solución) o heterogénea (enzimas inmovilizadas) .
Los primeros estudios sobre cinética enzimática fueron realizados en 1902
por Brown, y complementados por Henri en 1903, los cuales incluyeron en los
cálculos del modelo la formación de un complejo intermedio formado por la enzima
y el sustrato, que posteriormente se descompone, generando el producto y
regenerando el enzima. Y a partir de ella se crearon dos teorías: Michaelis-Mentem
(equilibrio rápido) y Briggs-Haldane (estado estacionario).
2.3.1.1 - Michaelis-Menten
En la teoría del equilibrio rápido se asume el establecimiento de un equilibrio
entre E, S y ES, lo que implica que las velocidades de formación de ES a partir de E
y S y la descomposición en E y S son mucho mayores que la velocidad de
descomposición de ES en E y P:
E+s k1
ES E+P
k -1
k2
Para el ajuste de este modelo se hacen algunas consideraciones:
• La enzima se combina rápida y reversiblemente con el sustrato S para formar el
complejo ES
• El paso limitante de la reacción es la división de ES en E + P (k2 << k-1).
Después de alcanzar rápidamente el equilibrio, la concentración de ES comienza
a dictar la velocidad.
• La enzima participa en la reacción en cantidades catalíticas ([E] t <<<
[S] t) Con esto, tenemos la ecuación (2):
dP
= v = k [ES] (dos)
dos
dt
20
Considerando que se conoce la concentración total de enzima ([E] t)
(ecuación 3, donde [E] representa la concentración de enzima libre), procedemos a
la ecuación de velocidad como una función de variables conocidas.
[Y]t = [Y] +[ES] (3)
Definiendo Ks como la constante de disociación del complejo ES, tenemos
la ecuación 4.
[E] [S] k -1 (4)
Ks = =
[ES] k1
Dividiendo la ecuación 2 por [E] t usando las ecuaciones 3 y 4, tenemos:

[E] [S]
v [ES] v Ks
=k → =k (5)
[Y [ Y ]t [Y [E] [S]
dos dos
[Y]+
]t ]t
Ks
[Y ]t [S
v = k dos (6)
K ] s + [S ]
Por definición, Vm es la máxima velocidad de reacción, es decir, Vm = k2
[E] t. Por tanto, la ecuación de Michaelis-Mentem se expresa mediante la
ecuación 7:
Vm [S]
v= (7)
K s +[S ]
2.3.1.2 - Briggs-Haldane
En la teoría del estado estacionario, se supone que inmediatamente después
de un estado transitorio inicial muy rápido, se alcanza el estado estacionario, donde
la variación en la concentración del complejo ES a lo largo del tiempo es
insignificante en comparación con las variaciones en las concentraciones de S y P ,
resultando en la ecuación 8.
D[ES]
=0 (8)
dt
Realizando el balance de masa ES, según el modelo empleado por
Michaelis-Mentem, y utilizando la ecuación 8, tenemos:
D [ES]
= [ES] formado − [ES] consumado
dt
D [ES]
= k [E] [S] − k [ES] − k [ES]
1 −1 dos
dt
k1 [ Y ] [ s ] − (k −1 + k dos )[ ES ] = 0
21
(9)
22
De acuerdo con la ecuación 3, podemos considerar que [E] = [E] t - [ES], y
sustituir en la ecuación 9.
k1 ([ Y ]t − [ES])[ S ] − (k −1 + k dos )[ES] = 0
k1 [ Y ]t [ S ] − k1 [ES] [S] − (k −1 + k dos )[ES] = 0
[ES] = [ Y ]t [ S ]
k −1 + k + [ S (10)
dos ]
k1
Sustituyendo la ecuación 10 en la ecuación 2, y considerando Vm = k2 [E]
t, tenemos la ecuación de Briggs-Haldane (11).
k [Y] [S ] Vm[S
v = dos t = (11)
] K METRO +[S ]
K METRO
K M +[S ]
E 1
T
R =
k −1 +
O
2.3.1.3 - Gráficos kdos k
Modelo general: vx [S]
Vm
v (nM. min-
||
Vm / 2 Orden cero
1)
_
1er orden
_
Kansas [S] (METRO)
En el gráfico anterior, se definieron dos regiones de modelos cinéticos

distintos: 1er orden y orden cero. En el modelo cinético de 1er orden, la
concentración de sustrato es baja ([S] <0.01Ks), generando un modelo lineal, donde
la velocidad de reacción de la enzima es proporcional a la concentración de
sustrato (ecuación 12).
[Y]t [S ]
v = kdos →v=K (12)
[S]
K
s
En el modelo cinético de orden cero, la concentración de sustrato es alta
([S]> 100Ks), generando un modelo constante, donde la velocidad de reacción de la
enzima es independiente de la concentración de sustrato (ecuación 13).
[Y]t [S ] [E]
v=k →v=k = cte = Vm
23
(13)
dos dos t
[S ]
24
Determinación de parámetros cinéticos: KM y Vm
La constante de Michaelis-Mentem se puede determinar usando el gráfico vx
[S], donde v = Vm / 2, el valor de KM se obtiene en la abscisa [S].
Los parámetros cinéticos (KM y Vm) también se pueden determinar
utilizando métodos gráficos como Lineweaver-Burk, Hanes y Eadie-Hofstee, que se
describen a continuación:
1/v
Lineweaver-Burk
tg = Km / 1  KM  1
Vm = +1
 
1/ v Vm [S ] Vm
Vm
1 / [S]
[S] / v
Hanes
tg = 1 / [S] KMETRO  1 
Vm
= + [S]
v Vm Vm
 
Km / Vm
[S]
v
Vm
Eadie-Hofstee
v
tg = -Km v = Vm − K METRO  
  [S]
v / [S]
Para determinar los parámetros cinéticos KM y Vm, la región ideal sería la

curva donde la concentración de sustrato se encuentra entre 0,5 y 10 KM,
manteniendo la proporcionalidad entre la velocidad de reacción enzimática y la
concentración enzimática. De lo contrario, concentraciones muy bajas de sustrato
generarían un modelo cinético de primer orden, donde KM y Vm tenderían al
infinito; o bien concentraciones muy altas de sustrato generarían un modelo cinético
de orden cero, donde Vm podría definirse, pero KM no.
25
2.3.1.4 - Acción de inhibidores
La velocidad de una reacción enzimática puede modificarse por la presencia
de otros compuestos distintos del sustrato, que se denominan reguladores. Estos
pueden ser positivos (activadores, que aumentan la velocidad de la reacción
enzimática) o negativos (inhibidores, que reducen la velocidad de reacción de forma
reversible; e inactivadores, que reducen la velocidad de reacción de forma
irreversible).
Hay varias formas en que un inhibidor reversible puede actuar sobre una
enzima y cómo afecta la cinética de reacción.
Inhibición competitiva
El inhibidor, en este caso, es una molécula con una estructura química y
espacial análoga al sustrato y se une al sitio activo de la enzima, evitando la
formación del complejo ES. Esta inhibición afecta la afinidad (Km), pero no la
velocidad máxima de reacción (Vm), y se elimina en altas concentraciones de
sustrato.
El diagrama siguiente, la ecuación 14 y su forma linealizada describen este
tipo de inhibición.
Kansas
E+S ES E+P
+ kp Vm [ S ]
I v = K 1 + [I]  + [ S ] (14)
METRO 
kI  
Ki
OYE
1/v Con inhibidor
1 / Vm 1 K [I]  11
METRO

Sin

= 1 +  +
inhibidor v Vm  K I [ S ] Vm
− 1 −
1
]
K K 1+
 [I  
1 / [S]
METRO METRO  
 K I
Inhibición no competitiva
Ocurre cuando una molécula se une en una ubicación diferente del sitio
activo en la superficie de la enzima, es decir, no afecta la afinidad de la enzima por
el sustrato. El complejo ESI formado no genera ningún producto y puede
descomponerse a menor velocidad o quedar totalmente inactivo. El diagrama
siguiente, la ecuación 15 y su forma linealizada muestran este tipo de inhibición.
26
Kansas
E+ E+
S kp P Vm
ES [S]
 [I ] 
+ +
I I 
1 +  (15)
kI ki v= Ki
Kansas K METRO + [ S ]
EI +
S ESI
1/
Con
v
inhibidor
1 K METRO  [I]  1 1 [I] 

=
1 1+ [I ]  Sin

Vm  1 + K [ S ] + Vm  1 + K 

inhibidor v
I
Vmetro K I 
 I 

1/
Vm
−
1 1 / [S]
KMETRO
Inhibición competitiva
En la enzima puede haber dos sitios activos, uno para la unión con el
sustrato y otro para el inhibidor, este último solo se activa cuando se forma el
complejo ES, donde el complejo ESI no genera productos.
Cuando hay altas concentraciones de sustrato, también puede ocurrir este
tipo de inhibición, siendo el inhibidor el propio sustrato. El diagrama siguiente, la
ecuación 16 y su forma linealizada describen este tipo de inhibición.
Kansas kPAG
E+ ES Vm
S E+P   [S]
1 + [I]
+
I  
v= Ki 
K METRO (dieciséis
ki +[S )
]
 
ESI 1 + [I]
 
Ki 
1/v Con K
inhibidor
METR
O
 [I] 
1 + 
Sin inhibidor K Mapa  I
K
= Vm
1/ Vm ap  [I] 
Vmap
27
1 + 
 K I
1 1 1
1 / Vm = K Mapa +
1/ vVm ap [S] Vm
-1 / KMap 1 [S]
−
K METRO
28
Inhibición mixta
La inhibición mixta es un modelo más general, que afecta tanto a la afinidad
de la enzima por el sustrato como a la velocidad máxima de reacción de la enzima.
El diagrama siguiente, la ecuación 17 y su forma linealizada muestran este tipo de
inhibición.
ks kp
E+ ES E+
S + P
+ Y v=
Vm [ s ] (17)
Y o

o   
K 1 + [I] + 1 + [I] 
[S]
ki ki 

METRO
    Ki
K Ki
EI + ESI
ans
S
as
En este modelo más general, las otras inhibiciones se pueden describir mediante:
• =1 inhibición no competitiva.
• =∞ inhibición competitiva
2.3.2 - Con más de un sustrato

En el caso de reacciones que involucran más de un sustrato, los modelos
cinéticos dependen de los mecanismos de reacción, que se clasifican en
secuenciales y oscilatorios. Ambos mecanismos pueden ser ordenados o aleatorios,
independientemente de que exista o no una secuencia preestablecida para unir los
sustratos a la enzima.
En este tipo de modelos cinéticos se utiliza la nomenclatura de Cleland, es
decir, una reacción de un sustrato que genera dos productos, se denomina
mecanismo Uni Bi; si hubiera tres sustratos generando dos productos, sería el
mecanismo Ter Bi. Los mecanismos Bi Bi, por ejemplo, utilizan la ecuación 18 como
modelo cinético, variando únicamente las definiciones de KB y KA.
[
v = Vm (18)
K sAKB + KB PESTA [B] +[A]
ÑA] + [B]
KLA
2.3.2.1 - secuencial
Es un mecanismo donde todos los reactivos deben combinar la enzima
antes de que tenga lugar la reacción, con una sola estructura activa.
Mecanismo bi bi ordenado
LA BPQ
29
k1 k2 k3 k4 k5 k6 k7 k8
Y Y
Y EL EAB Y POR QUÉ
Ecualizador
30
Mecanismo Bi Bi aleatorio
AB PORQUE
kA K kP kQ
Y EL B EP
Y
Y Y
EAB POR
EB QUÉ kQ Ec
K kP
kL ua
B
A lizQP
licenciado en Letras
ad
or
2.3.2.2 - Oscilatorio
El producto se forma antes de que todos los sustratos se hayan unido a la
enzima, con más de una estructura activa de la enzima, entre las que oscila (en el
caso de enzimas que requieren cofactores disociables).
Mecanismo de Teorell-Chance
LA Q
B PAG
k1 k2 k5 k6
k3 k4
Y Y
EAEQ
Mecanismo de ping-pong
LA PB Q
k1 k2 k3 k4 k5 k6 k7 k8
Y
EAFP F pensión completa Ecualizador
Y
Aplicaciones de inhibición de enzimas

El concepto de inhibición enzimática se aplica en varias áreas tanto de forma
positiva (producción de fármacos) como negativamente (acción de herbicidas y pesticidas
en las plantaciones).
En el área farmacéutica, este concepto existe en remedios como la sulfanilamida,
que inhibe una enzima, la dihidropterato sintasa, responsable de la producción de ácido
fólico en las bacterias, y con la enzima inhibida, la bacteria no crece.
Otro ejemplo es el alopurinol, que se usa para tratar la gota (acumulación de ácido
úrico en las articulaciones) y los cálculos renales. Actúa inhibiendo irreversiblemente la
enzima xantina oxidasa, que cataliza la oxidación de las purinas en el ácido úrico. Como
resultado, se reducen las altas concentraciones de ácido úrico.
31
En el área ambiental, el concepto de inhibición se aplica a los biosensores para
detectar agentes nocivos, como los organofosforados (pesticidas), que inhiben la enzima
acetilcolinesterasa; compuestos fenólicos, que tras ser oxidados por la enzima tirosinasa,
el producto generado inhibe la enzima, y metales pesados, que inhiben la glucosa oxidasa.
En el área de la alimentación también se han desarrollado biosensores que utilizan
la inhibición enzimática para detectar glicoalcaloides, que pueden causar intoxicaciones,
efectos teratogénicos y embriogénicos, siendo las enzimas acetilcolinesterasa y
butilcolinesterasa empleadas, además de la detección de ácido benzoico por tirosinasa en
mayonesa y refrescos.
2.4 - FACTORES QUE INFLUYEN EN LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS
2.4.1 - Concentración de sustrato

Como ya se observó en el modelo de Michaelis-Menten, la curva de
velocidad de reacción en función del sustrato tiene regiones características, y la
cinética de primer orden, que ocurre en tiempos de reacción cortos, no está
influenciada por factores, como inactivación enzimática, reversión de reacción. ,
inhibición del producto y saturación del sustrato. Es decir, en esta región hay
linealidad, lo que facilita los cálculos inherentes (ecuación 19). Así, se determinó
que se consideró que el valor de la actividad enzimática era el obtenido a la
velocidad inicial de la reacción.
dP
= v 0 = cte (19)
dt
Una cantidad excesiva de sustrato promoverá un cambio de equilibrio para
formar un complejo ES, esto significa que [E] t = [ES], y que la velocidad de
reacción es máxima, como se ve en la ecuación 20.
v = kdos [ES] → v = kdos [Y]t = (20)
Vm
2.4.2 - Selección de sustrato

Para cada enzima existe un sustrato natural correspondiente, es decir, el
sustrato que tiene la mayor afinidad con la enzima (menor KM). Como ejemplo,
tenemos la glucosa-isomerasa, conocida por isomerizar la glucosa en fructosa, pero
con xilosa como sustrato natural.
Otro factor importante para la selección del sustrato es que garantiza la
reproducibilidad del método analítico utilizado, por lo que en algunos casos se
utilizan sustratos sintéticos no naturales, como la -galactosa-ortonitrofenilo, que al
hidrolizarse libera una molécula que absorbe en el ultravioleta. -Rango de longitud
de onda visible, facilitando el análisis de la formación del producto.
32
2.4.3 - Concentración de enzimas
Según el modelo de Michaelis-Menten, se percibe que la velocidad de la
reacción enzimática es directamente proporcional a la concentración de enzima,
manteniendo constante la concentración de sustrato (ecuación 21).
v=k [Y ]t [S → v = K [E] (21)
]
K M + [S]
dos t
E
T
Existen algunas excepciones
R a esta relación lineal entre la velocidad de
reacción y la concentración de Oenzima, como la limitación de la solubilidad del
sustrato, que genera curvas que mantienen una relación lineal en concentraciones
muy pequeñas de enzima y disminuyen al aumentar la concentración; además de la
acción de inhibidores reversibles o no reversibles y cofactores disociables, que
inicialmente permanecen con una velocidad de reacción reducida hasta que todos
los inhibidores ya están acomplejados con las moléculas de la enzima, donde a
partir de ahora las moléculas añadidas serán libres y la velocidad de reacción
aumenta.
2.4.4 - pH
Los efectos del pH sobre la actividad enzimática se deben a la necesidad de
mantener los grupos críticos del centro activo en el estado de ionización correcto
para que ocurra la reacción, es decir, a este pH la reacción se realiza a máxima
velocidad. Para que el pH se mantenga durante la reacción, el medio debe
tamponarse. La concentración de la solución tampón, así como su pH, deben ser
los más adecuados para la catálisis.
La existencia de un pH óptimo para la reacción enzimática puede deberse a:
• Efecto reversible del pH sobre la velocidad máxima de reacción;
• Cambio en la afinidad enzima / sustrato, que se reflejará en el valor de KM;
• Cambio en la estabilidad de la enzima, con desnaturalización irreversible en uno
o ambos extremos del punto de pH óptimo para la actividad. Este último efecto
depende del tiempo empleado para medir la velocidad de reacción.
El modelo cinético de Michaelis & Davidsohn describe la variación de la
velocidad de reacción en función del pH, como se muestra en el diagrama siguiente
y mediante la ecuación 22.
Y ES
ke2 kes2
kp Vmap [S ]
S+ ks EHS EH + P v= (22)
EH
ke1 kes1
KMapa +[S ]
EHd EHdoss
os
33
Ser:
[H + ] + k2, +E
1+ k [H ]
Vm
Vm = ; K = 1, Y
K
ap + METRO
[H + k2, ES + k2, ES
Mapa
+
] [H + ] [H [H + ]
1 ]
k1, ES 1
k1, ES
Los valores de las constantes de equilibrio se pueden obtener analizando las

curvas de actividad x pH en concentraciones de sustratos saturantes. En la figura 6,
tenemos ejemplos de actividad enzimática que varían con el pH.
1 invertasa
(levaduras);
2 amilasa (Bacillus
% De actividad
sp.)
3 amino acilasa
(Aspergillus
relativa
oryzae)
4 proteasa alcalina (Bacillus
sp.)
Figura 6 - Perfiles de actividad enzimática x

pH
2.4.5 - Temperatura
La temperatura tiene efectos opuestos sobre la actividad enzimática,
aumentando por un lado la reactividad del complejo ES activo y por otro lado
aumentando la velocidad de inactivación enzimática como consecuencia de la
alteración de la estructura tridimensional activa de la enzima. Ambos fenómenos
pueden modelarse mediante las ecuaciones 23 y 24 (modelos tipo Arrhenius),
donde k representa la constante catalítica de la reactividad ES; EA es la energía de
activación (entre 4 y 20 kcal / mol); kD, constante de inactivación térmica; y EiA, la
energía de activación del proceso de inactivación (entre 40 y 200 kcal / mol).
k = k0 Exp (−YLA / RT) (23)
KD = KD0 Exp (−YI a / RT) (24)
Aunque el primer efecto es independiente del tiempo, el segundo es
fuertemente dependiente del tiempo, lo que nos permite concluir que la temperatura
óptima para un proceso depende del tiempo de operación.
La curva típica de influencia de la temperatura sobre la actividad enzimática
presenta los dos efectos al mismo tiempo. Antes de llegar a la Tmax, prevalece el
aumento de la velocidad de reacción debido al aumento de temperatura y, una vez
alcanzado el máximo, el efecto de desnaturalización comienza a prevalecer sobre el
primero, como se ve en la figura 7.
34
1 -galactosidasa
% De actividad
(levaduras)
2 aminoacilasa
(Aspergillus
oryzae)
3 glucosa isomerasa
relativa
(Streptomyces sp.)
Temperatura (° C)
Figura 7 - Perfiles de actividad enzimática x temperatura (período de prueba de 30 minutos)
2.4.6 - Actividad acuática

El agua influye en la actividad catalítica de la enzima de forma variada y
diferenciada para cada tipo de enzima, actuando sobre su estructura a través de
enlaces no covalentes, favoreciendo la ruptura de los enlaces de hidrógeno,
facilitando la difusión del reactivo y alterando el equilibrio de la reacción.
A modo de ejemplo, la disminución de la actividad del agua puede alterar el
equilibrio termodinámico de las reacciones de hidrólisis a las de síntesis, como en la
esterificación y síntesis de péptidos. Un alto contenido de agua puede reducir las
tasas de reacción enzimática debido a las limitaciones de agregación y difusión de
proteínas. La actividad óptima del agua a menudo se encuentra dentro de un rango
estrecho.
Se ha demostrado que es el agua combinada la enzima que determina la
actividad catalítica, en lugar del contenido total de agua del sistema. Si se agrega la
misma cantidad de agua a sistemas que contienen varios solventes orgánicos, la
cantidad de agua asociada con la enzima puede variar. En general, cuanto más
polar sea el disolvente, más agua se retendrá en la solución y, por tanto, no estará
disponible para unir la enzima.
La actividad del agua (aw) de todas las fases de la mezcla de reacción será
la misma en equilibrio, aunque sus concentraciones de agua sean normalmente
diferentes. Si las reacciones enzimáticas tienen lugar en diferentes medios a una
aw fija, la cantidad de agua asociada con el biocatalizador tenderá a permanecer
igual, simplificando la interpretación y predicción de cambios en el rendimiento de la
enzima. En sistemas con un contenido de agua constante, los efectos aparentes del
cambio de disolvente pueden simplemente reflejarse en la competencia del agua
entre la enzima y el resto del sistema.
La existencia de una correlación directa entre la actividad enzimática y aw
del sistema se demuestra claramente en el caso de la lipasa de Mucor miehei, que
demostró una actividad óptima a aw = 0.55, cuando se utilizó variando la polaridad
de los solventes (Figura 8a). La velocidad de reacción absoluta depende del
disolvente, pero la forma del perfil prácticamente no cambia. Obviamente, hubo
grandes variaciones en la actividad óptima cuando la actividad se representó frente
a la concentración de agua en los disolventes orgánicos (Figura 8b).
35
Figura 8 - Actividad de la enzima lipozima: a) en función de la actividad del agua (aw), b) en función de la
concentración de agua (c) en la fase orgánica. Disolventes probados: hexano (), tolueno (x), tricloroetileno
(o), éter diisopropílico (□), 3-pentanona (◊) y ácido dodecanoico / dodecanol 1: 1 (+).
2.4.7 - inhibidores
En muchas aplicaciones tecnológicas, puede ser posible evitar problemas de
inhibición enzimática limitando el número de compuestos presentes en la corriente
de alimentación. Los ejemplos de inhibición que no se pueden evitar de esta
manera son causados por altas concentraciones de sustrato o producto, un
fenómeno particular de las enzimas.
Los inhibidores también se pueden utilizar actuando positivamente en el
control de reacciones multienzimáticas, en la protección de sitios activos durante
modificaciones químicas de la molécula enzimática y en la investigación del
mecanismo de catálisis enzimática.
2.4.8 - Estabilidad enzimática

Uno de los problemas más habituales en enzimología es la pérdida de
actividad enzimática por su inestabilidad en el medio, lo que provoca su
desnaturalización. Y, no siempre, las condiciones óptimas de actividad enzimática
son las mismas que optimizan la estabilidad enzimática, lo cual es importante para
determinar el tiempo máximo de almacenamiento posible, con una mínima pérdida
de actividad enzimática.
El uso de refrigeradores, con temperaturas que oscilan entre -70 y -4 ° C,
permite que la enzima se mantenga estable durante semanas, evitando el proceso
de congelación y descongelación que puede desnaturalizar la enzima.
La adición de glicerol, sacarosa y ciclodextranos a las preparaciones
enzimáticas aumenta su estabilidad durante mucho tiempo. El polietilenglicol se
utiliza como aditivo para evitar la adsorción de enzimas en la superficie de los
envases.
Existe un modelo cinético que describe la pérdida de actividad enzimática en
función del tiempo, que se ve en el diagrama a continuación y en la ecuación 25,
donde N es la enzima nativa; D, la enzima desnaturalizada; N0, la enzima nativa en
el tiempo t = 0; y Nmin, la enzima nativa en t = ∞.
36
norte ⎯⎯k D → D
D [NORTE]
dt D ([NORTE min ])
= −k ]−
[NORTE
norte t
D [NORTE ]
 
= −k D dt
n min ]) 0
o
([NORTE]
rt
e
− [NORTE
0
 [NORTE] − [NORTE min ] 

en
 [NORTE 0 ] − min  = −k Dt
[NO ]
RTE 
[ norte ] = min0
[ norte min ] + ([
norte ] − [ norte ])y − k Dt (25)
2.5 - DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
2.5.1 - Definición y Unidades

La actividad enzimática se expresa en Unidades Internacionales (UI), que se
define como la cantidad que catalizará la transformación de 1 µmol de sustrato por
minuto en condiciones óptimas.
De esta definición se derivaron otras expresiones como:
• Actividad específica  número de unidades de actividad por
miligramo de proteína. Este parámetro se puede utilizar como indicador de la
pureza de una enzima. La determinación de la cantidad de proteínas
presentes se puede realizar mediante diferentes métodos. Los más precisos
son los que determinan los enlaces peptídicos que existen en las moléculas
de proteínas (Lowry, Bradford). Otros determinan elementos de naturaleza
proteica, como el nitrógeno orgánico (Kjeldahl).
• Actividad molar o molecular  número de unidades de actividad
por micromol de enzima.
La Comisión de Nomenclatura Bioquímica sugirió una unidad alternativa,
pero rara vez utilizada, que es el katal (SI), definido como la cantidad de enzima
capaz de provocar la transformación de 1 mmol de sustrato por segundo en
condiciones específicas.
Debido a la dificultad de solubilidad de algunos sustratos y a la gran
variación de condiciones óptimas entre las enzimas, se utilizan otros métodos para
medir la actividad enzimática especialmente en la industria, tales como:
• Cambio de viscosidad: Las enzimas como las pectinasas tienen su actividad
determinada reduciendo la viscosidad de una solución de pectina en condiciones
de reacción estándar.
37
• Actividad de la lipasa: es la cantidad de enzima necesaria para producir una
cierta cantidad de ácido graso, determinada por titulación de pH-stat, es decir, el
pH se mantiene constante durante un cierto período de tiempo con la adición de
refresco. Se pueden utilizar dos patrones: ésteres solubles o aceite de oliva
(aceite de oliva) en una emulsión estandarizada.
38
• Oxidaciones con formación de H2O2  la catálisis de la oxidación de
la glucosa, realizada por la acción de la glucosa oxidasa, produce ácido glicónico
y peróxido de hidrógeno. Así, el H2O2 formado está estequiométricamente
relacionado con la acción catalítica de la enzima sobre la molécula de glucosa.
En otras palabras, una forma de medir la actividad de la glucosa oxidasa es
determinando la cantidad de H2O2 producida, lo que se puede hacer agregando
leucobases al sistema de reacción. A medida que se produce H2O2, reacciona
con leucobases (incoloras), teniendo una peroxidasa como catalizador y
formando un tinte. La intensidad del color obtenido es proporcional a la cantidad
de H2O2 que reaccionó, que a su vez es proporcional a la cantidad de glucosa
oxidada.
• Fuerza del cuajo: o unidad Soxhlet / mL, se define como la cantidad de mililitros
de leche que se pueden coagular en 40 minutos a 35 ° C.
2.5.2 - Análisis cuantitativo de la actividad enzimática

El análisis cuantitativo se puede realizar de varias formas:
• Pruebas directas: medición directa de la concentración del sustrato o producto
en función del tiempo.
• Ensayos indirectos: cuando la concentración del sustrato y el producto están
cerca, la generación del producto se puede acoplar a otra reacción no
enzimática, que produce una señal más conveniente.
• Ensayos acoplados: la reacción enzimática de interés se acopla con una
segunda reacción enzimática, que puede medirse convenientemente, usando
como ejemplo la reacción de glucosa oxidasa mencionada anteriormente.
Estas pruebas también pueden ser continuas (cinéticas), de tiempo fijo
(punto final) o de tiempo variable.
En las pruebas cinéticas se monitorea continuamente la concentración del
sustrato o producto en función del tiempo, donde si [S0]> 10KM, la tasa inicial será
proporcional a [E]; si [S0] <0.1KM, entonces la velocidad inicial será proporcional a
[S0].
Las pruebas de tiempo fijo miden la variación en la concentración de sustrato
o producto que ocurre durante un largo período de tiempo, siendo más utilizadas
para la cuantificación de sustratos.
Los ensayos que varían en el tiempo son relativamente poco comunes y se
utilizan para la cuantificación de enzimas. Estas pruebas controlan el tiempo
necesario para generar una determinada concentración de producto. La
concentración de enzima está inversamente relacionada con el tiempo requerido
para que ocurra la reacción.
En un análisis cuantitativo, es importante saber cómo diferenciar el límite de
detección de la sensibilidad del ensayo.
El límite de detección describe la cantidad mínima detectable de analito, que
es la cantidad necesaria para generar una señal que es 2 o 3 veces la desviación
estándar (en magnitud) por encima de la señal obtenida para la solución de reactivo
en blanco (es decir, sin analito).
39
La sensibilidad del ensayo se define como la pendiente de la curva de
calibración de la señal frente a la concentración del analito, es decir, demuestra la
sensibilidad del ensayo a las variaciones en la concentración del analito.
2.5.3 - Técnicas utilizadas

2.5.3.1 - Métodos de detección óptica
Absorbancia (espectrofotometría)
Es un método simple y preciso, donde la medición de la absorción de luz en
el rango ultravioleta y visible se realiza de acuerdo con la ley de Lambert-Beer, que
correlaciona directamente la absorbancia a una longitud de onda dada con la
concentración del analito, como se muestra en la ecuación. 28, donde b representa
la trayectoria óptica, es decir, la longitud de la trayectoria recorrida por la luz
durante su paso a través de la muestra, y la absortividad molar, que es una
constante de especies moleculares específicas a una longitud de onda determinada
en condiciones de temperatura, disolvente y pH fijos. .
LA = antes de Cristo (28)
En esta ecuación, la ley de Lambert-Bier es válida para todas las especies

que absorben luz en concentraciones bajas (menos de 0.1 mM), y pueden ocurrir
otros tipos de desviaciones, como cuando el analito está involucrado en un
equilibrio reversible o cuando se descompone. en solución.
El método espectrofotométrico tiene su sensibilidad y su límite de detección
correlacionados con la absortividad molar; cuanto mayor sea, mayor será la
sensibilidad y menor será el límite de detección del método. Como ejemplo,
podemos mencionar las asas-amilasas que escinden el almidón en glucosa y
sacarosa, las cuales son detectadas por el método DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico),
donde el DNS reacciona con los grupos reductores de glucosa y sacarosa,
generando un cromóforo. grupo, detectable a 540 nm, como se muestra en la
siguiente reacción:
COOH OH COOH OH
OH El OH enzima OH O
+ OH + OH
O
OH OH
Odosnorte EN ELdos OH
Odosnorte NUEV OH
amarillo naranja A
HAMP
SHIRE
dos
Fluorescencia
El uso de espectroscopia molecular fluorescente para cuantificar los
productos de reacciones enzimáticas ha dado como resultado límites de detección
mucho más bajos en comparación con otros métodos ópticos. A bajas
concentraciones de analito, la intensidad de la emisión fluorescente es directamente
proporcional a la concentración, similar al método espectrofotométrico, siendo más
selectivo ya que es necesario utilizar longitudes de onda de excitación y emisión del
40
analito.
41
Como ejemplo, existen algunas proteasas que utilizan una proteína
modificada covalentemente (transferrina) como sustrato con moléculas de
isotiocianato de fluoresceína, que presentan absorbancia a 495 nm y emisión a 525
nm. Con la acción de la proteasa se liberan las moléculas de isotiocianato de
fluoresceína, lo que permite un aumento de la intensidad de emisión en 525 nm.
Bioluminiscencia
Los métodos de bioluminiscencia se basan en la producción de luz durante la
reacción enzimática, pero a diferencia de otros métodos ópticos, la cantidad de luz
medida es transitoria, es decir, durante la velocidad inicial de la reacción enzimática
hay un nivel constante de luz detectada, de baja intensidad, que es luego integrado
en el instrumento durante varios minutos. Y como los fotones son el producto de la
reacción, son proporcionales a la cantidad de sustrato consumido.
Un ejemplo clásico es la luciferasa, que proviene de las luciérnagas, que
actúa como indicador de cualquier reacción enzimática primaria que genere ATP,
catalizando la descarboxilación oxidativa de la luciferina.
norte s norte s
COOH +
O2 + ATP luciferasa O + CO2 + AMP + PPi + h
s norte s norte
OH OH
Nefelometría
También conocido como dispersión de luz, este método consiste en
monitorear el cambio de turbidez en el medio durante la reacción enzimática. En
turbidez baja, la intensidad de la luz dispersa es proporcional a la concentración.
Un ejemplo típico es la lipasa, que hidroliza los lípidos en ácidos grasos,
generando una disminución de la turbidez en los medios acuosos.
2.5.3.2 - Métodos de detección electroquímica
Amperometria
Los métodos amperométricos miden la corriente producida en un electrodo
en respuesta a un potencial aplicado, es decir, generando especies oxidantes o
reductoras durante la reacción enzimática. En soluciones agitadas o no, la corriente
producida es directamente proporcional a la concentración del analito.
Este método se utiliza en reacciones con oxidasas y deshidrogenasas, para
medir la producción de H2O2 y fosfato inorgánico.
Potenciometria
Los métodos potenciométricos tienen una relación logarítmica entre el
potencial medido y la concentración del analito. El más común es el instrumento
"pH-stat", en el que un electrodo de pH sigue la reacción en el consumo o
producción de iones H +. Las variaciones en el pH pueden alterar la actividad
enzimática, por lo tanto, el pH se mantiene mediante la adición de ácido o base, y
esta velocidad de adición del valorante es proporcional a la velocidad de la reacción
enzimática.
42
Otros métodos potenciométricos emplean electrodos para detectar gases,
como NH3 y CO2, o electrodos específicos para iones, como en la reacción de
penicilinasa, que se mide por I- o CN-.
Conductimetria
Este método implica aplicar un voltaje alterno a dos electrodos en solución.
La medida de la magnitud de la corriente alterna es directamente proporcional a la
conductividad de la solución, que está determinada por la fuerza iónica.
Un ejemplo es la ureasa, que al hidrolizar la urea, una molécula neutra, libera
4 iones (2 NH +, HCO43-, OH-) y aumenta la conductividad de la solución. LA
La concentración de tampón para un buen ensayo debe estar entre 5 y 10 mM.
2.5.3.3 - Otros métodos de detección
Análisis radiactivo
Se evalúa cuando el sustrato se marca con un isótopo radiactivo, que se
perderá o transferirá durante la reacción a estudiar. Es un método extremadamente
sensible para el análisis cinético enzimático.
Un ejemplo es el ensayo para determinar la concentración de GTP
(guanosina-5'-trifosfato) y GDP (guanosina-5'-difosfato), que intervienen en la
regulación hormonal, la síntesis de proteínas y la gluconeogénesis.
Análisis manométrico
Se pueden utilizar métodos manométricos, simples o automáticos, para
medir la cantidad total de gas (como NH3 o CO2) producido en una reacción
enzimática. Estos métodos se basan en la ley de los gases ideales, donde el
volumen de gas se mide en función del tiempo y rara vez se utilizan normalmente.
Análisis calorimétrico
La valoración calorimétrica isotérmica se basa en la relación entre la tasa de
calor necesaria para mantener una temperatura constante y el número de moles
convertidos (ecuación 29).
Q = norteHap
dP 1 dQ
= (29)
dt VHap dt
Donde ΔHap es la entalpía molar aparente de la reacción, V es el volumen de
solución, Q es el calor y P es la concentración del producto.
La sensibilidad de este método está directamente relacionada con la entalpía
molar de reacción. Ejemplos de enzimas para determinar parámetros cinéticos
mediante este método son: ureasa, tripsina, hexoquinasa, heparinasa y piruvato
carboxilasa.
43
2.6 - REFERENCIAS
― AMINE, A.; MOHAMMADI, H.; BOURAIS, I.; PALLESCHI, G.; Biosensores basados en inhibición
enzimática para la seguridad alimentaria y el control medioambiental. Biosensores y bioeletrónica, 21,
1405-1423, 2006.
― BELL, G.; HALLING, PJ; MOORE, BD; PARTRIDGE, J.; REES, DG; Comportamiento de los
biocatalizadores en
sistemas de agua baja. Trends in Biotechnology, 13, 468-473, 1995.
Janeiro, 2004.
― CASTRO, MDL; HERRERA, MC; Biosensores y sistemas biosensores basados en inhibición de
enzimas: dispositivos analíticos cuestionables. Biosensores y bioeletrónica, 18, 279-294, 2003.
― COPELAND, RA; Enzimas: una introducción práctica a la estructura, el mecanismo y el análisis de datos,
2ª ed.; Wiley-VCH, Inc.; Nueva York, 2000.
1990.
1996.
― KOSKINEN, AMP; KLIBANOV, AM; Reacciones enzimáticas en medios orgánicos, Blackie
Academic & Professional, Glasgow, 1996.
― LESKOVAC, V.; Cinética enzimática integral; Kluwer Academic Publishers, Nueva York, 2004.
― MARANGONI, AG; Cinética de enzimas: un enfoque moderno; Wiley-Interscience; Nueva Jersey, 2003.
― MIKKELSEN, SR; CORTÓN, E.; Química bioanalítica, John Wiley & Sons, Inc.; Nueva Jersey, 2004.
― MILLER, GL; Uso de reactivo de ácido dinitrosalicílico para la determinación de azúcares reductores.
Química analítica, 31 (3), 426-428, 1959.
― NELSON, DL; COX, MM; OSGOOD, M.; Principios de bioquímica de Lehninger, 3a ed., WH
Freeman, Nueva York, 2000.
― ROBERTSON, JG; Base mecanicista de fármacos dirigidos a enzimas. Bioquímica, 44 (15), 5561-
5571, 2005.
― VOET, D.; VOET, JG; PRATT, CH; Fundamentos de bioquímica, John Wiley & Sons, Nueva York,
1999.
http://www.ciagri.usp.br/~luagallo/Enzimas2.htm
44
CAPÍTULO 3 - PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS
Comercialmente, una enzima puede ser una preparación que, además de la

proteína enzimática, contiene cantidades variables de sustancias contaminantes
proteicas y no proteicas y conservantes.
Las enzimas se producen a partir de células donde cumplen su función
metabólica. Las células son, hasta el día de hoy, la única forma de obtener estos
biocatalizadores, ya que la fabricación de enzimas por síntesis química es
sumamente compleja. Las enzimas pueden provenir de tejidos de organismos
diferenciados (células animales y vegetales) y microorganismos.
En la Figura 1 se puede observar un esquema general de producción de
enzimas, del cual se distinguen 4 etapas, a saber:
• Obtención: fermentación, en el caso de enzimas microbianas; producción
agrícola o cultivo “in vitro”, en el caso de enzimas tisulares;
• Recuperación: separación, extracción y concentración;
• Purificación: varía según el tipo de catalizador enzimático a purificar; puede
incluir varias etapas o no existir;
• Formulación: normalización del producto enzimático.
Figura 1 - Esquema generalizado de producción de enzimas; (---) enzima intracelular, () enzima extracelular.
Solo el primer paso depende del origen de la enzima, y los otros pasos son
similares cuando se trata de enzimas producidas por fermentación o de tejidos.
45
3.1 - OBTENER PASO
3.1.1 - Enzimas tisulares

A pesar del éxito de las enzimas microbianas, todavía se produce un número
importante de enzimas de tejidos animales y vegetales para la industria.
Las enzimas tisulares requieren un proceso de alteración celular para su
recuperación. La extracción, a diferencia del caso de las enzimas microbianas
intracelulares, es una operación simple con una baja incidencia en los costos de
producción. Las células animales, que carecen de pared celular, pueden romperse
fácilmente mediante esfuerzos de corte moderados o por choque osmótico. Las
células vegetales, provistas de una pared celular rígida de naturaleza celulósica,
son muy sensibles a los esfuerzos de corte y pueden romperse eficientemente en
molinos convencionales.
La producción a gran escala de enzimas en cultivos de tejidos artificiales es,
por el momento, poco factible, dada la complejidad del sistema y el alto costo de los
medios de cultivo necesarios. Sin embargo, no se puede descartar el uso de esta
tecnología para la producción de enzimas sofisticadas de alto valor agregado, en
cuyo caso es posible anticipar una fuerte competencia con la producción por
fermentación utilizando microorganismos genéticamente modificados.
Por otro lado, se han realizado importantes avances en el diseño de equipos
para la propagación de células así como en métodos de inmovilización, con
posibilidad de crecimiento de células adheridas a soportes, en cuyo caso se podrán
utilizar tecnologías similares a las de fermentación con microorganismos. ser
utilizado.
3.1.1.1 - Principales enzimas de origen animal

Los tejidos animales generalmente se secan y se trituran en partículas
pequeñas y finas utilizando molinos u homogeneizadores. Las enzimas se extraen
en una solución acuosa o tampón adecuado y los residuos insolubles se eliminan
por filtración o centrifugación. A menudo se agrega tierra de diatomeas como
coadyuvante de filtración para el extracto o la solución de enzima cruda. Las
principales enzimas que se encuentran en los tejidos animales son: pancreatina,
renina, pepsina y catalasa.
Pancreatina
Este se prepara a partir del páncreas de cerdo y tiene actividad amilolítica,
proteolítica y lipolítica. Las enzimas preparadas a partir del páncreas de ternera o
cordero no contienen casi amilasa.
Anteriormente, se usaba para realzar el aroma y el sabor de los quesos, pero
fue reemplazado por proteasas y lipasas microbianas, y actualmente se usa como
ayudas digestivas.
La siguiente es una tabla resumen de la producción de pancreatina.
46
El páncreas fresco o congelado se tritura con tejido duodenal.
La tripsina presente en el duodeno inicia la activación de enzimas.
La masa se seca en secadores al vacío y se desgrasa mediante extracción con éter de petróleo.
Las escamas se secan en secadores al vacío para eliminar el disolvente y se muelen hasta obtener un
polvo fino tamizado.
Renina
Esta enzima está presente en el jugo gástrico del cuarto estómago del
ternero, que solo se alimenta con leche, porque por el contrario puede existir la
presencia de pepsina. El extracto de renina cruda contiene la enzima activa y un
precursor inactivo (prorrenina). La adición de ácido al extracto facilita la conversión
de la prorrenina en renina, permitiendo alcanzar la máxima actividad. El extracto
activado puede o no clarificarse con alumbre antes de la filtración, y finalmente se
estandariza con respecto a la actividad, concentración de sal, pH y color.
A menudo se agrega gelatina para ayudar a la completa precipitación y
recuperación de la renina de la solución.
La renina se utiliza en la preparación de quesos italianos, principalmente
derivados de la leche de cabra y oveja, y en la preparación de budines.
Pepsina
Esta enzima se obtiene de la mucosa del estómago del cerdo, donde
aparece en forma inactiva (pepsinógeno), convertida en forma activa por el pH
ácido del estómago. La pepsina se utiliza como ayuda digestiva y para la
producción de hidrolizados de proteínas.
A continuación, se muestra una tabla resumen de la producción de pepsina.
La mucosa se corta en rodajas y se mezcla con ácido clorhídrico o fosfórico (pH 2,0) durante 16 horas a
temperatura ambiente.
La temperatura se eleva a 40-45 ° C durante 1 h (el pepsinógeno se convierte en pepsina)
El tejido no digerido se filtra y se seca en un secador de vacío a 40 ° C
La pepsina de alta pureza se obtiene por concentración de filtrado al vacío, enfriamiento a 5-8 ° C
y adición de etanol para alcanzar una concentración del 60%.
Filtración y secado a baja temperatura
47
Catalasa
La catalasa se obtiene del hígado y la sangre de animales, como el buey y el
cerdo, favoreciendo la degradación del peróxido de hidrógeno. También puede
actuar como peroxidasa, permitiendo la degradación de alcoholes, nitritos y fenoles.
El siguiente es un esquema resumido de la producción de catalasa.
Los hígados se maceran y se agitan en una solución acuosa al 25% con acetona a 25 ° C.
Se aumenta la concentración de acetona al 35%, se filtra la masa obtenida y se descartan los sólidos
Se agrega más acetona (50%), precipitando la catalasa, recuperada mediante filtración o centrifugación
El precipitado se puede secar o extraer en una solución acuosa agitada durante 1 h, eliminando el material
insoluble.
La catalasa líquida se somete a filtración estéril y se comercializa, con o sin estabilizador (glicerol).
3.1.1.2 - Enzimas de origen vegetal

Las enzimas de origen vegetal se obtienen en gran parte como subproductos
de la actividad agrícola de la que son fuertemente dependientes, y las principales
son: papaína, bromelina, ficina, cardosina y malta.
Papaína
Obtenido del látex del fruto de la papaya verde (Carica papaya). Son
sensibles a la oxidación por el aire y se inactivan fácilmente. Por esta razón, la
papaína comercial no se almacena durante períodos prolongados y, a menudo,
pierde su actividad en unos pocos meses. Por otro lado, las hojas, los tallos, los
pétalos de las flores y la corteza, a excepción de la raíz, contienen cantidades
suficientes de la enzima papaína, que puede extraerse como un jugo exprimido de
estos componentes y luego purificarse. La adición de agua y cloruro de sodio a la
enzima constituye una preparación llamada papaína cruda.
La papaína se utiliza para clarificar la cerveza, ablandar la carne y como
ayuda a la digestión para las personas que tienen una deficiencia de enzimas
proteolíticas.
Ficina
La ficina también es una proteasa similar a la papaína y está presente en el
látex de las especies de Ficus. Obtenerlo no es económicamente viable, ya que se
requiere una gran cantidad de materia vegetal para producir una cantidad
relativamente pequeña de ficina, es decir, la enzima representa solo el 1% del peso
fresco de la fruta. La separación de la ficina del látex se puede realizar mediante
cromatografía.
48
Cardosina
La cardosina es una proteasa diferente a las demás de origen vegetal,
siendo del tipo aspártico, que presenta unas condiciones óptimas en pH ácido, por
lo que se le denomina cuajo vegetal. Esta enzima está presente en las flores de
cardo (Cynara cardunculus), que es similar a las alcachofas (Cynara scolymus),
pero que contiene una mayor cantidad de enzima. La extracción de la enzima se
produce con la adición de agua a la muestra seca bajo agitación, filtración con lana
de vidrio, centrifugación y diálisis del extracto. Ampliamente utilizado en la
producción de queso de oveja en Portugal.
Bromelina
La bromelina es una cisteína proteasa obtenida del tallo y la fruta de la piña
(Ananas comosus). Su aplicación es similar a la de la papaína. La bromelina
comercial se obtiene del tallo de la piña después de triturar, prensar, filtrar y
precipitar (con la aplicación de: sulfato de amonio, metanol, isopropanol o acetona)
del jugo de este tallo.
Malta
De la malta de cebada y otros cereales, es posible extraer una amplia
variedad de enzimas, tales como: proteasas, lipasas y hemicelulasas (sintetizadas
durante la germinación del grano), oxireductasas y amilasas ( -amilasa formada en
el grano durante la germinación y, -amilasa presente en el grano antes de la
germinación).
Después de la germinación, se realiza el secado, para que la actividad
biológica del grano se detenga y también para reducir el contenido de humedad a
niveles ideales de almacenamiento, que varían del 50% al 23%, y luego aumenta
gradualmente la temperatura de 60 a 70 ° C, reduciendo el contenido de humedad
al 12%, y un paso final de secado, alcanzando los 92 ° C, produciendo el típico
aroma a malta, imprescindible para las bebidas.
3.1.2 - Enzimas microbianas

La tecnología para la propagación de células microbianas en condiciones
controladas se encuentra en un alto nivel de desarrollo y constituye una de las
áreas fundamentales de la ingeniería de bioprocesos.
Desde la perspectiva de su aplicación comercial, las bacterias, los hongos
filamentosos y las levaduras son los microorganismos más significativos, los más
importantes de los cuales se utilizan en la producción de enzimas extracelulares
industriales son del género Bacillus y Aspergillus, que en conjunto representan el
80-85% de el mercado de las enzimas extracelulares.
3.1.2.1 - Etapa aguas arriba

La Figura 4 muestra el conjunto de procesos necesarios para la producción
de enzimas comerciales, considerando un proceso fermentativo, y los procesos
upstream de fermentación (“upstream”) y downstream.
49
Figura 4 - Diagrama de flujo del proceso de producción de enzimas comerciales a través de microbios
Los procesos de fermentación aguas arriba son pocos en el caso de la

producción de enzimas. Uno de los más importantes es el de preparación del
inóculo, donde puede ser de un matraz agitado inoculado con un cultivo madre
liofilizado, para luego ser propagado hasta la fase de crecimiento exponencial
proceder a la inoculación en un fermentador de 100 a 500L de capacidad
conteniendo el medio de cultivo similar al de producción, para la propagación celular
con adaptación al carbono y fuente de energía.
Transcurrido un tiempo adecuado, este cultivo se inocula en el fermentador
principal. Se observan controles en transferencias para identificar posible presencia
de contaminación o proliferación de mutantes menos eficientes. La cantidad de
inóculo debe ser suficientemente grande, ya que la esterilización a escala industrial
puede no ser absoluta y el microorganismo productor debe competir y eliminar
cualquier contaminante. Esta cantidad de inóculo puede variar del 1 al 10% (v / v) y
su cantidad tiene un marcado efecto sobre la producción de la enzima.
3.1.2.2 - Cinética de producción de metabolitos

Las enzimas actúan de acuerdo con su función metabólica y pueden tener el
carácter de un metabolito primario o secundario. La mayoría de las enzimas
comerciales son enzimas degradativas, asociadas con el catabolismo y tienen las
características de metabolitos primarios. Esto no es absoluto ya que, dependiendo
de la composición del medio de cultivo, se pueden producir enzimas catabólicas
parcial o totalmente disociadas del crecimiento.
Existen varios modelos de cinética de producción de metabolitos por
fermentación, entre los que destaca, por su sencillez y validez, el de Luedeking &
Piret (ecuación 1).
dP dX + X
= (1)
dtdt
El primer término ( dX / dt) representa la producción asociada con el
crecimiento y correlaciona linealmente la velocidad de producción con la tasa de
crecimiento, mientras que el término ( X) representa la producción no asociada
con el crecimiento y correlaciona la velocidad de producción con el nivel de
concentración celular.
50
Para metabolitos primarios, y, para metabolitos secundarios, .
Las situaciones intermedias, donde y son diferentes de cero, son frecuentes en
la práctica. Tales son los casos de-amilasa Bacillus subtilis, glucoamilasa de
Aspergillus niger y lactasa de Escherichia coli.
La optimización de la producción de enzimas a partir de microorganismos
depende de varios factores interrelacionados. Esto significa, en términos prácticos,
que una enzima no se sintetiza necesariamente durante parte del ciclo de
crecimiento. Por ejemplo, algunas proteínas se excretan durante la fase de
crecimiento activo (exponencial) del organismo, mientras que otras aparecen solo
en la fase estacionaria (Figura 2).
Figura 2 - Síntesis de enzimas en función del crecimiento microbiano.

Una complicación adicional se encuentra con el hecho de que una
determinada enzima solo se produce cuando el microorganismo está creciendo en
un medio cuya composición es adecuada. Así, por ejemplo, la presencia de un
compuesto simple, como D-glucosa, puede suprimir la síntesis de una enzima
determinada.
Inducción
Para comprender la causa de la variabilidad existente con respecto al
momento de inicio y la magnitud de la síntesis de una enzima, es necesario conocer
algunos aspectos del control genético de la producción enzimática. Esencialmente,
hay dos clases identificables de enzimas. El primer grupo comprende las llamadas
enzimas constitutivas; desde el punto de vista numérico, estos se encuentran en
una proporción minoritaria en relación al total. Sin embargo, estas son enzimas que
están involucradas con los aspectos centrales del metabolismo. Estas enzimas se
producen de forma continua independientemente de la presencia o no de sustrato.
El segundo grupo, mucho más amplio, comprende las enzimas inducidas; estos se
sintetizan en proporciones bajas pero significativas, hasta que un sustrato derivado
de su degradación induce un gran aumento de la síntesis enzimática.
51
Represión
Ya sea que la enzima sea constitutiva o inducida, existe un mecanismo de
control posterior que también puede ser eficaz. En presencia de una fuente de
carbono rápidamente asimilable como la D-glucosa, se suprime la síntesis de
muchas enzimas. La lógica de este fenómeno es que el organismo puede utilizar la
glucosa sin tener que gastar energía en la síntesis de enzimas útiles para degradar
otras fuentes de carbono más complejas. La represión por un catabolito es un
fenómeno que ocurre comúnmente en los microorganismos y que afecta a muchas
enzimas constitutivas e inducidas. Por este motivo, puede resultar muy difícil
deducir si la síntesis transitoria de una enzima es el resultado de una inducción, una
represión o una combinación de ambos mecanismos. La síntesis de ciertas enzimas
puede ser suprimida por la presencia de compuestos que contienen azufre,
nitrógeno y otros. Generalmente, es más probable que una forma concreta de
represión afecte a las enzimas involucradas en el metabolismo del compuesto que
contiene el elemento relevante. Por ejemplo, la síntesis de la proteasa extracelular
de Bacillus subtilis se suprime por la presencia en el medio de cultivo de ciertos
compuestos que contienen nitrógeno, como el glutamato y el aspartato.
3.1.2.3 - Medios de cultivo
Los medios de cultivo se formulan utilizando compuestos químicamente

conocidos (medio sintético) o materias primas naturales. Como el medio sintético es
más caro, la opción desde el punto de vista industrial se hace con medios que
contienen cantidades apreciables de materias primas de la agroindustria.
En el caso de los procesos industriales, por razones económicas, es común

formular los medios de cultivo utilizando sustancias naturales complejas (melaza,
licor de arroz, maíz y otros cereales, suero, hidrolizados de proteínas, harinas de
almidón y residuos celulósicos), en lugar de compuestos químicos bien definidos.
Fuentes de Carbono
La fuente de carbono a utilizar dependerá de la capacidad metabólica del
microorganismo, sin embargo, lo habitual es utilizar un carbohidrato que ingrese a
las vías metabólicas centrales, generalmente en forma de glucosa.
Fuentes de nitrógeno
El nitrógeno se suele administrar como sal de amonio, incluso cuando
existen microorganismos que pueden asimilar formas oxidadas (nitratos) y otras que
requieren nitrógeno orgánico. Otras fuentes de nitrógeno empleadas son: harina de
pescado, gelatinas, licor de maíz y soja.
52
Otras fuentes
El azufre y el fósforo se agregan como sales inorgánicas (sulfatos y fosfatos).
Hay elementos de menor importancia cuantitativa, oligoelementos, como K +, Ca2
+, Na +, Fe2 +, Mg2 +, Zn2 + y Co2 +, que cumplen sus funciones metabólicas
indispensables y se administran en pequeñas dosis como sales inorgánicas. En el
caso de la producción de enzimas, algunos de estos elementos pueden adquirir
especial relevancia si son cofactores de la enzima en cuestión. Ejemplos: Ca2 + en
el caso de amilasa; Co2 + en el caso de la glucosa isomerasa.
El hidrógeno requerido se satisface a través del agua y la fuente de carbono
utilizada, y siempre está en exceso. Una situación similar es la del oxígeno, que
además es aportado por el aire burbujeado en fermentaciones aeróbicas, teniendo,
en este caso, el papel de aceptor final de electrones en el proceso de oxidación del
sustrato (respiración).
Además de los requisitos elementales mencionados anteriormente,
dependiendo de la herencia genética de la célula, puede ser necesario agregar
ciertos compuestos específicos (vitaminas, factores de crecimiento, aminoácidos y
micronutrientes - extracto de levadura y harina de semillas oleaginosas), si no es
posible de sintetizarlo. o compuestos que favorezcan la excreción (tensioactivos),
en el caso de las enzimas extracelulares.
Los mecanismos de control que operan sobre la síntesis enzimática
(inducción y represión catabólica) deben ser considerados en la formulación del
medio, teniendo en cuenta la presencia de inductores, en el caso de la producción
de enzimas inducidas, (ej. Almidón para amilasa, urea para ureasa, xilosa a xilosa
isomerasa), y la eliminación de sustratos que causan inhibición en el caso de
cultivos discontinuos.
3.1.2.4 - Elección de microorganismos

El agente debe ser productor de la enzima de interés en alta concentración y
con actividad. Debe ser estable, no patógeno y fácil de manipular (separación del
medio fermentado).
3.1.2.5 - Sistemas de cultivo

La producción de enzimas a escala industrial se realiza principalmente
mediante fermentación sumergida, aunque en los países orientales existe una
tradición establecida de utilizar fermentación semisólida.
Cultivo de superficie
El cultivo en superficie, tradicional y ampliamente utilizado en Oriente para la
producción de enzimas y otros metabolitos, presenta dificultades en el control
operativo y sus principales desventajas se atribuyen a los mayores riesgos de
contaminación, los requerimientos de espacio y los menores rendimientos. A pesar
de estas dificultades, ofrece importantes ventajas en relación a la transferencia de
oxígeno y la recuperación de productos, además de los avances tecnológicos que
paulatinamente se están incorporando a este proceso, lo que puede hacerlo
interesante para países que cuentan con residuos agroindustriales de bajo costo.
53
La fermentación superficial es esencialmente un proceso por lotes y la
principal tecnología de fermentación superficial para la producción de enzimas es la
fermentación sólida o semisólida. Aunque la producción por esta vía se considera
minoritaria, se utiliza para producir a escala comercial celulasas, amilasas fúngicas,
pectinasas, proteasas fúngicas y lipasas. La mayoría de estos procesos se
desarrollaron en Japón, utilizando hongos filamentosos del género Aspergillus. Sin
embargo, ha habido un interés creciente en la exploración de este sistema de
producción de enzimas, no solo con hongos filamentosos, sino también con otros
tipos de microorganismos. Recientemente, se ha demostrado la viabilidad técnica y
económica de producir-amilasa Fermentación bacteriana en estado sólido con
salvado de arroz como sustrato de soporte.
Cultivo sumergido
En las técnicas de cultivo sumergido, predominantemente industrialmente, la
operación se puede realizar por lotes, alimentados por lotes o en forma continua.
Este tipo de proceso se ha beneficiado de los avances en instrumentación y control
de procesos y es extremadamente adecuado para el cultivo de microorganismos
recombinantes, que se han utilizado cada vez más para la producción de enzimas.
El cultivo por lotes sumergido sigue siendo el sistema más utilizado en la
producción de enzimas en la actualidad. Dado que la cinética puede estar asociada
o no al crecimiento microbiano, es fundamental conocerla para detectar el punto de
mayor estabilidad.
Algunas enzimas son marcadamente inestables después de su etapa de
producción y aún se están analizando las posibles causas de este fenómeno
(Figura 3). En cuanto al efecto de las variables operativas más relevantes, el pH y la
temperatura, suele darse el caso de que exista un compromiso entre los valores
óptimos para la producción y el crecimiento. Este hecho se puede ilustrar con la
producción de celulasa de Trichoderma reesei en un medio de cultivo donde el pH
óptimo de crecimiento es 4.8, mientras que el óptimo de producción es 3.5. El
problema se resuelve trabajando en condiciones intermedias (pH 4.0 a 4.5).
Otra estrategia sería realizar cambios programados en pH y temperatura,
obteniendo así importantes incrementos en la productividad del sistema. En el caso
de enzimas no asociadas al crecimiento, es posible establecer un cultivo en dos
etapas, una de crecimiento y otra de producción, ajustando las variables operativas
a los valores óptimos correspondientes a cada etapa. Las fermentaciones
discontinuas se realizan generalmente en fermentadores con una capacidad de
10.000 a 100.000 L, provistos de camisas o serpentines (sistemas de calefacción y
refrigeración) y tienen una duración media de 30 a 150 horas.
54
Figura 3 - Cinética de producción de lotes de Trichoderma reesei en lotes, que muestra la inestabilidad de
la fracción de endoglucanasa.
El nivel de oxígeno disuelto también puede afectar la producción de enzimas

debido a su efecto sobre la tasa de crecimiento del cultivo. En el caso de enzimas
ligadas metabólicamente al oxígeno, como la galactosa oxidasa, catalasa y
superóxido dismutasa, se muestra que la actividad específica aumenta
notablemente con la concentración de oxígeno disuelto.
Una variación del sistema de cultivo por lotes es el sistema de lotes
alimentados donde, después de un paso por lotes, el cultivo comienza a alimentarse
de forma continua o intermitente hasta alcanzar el volumen operativo final dentro
del reactor. Esta forma de cultivo es sin duda la más utilizada para la producción
comercial de metabolitos. Este sistema ofrece claras ventajas sobre el sistema de
lotes tradicional cuando se desea ejercer algún control sobre la tasa de crecimiento
específica del microorganismo. El cultivo por lotes alimentados se logra
manipulando la corriente de alimentación y controlando así la disponibilidad de
nutrientes dentro del fermentador. Por tanto, esta forma es adecuada para la
producción de metabolitos secundarios, metabolitos sujetos a inhibición por una alta
concentración de sustrato y, sobre todo, en el caso de metabolitos sometidos a
represión catabólica por sustratos altamente metabolizables. Dado que este
fenómeno depende de la tasa de metabolismo del sustrato, es posible utilizar
sustratos represivos. Esta situación es aplicable a la mayoría de las enzimas de
interés comercial.
El cultivo continuo es un sistema en el que la población microbiana se
mantiene en etapas de crecimiento por períodos prolongados, agregando nutrientes
y removiendo el caldo fermentado de manera continua. El cultivo, si se opera en
estado estacionario, debe permanecer en un estado fisiológico definido, que, en
principio, puede ser el de máxima productividad en relación con el metabolito que
se va a producir. En este caso, también es posible manipular la tasa de crecimiento
a través de la tasa de alimentación.
55
Aunque el cultivo continuo es una herramienta importante para la
investigación básica y ofrece ventajas teóricas y operativas sobre los sistemas de
cultivo por lotes, su aplicación industrial en la producción de enzimas y otros
metabolitos se reduce. Esto se debe fundamentalmente a la mayor complejidad de
los equipos y su funcionamiento, la baja concentración del producto obtenido (incide
negativamente en los costes de recuperación) y los mayores peligros de
contaminación y desarrollo de mutantes por largos periodos de funcionamiento.
El parámetro de control más representativo para determinar el final de la
fermentación es la actividad enzimática. Sin embargo, a veces lleva mucho tiempo
determinarlo, lo que resulta en tiempos de respuesta prolongados. En este caso, las
variaciones en otros parámetros del proceso, como el pH y el oxígeno disuelto, se
pueden utilizar para caracterizar el final del proceso de fermentación.
Actualmente, el desarrollo de técnicas automatizadas para la determinación
de la actividad, ha permitido definir rápidamente el final del proceso, proporcionando
ganancias de productividad. Sin embargo, no solo la medición de la actividad
enzimática puede no ser suficiente para determinar el final de un proceso de
fermentación, otros factores como las características del caldo (para promover la
recuperación eficiente de la enzima) y la duración del ciclo operativo (para un mejor
uso). de la planta industrial), también pueden ser determinantes para la
optimización del tiempo de fermentación.
3.1.3 - Fermentación con microorganismos modificados

genéticamente
Es posible asegurar que la mayoría de las enzimas producidas
comercialmente, hoy en día, provengan de microorganismos que son producto de
programas de mejoramiento genético. La mayoría de estos microorganismos son
mutantes superproductores obtenidos mediante programas clásicos de mutación y
selección.
Sin embargo, la posibilidad de producir enzimas con microorganismos
manipulados por técnicas modernas de recombinación genética ha sido
intensamente estudiada en los últimos años. Dentro de ellos, la tecnología
denominada clonación genética, clonación molecular o ADN recombinante ofrece
las perspectivas más interesantes. La técnica consiste en obtener por síntesis
química, por biosíntesis o por purificación de una fuente natural, un fragmento de
ADN que codifica la síntesis de una determinada enzima e introducir este fragmento
a través de un vector (plásmido o fago - Figuras 5 y 6) en la célula huésped. donde
el código genético se reproducirá y expresará. Las enzimas, al igual que las
proteínas, son productos genéticos primarios, lo que hace que su producción sea
muy atractiva. A través de él puedes lograr:
• producir enzimas de organismos superiores en sistemas microbianos;
• transferir la capacidad productiva a una cepa más adecuada desde el punto de
vista sanitario o económico;
• mejorar el nivel de producción y la pureza de la enzima producida.
56
Actualmente, el problema de utilizar esta técnica en la producción comercial
no está tanto a nivel de construcción del microorganismo productor, sino a nivel de
estabilidad genética del microorganismo. En la práctica, la reversión a estados
subproductivos o no productivos conspira contra la correcta manipulación de estos
organismos en condiciones de proceso.
Sin embargo, es importante destacar el enorme potencial de esta técnica, ya
que la continuación de la investigación muestra algunos éxitos más significativos en
la producción de enzimas con microorganismos clonados.
Figura 5 - Clonación de ADN en un plásmido vector
57
Figura 6 - Clonación de ADN usando vectores de fagos
La renina es una proteasa de origen animal con alta demanda cuya
sustitución por renina microbiana (de Mucor miehii) fue solo parcial. Su producción
mediante tecnología de ADN recombinante ha sido estudiada por empresas como
Celltex, Genex, Genencor y Codon, algunas de las cuales son capaces de producir
renina con cepas de Escherichia coli, aunque la proteína no se excreta, lo que
complica su recuperación con rendimientos aceptables. Sin embargo, Genecor ha
informado de la producción de renina animal extracelular con cepas de Aspergillus
nidulans. Otros centros describen la producción de renina excretable con cepas de
Saccharomyces sp. y Kluyveromyces sp .. Recientemente, la empresa holandesa
Gist-Brocades introdujo en el mercado la renina animal producida por cepas
clonadas de Kluyveromyces marxianus.
En cuanto a la viabilidad de utilizar esta técnica para producir enzimas
sofisticadas a partir de organismos superiores en sistemas microbianos, podemos
destacar la producción de uroquinasa, de alto costo y de interés como agente
trombolítico, con cepas recombinantes de Escherichia coli.
58
3.2 - PASOS DE RECUPERACIÓN
Los medios de fermentación son mezclas complejas que contienen productos
extracelulares (solubles e insolubles), productos intracelulares, fragmentos
celulares, microorganismos y sustratos intactos u otros componentes no convertidos
en producto. Debido a la diversidad de productos biotecnológicos obtenidos en los
diferentes procesos de fermentación, el espectro de métodos de separación que se
pueden utilizar es muy amplio.
Los pasos de recuperación (extracción, rotura celular, etc.) y purificación
permiten la eliminación de sustancias tóxicas y / o metabolitos indeseables y
aportan las características adecuadas al producto a comercializar.
Además, las operaciones que siguen al proceso fermentativo, operaciones
“dowstream”, para la extracción y purificación de enzimas dependen de la ubicación
de la enzima de interés (intra o extracelular). La producción de preparaciones
enzimáticas intracelulares es más compleja, ya que involucra las etapas de
disrupción celular y posterior separación de constituyentes intracelulares.
En algunas situaciones, el caldo fermentado sin células, sin procesamiento
adicional, se comercializa directamente. Sin embargo, en la mayoría de las
situaciones, la enzima de interés se recupera del caldo fermentado o de la masa
celular y se purifica hasta cierto punto, como en el caso de las enzimas para uso
analítico o farmacéutico.
Por lo general, un proceso de separación y / o purificación comienza a partir
de una suspensión diluida y se intenta producir un compuesto altamente purificado,
con estos procesos posteriores que involucran pasos secuenciales similares:
• eliminación de material insoluble
• separación de productos
• purificación y pulido (generalmente asociado con la cristalización)
3.2.1 - Separación
Las principales operaciones unitarias empleadas para la eliminación de
material insoluble, la separación sólido-líquido, son la filtración y la centrifugación,
mientras que para la separación del producto, se suelen utilizar la adsorción y la
extracción con disolvente. En los procesos más actuales, estas dos etapas se han
combinado convenientemente en una sola etapa. Hay un gran aumento en la
concentración del producto en esta etapa. Sin embargo, es solo durante la
purificación que su calidad aumenta sustancialmente, ya que los procesos utilizados
son altamente selectivos, eliminando impurezas con propiedades físicas y químicas
similares.
En el caso de las enzimas extracelulares, al final del proceso de
fermentación, el jugo se enfría a unos 5 C, para asegurar las condiciones de
estabilidad del producto y evitar el crecimiento de microorganismos contaminantes.
El pH generalmente se ajusta al valor de rendimiento óptimo de la enzima
producida.
59
Los hongos filamentosos se separan fácilmente mediante centrifugación, sin
embargo, las bacterias y levaduras pueden requerir una floculación previa con
agentes convencionales (sulfato de aluminio, cloruro de calcio) o polielectrolitos.
Dicho método es eficaz y económico y permite realizar la centrifugación en equipos
menos sofisticados. La filtración también es una alternativa, que se realiza con la
adición de coadyuvantes de filtrado, en filtros prensa o filtros rotativos de vacío.
En el caso de muchas enzimas hidrolíticas de origen microbiano, la proteína
se excreta en el medio de cultivo y se separa de las células por centrifugación, que
es el único paso necesario. Esta técnica es particularmente adecuada en procesos
con bacterias grampositivas como Bacillus subtilis (productora de la proteasa
subtisilina) y en menor medida con bacterias gramnegativas como Klebsiella
pneumoniae (productora de la pululanasa). La presencia de una membrana externa
en los microorganismos gramnegativos puede provocar complicaciones y, quizás,
solo una liberación parcial de la enzima en el medio.
3.2.2 - Extracción
En algunas levaduras, como Kluyveromyces marxianus, la enzima se puede
ubicar en el exterior de la membrana celular, pero no se libera en el medio de
crecimiento. A menudo, la liberación de la enzima implica la destrucción parcial o
total de la célula (ejemplo: autólisis de las células a 50oC durante 14 horas).
La obtención de enzimas intracelulares a partir de microorganismos requiere
técnicas de lisis celular, que abarcan métodos físicos, químicos y enzimáticos.
• Métodos enzimáticos: se basan en la digestión de la pared microbiana
catalizada por enzimas, tales como: lisozima (bacteria), glucanasa, tripsina y
proteasa (levaduras). Se utilizan poco a escala industrial debido a los elevados
costes de las preparaciones enzimáticas.
• Metodos quimicos:
 Tratamiento base (NaOH): tiene aplicaciones limitadas a
situaciones en las que la enzima es tolerante a valores altos de pH;
Choque osmótico: variación en la
concentración de soluto presente
en el tampón. El uso de esta
técnica puede eliminar pasos de
purificación adicionales, ya que el
extracto resultante tiene poca
contaminación. Sin embargo, no
se puede utilizar en bacterias
Gram positivas, ya que tienen una
alta presión osmótica interna;
Tratamiento con detergentes:
como sales biliares, lauril sulfato
de sodio, dodecilsulfato de sodio y
tritón, actúan en condiciones de
baja forma iónica disolviendo la
membrana y liberando los
60
componentes intracelulares,
combinando las lipoproteínas de la
membrana para formar micelio; ej
.: Tween, SDS (dodecilsulfato de
sodio);
 Tratamiento con disolventes
orgánicos: alcohol isopropílico, etanol.
61
• Métodos mecánicos
Congelación / descongelación:
basado en la formación de cristales
de hielo intracelulares, es un
proceso largo y difícil a gran
escala. Además, las enzimas
susceptibles de congelación
pueden inactivarse;
Rectificado con abrasivos: se
realiza en molinos vibrantes con
esferas de vidrio, siendo muy
utilizado y con un alto nivel de
aceptación, pudiendo operar en
lote o en continuo. Necesita un
sistema de enfriamiento para
absorber el calor generado en el
proceso;
 Cizalla de líquidos a alta presión: paso a través de pequeños orificios
a alta presión. El proceso para que sea eficiente debe realizarse en
múltiples etapas y teniendo cuidado de no elevar la temperatura;
Sonificación: se realiza en aparatos
de ultrasonido que utilizan
frecuencias muy altas, favoreciendo la
rotura de las células por cavitación.
Se usa ampliamente en el laboratorio,
pero no se aplica ampliamente a
escala industrial.
En estos casos, el extracto de enzima contiene muchos componentes
celulares. En particular, las células bacterianas lisadas liberan grandes cantidades
de ácidos nucleicos. Estos ácidos deben precipitarse mediante la adición de sales
de Mn (II), sulfato de estreptomicina, sulfato de protamina o polietilenimina, ya que
al ser solubles dan viscosidad a las soluciones e interfieren en el fraccionamiento
de proteínas y en la posterior separación cromatográfica.
Extracción de enzimas de tejidos animales y vegetales

La extracción de enzimas de tejidos animales es similar a los métodos
utilizados para obtener enzimas intracelulares de levadura. La homogeneización del
tejido seleccionado en una solución tampón adecuada es la técnica más utilizada.
Como segundo paso, se usa la centrifugación diferencial para seleccionar la
subfracción celular apropiada.
Las fuerzas necesarias para destruir la barrera celular de los tejidos
vegetales son tan elevadas que generalmente pueden provocar la desnaturalización
de las enzimas deseadas. Se agrega que muchas verduras contienen compuestos
fenólicos que se oxidan enzimáticamente (polifenoloxidasas) en presencia de
productos formadores de oxígeno molecular que pueden inactivar rápidamente una
gran cantidad de enzimas. Aun así, a través de las plantas se obtienen varias
enzimas útiles, como la bromelina y la papaína.
62
El pH, la fuerza iónica y la composición del medio que se utiliza para la
extracción de una enzima son de gran importancia en este proceso y en las etapas
posteriores de purificación.
3.2.3 - concentración
Aunque a primera vista puedan parecer complejos, los procedimientos de
purificación enzimática pueden reducirse a aplicaciones secuenciales y / o
repetitivas de un número mínimo de métodos simples.
63
Es lógico que las características de las etapas de un proceso de depuración
estén determinadas en gran medida por la naturaleza del producto final y su
aplicación.
Muchos procesos biotecnológicos se volverían antieconómicos si la enzima
fuera completamente pura. Para la mayoría de las aplicaciones, un grado más bajo
de purificación es suficiente, aunque existen algunas actividades contaminantes
siempre que no afecten al sustrato (s), producto (s) o enzima (s) involucrados en un
proceso específico. Sin embargo, existen otras aplicaciones (en medicina clínica,
farmacéutica, análisis específicos, diseño de biosensores, ingeniería genética)
donde es fundamental que las proteínas contaminantes se reduzcan o se eliminen
por completo.
Se debe tener cuidado para que, al pasar de una etapa a otra, se promuevan
cambios mínimos en las condiciones de estabilidad, pH y temperatura. Es
importante recordar que las enzimas son moléculas de alto peso molecular, cuyas
funciones dependen de una estructura altamente ordenada, que se mantiene
mediante un delicado equilibrio entre interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas, con el
agua como solvente.
Es en esta etapa que la calidad del producto aumenta sustancialmente, ya
que los procesos utilizados son altamente selectivos, eliminando impurezas con
propiedades físicas y químicas similares. Tamaño, carga, hidrofobicidad, solubilidad
y actividad biológica son las principales características de las proteínas utilizadas en
la etapa de purificación de proteínas.
Las técnicas de precipitación se consideran rápidas y eficientes para la
concentración de proteínas de interés, siendo utilizadas para eliminar impurezas y
aumentar la actividad específica de la enzima diana. La solubilidad de una enzima
en un disolvente acuoso está determinada por la distribución de las cargas
presentes en determinadas condiciones. Los grupos cargados interactúan con los
iones en la solución y la precipitación puede ser inducida por cambios en el pH
(precipitación isoeléctrica), fuerza iónica (precipitación con sales inorgánicas) y / o
adición de solventes orgánicos o polímeros.
3.2.3.1 - Precipitación isoeléctrica

Existe un pH en el que las proteínas tienen el mismo número de grupos
cargados positiva y negativamente, por lo que la carga neta es igual a cero. Este
punto se denomina punto isoeléctrico, sin migración de moléculas de proteínas
cuando se somete a un campo eléctrico. Por debajo del punto isoeléctrico, las
proteínas se encuentran en forma catiónica y, por encima de éste, en forma
aniónica.
Cuanto mayor es el carácter iónico de una proteína, mayor es su tendencia a
la solvatación. Un análisis de la solubilidad de las proteínas en relación al pH
(Figura 7), muestra que en valores alejados del punto isoeléctrico, la solubilidad es
mayor, probablemente debido al aumento de la carga neta de la proteína, lo que
favorece la repulsión. entre las moléculas y permite la formación de una capa de
hidratación.
64
En el punto isoeléctrico ocurriría lo contrario, es decir, la fuerza de repulsión
entre las partículas y la capa de hidratación es menor, lo que favorece la agregación
y floculación de las partículas. Este hecho permite separar proteínas mediante
precipitación isoeléctrica.
Figura 7 - Solubilidad de proteínas en relación al pH

Un ejemplo de este tipo de fraccionamiento se obtiene con hialuronidasa,
enzima de interés farmacéutico, que se extrae adecuadamente de los testículos de
buey utilizando una mezcla de ácido acético / ácido clorhídrico a un pH igual a 2,1.
Una gran parte de las proteínas contaminantes, incluida la -glucuronidasa, se
desnaturalizan y precipitan aplicando esta metodología, que se utiliza para eliminar
proteínas indeseables por precipitación, ya que existe un alto riesgo de
desnaturalización.
3.2.3.2 - Precipitación con sales inorgánicas (Salado)

El procedimiento más aplicado para el fraccionamiento de proteínas es el uso
de sales inorgánicas neutras (NaCl, (NH4) 2SO4) que promueven la precipitación
selectiva de proteínas. Este efecto se conoce más comúnmente como salting out,
ya que depende mucho de la hidrofobicidad de las proteínas.
La distribución de grupos hidrófobos e hidrófilos en la superficie de la
molécula de proteína afecta en gran medida su solubilidad frente a varios
disolventes. Aunque los grupos hidrófobos tienden a concentrarse dentro de la
estructura de la proteína, una cantidad sustancial de estos permanece en la
superficie, entrando en contacto con el solvente. Estos grupos hidrofóbicos juegan
un papel importante en el comportamiento de las moléculas de proteínas, debido a
la carga y los grupos polares que presentan.
La solubilidad de una proteína es el resultado de interacciones polares con el
solvente acuoso, interacciones iónicas con las sales presentes y fuerzas
electrostáticas de atracción y repulsión. Por tanto, el rendimiento del proceso de
precipitación depende no solo de las características particulares de cada proteína,
sino también de la composición de la solución, incluidas las propiedades de las
demás proteínas presentes (coprecipitación). Otros factores también son
determinantes en la solubilidad de proteínas como el pH, la temperatura y la fuerza
iónica.
La fuerza iónica mide la concentración de las cargas en solución. Las
proteínas tienen, en general, diferentes solubilidades en relación al pH cuando se
varía la fuerza iónica (concentración de sal) en el medio. La solubilidad aumenta
exponencialmente con la concentración de la sal, pasa por un máximo y luego
disminuye (Figura 8).
65
Figura 8 - Efecto de la fuerza iónica sobre la solubilidad de proteínas.
Analizando la variación de la solubilidad en función de la fuerza iónica, se

observa un aumento de la solubilidad en concentraciones bajas de sal, un efecto
llamado salado y una disminución de la solubilidad en altas concentraciones,
llamado salado.
Las explicaciones físico-químicas de estos fenómenos son bastante
complejas y, de manera simplificada, la salinización puede atribuirse a fuerzas de
atracción entre iones de proteína e iones de sal; estos por estar muy hidratados, al
acercarse a las proteínas, contribuyen al aumento de la capa de hidratación de la
molécula, favoreciendo el aumento de la solubilidad. A medida que aumenta la
concentración iónica, hay una disminución de la actividad del agua, lo que
disminuye las interacciones entre el agua y los grupos polares de proteínas,
haciéndolos más susceptibles a la aglomeración, creando flóculos y, por tanto, la
precipitación de la proteína. El fenómeno de la salazón es bastante apreciable en el
punto isoeléctrico, donde la repulsividad electrostática pasa por un mínimo. La
estabilidad termodinámica se altera durante el proceso de precipitación.
Entre las sales inorgánicas neutras más utilizadas destaca el sulfato de
amonio. Esta sal tiene ventajas notables, a saber:
• ser baratos y fáciles de obtener, estando en un estado suficientemente puro para
ser utilizado económicamente a gran escala;
• no ser tóxico;
• tienen una alta solubilidad incluso a bajas temperaturas;
• tener un efecto estabilizador sobre algunas proteínas, usándose normalmente en
el almacenamiento de enzimas comerciales;
• la alta concentración de esta sal previene la acción proteolítica y bacteriana, lo
que reduce las pérdidas de actividad enzimática.
La concentración óptima de sal requerida para la precipitación debe
determinarse experimentalmente y generalmente varía entre el 20 y el 80% de la
saturación (Figura 9).
66
14
12
10
8
% De proteína
precipitada
6
4
dos
0
25-4040-5555-7070-8585-95
% De saturación
Figura 9 - Distribución típica de proteínas frente a la precipitación de (NH4) 2SO4
La adición de sal debe ser lenta y con agitación para favorecer la

homogeneización. La adición en forma de polvo tiene la ventaja de no incrementar
mucho el volumen del sobrenadante, evitando problemas en la centrifugación.
Como la concentración de sal después de la centrifugación puede ser alta, pueden
ser necesarios procedimientos de desalinización para medir la actividad enzimática
y los posteriores procedimientos de purificación.
3.2.3.3 - Precipitación con disolventes orgánicos

La adición de disolventes orgánicos, como acetona y alcohol, a una solución
de proteínas en agua, disminuye su solubilidad. Esto ocurre debido a la disminución
de la constante dieléctrica de la solución, es decir, una disminución de la actividad
del agua, lo que conduce a una disminución de la solubilidad y un aumento de la
agregación por interacciones electrostáticas.
La constante dieléctrica es una medida de la polaridad del solvente, es decir,
la capacidad que tiene para colocarse entre dos iones de cargas opuestas y
separarlos, solvándolos. La constante dieléctrica del agua es muy alta en
comparación con la del etanol; esto hace que el agua separe intensamente los
iones de carga opuesta, solvándolos y manteniendo la proteína en solución. El
etanol ya lo hace con más dificultad, permitiendo una mayor atracción entre las
moléculas de proteínas, lo que provoca que se asocien y precipiten.
Los solventes deben usarse solo a bajas temperaturas (<0 oC); de lo
contrario, la mayoría de las enzimas se desnaturalizan rápidamente. En general, el
uso de disolventes ha disminuido en los últimos años, aunque existen algunos
fraccionamientos especialmente adecuados basados en esta metodología como,
por ejemplo, el fraccionamiento de Cohn para proteínas sanguíneas con etanol. En
estos casos, el tamaño de la molécula también es importante, y generalmente las
de mayor peso molecular se precipitan en concentraciones más bajas de disolvente.
Otro aspecto a observar es que los disolventes como el metanol, el etanol y la
acetona son los más utilizados, y al ser inflamables, se deben considerar
seriamente aspectos de seguridad. A pesar de esto, la técnica tiene la ventaja de
que es factible recuperar disolventes para su reutilización.
67
3.2.3.4 - Precipitación con polímeros
Los polímeros generalmente utilizados son polietilenimidas y
polietilenglicoles de diferentes pesos moleculares. El mecanismo de precipitación es
similar al que existe con los disolventes orgánicos y resulta del cambio en la
solvatación de las moléculas de proteína por el agua. Se cree que las moléculas de
polímero toman el lugar de las moléculas de proteína en la solvatación. Muchas
enzimas precipitan con concentraciones de polímero que varían entre el 15 y el
20%, menos que con los disolventes orgánicos. Estos en general no interfieren con
los procesos de purificación posteriores (intercambio iónico y cromatografía de
afinidad), aunque pueden eliminarse por ultrafiltración.
3.2.3.5 - Ultrafiltración
Una membrana semipermeable permite la separación de moléculas de
disolvente de moléculas de enzima grandes porque solo las moléculas pequeñas
pueden penetrar en la membrana cuando se excede la presión osmótica. Este es el
principio de cualquier proceso de separación de membranas, incluida la
ultrafiltración. El proceso de ultrafiltración se utiliza para concentración,
desalinización y fraccionamiento. La fuerza impulsora es la diferencia de presión
entre los lados de la membrana.
En la ultrafiltración, el agua y las moléculas pequeñas se dirigen a través de
una membrana semipermeable mediante una fuerza que puede ejercerse mediante
centrifugación o presión. El tamaño de poro de la membrana de ultrafiltración viene
determinado por el peso molecular retenido, es decir, el peso molecular mínimo de
una proteína globular que no atraviesa el poro. Como el tamaño de los poros de la
membrana no es homogéneo, se recomienda utilizar membranas con una porosidad
al menos un 20% menor que el tamaño de la molécula atrapada.
Las principales ventajas de la ultrafiltración como paso de concentración son:
• utiliza presiones hidrostáticas bajas;
• no hay cambio de fase;
• no utiliza reactivos químicos;
• mantiene la fuerza iónica y el pH de la solución concentrada;
• previene la desnaturalización e inactivación de enzimas.
Las dificultades surgen de la concentración por polarización (acumulación de
moléculas grandes cerca de la superficie de la membrana que disminuye el flujo, lo
que puede evitarse agitando la solución cerca de la membrana. Las células
agitadas disponibles comercialmente con un volumen de 400 mL-Filtrom), formación
de capas de geles en la membrana (reducidas al mantener un flujo turbulento o
laminar con alto flujo) o por ensuciamiento (deposición) en la membrana
(especialmente los agentes antiespuma utilizados en las fermentaciones causan
depósitos).
68
El acetato de celulosa y los polímeros orgánicos como las polisulfonas y el
polipropileno han demostrado ser útiles como materiales para fabricar membranas.
Con la excepción de la celulosa, estos materiales pueden limpiarse fácilmente con
bases o ácidos y esterilizarse con vapor.
Como el flujo a través de la membrana es directamente proporcional a la
resistencia al paso de las moléculas, existen algunas formas de minimizar esta
resistencia:
• Aumentar el tamaño de los poros (hasta el máximo posible, para que no pase la
enzima de interés);
• Incrementando la cantidad de poros;
• Espesor mínimo de la membrana (la mayoría de las membranas están formadas
por dos capas, una parte superior delgada de 0,5 mm y una membrana de
soporte porosa de 150 mm de espesor);
• Máxima hidratación de la membrana;
• Viscosidad mínima de la solución.
A escala industrial se utilizan diferentes sistemas de ultrafiltración para
eliminar la acumulación de células en la superficie de las membranas, tales como:
• Tangencial: solución bombeada tangencialmente a la membrana colocada entre
placas acrílicas o de acero;
• Espirales: láminas de membrana superpuestas entre pantallas e incrustadas en
un cilindro hueco perforado. La solución se bombea en paralelo al cilindro y el
filtrado pasa a través de la membrana y se dirige a un canal colector en el centro
del cilindro;
• Fibras huecas: ultrafiltro cilíndrico de 0,5-0,3 mm de diámetro interno con varias
fibras montadas en el interior del cartucho;
• Tubos: similar a las fibras huecas solo con un diámetro mayor.
La solución clarificada de las enzimas obtenidas se puede concentrar
mediante ultrafiltración o tecnología de proceso de membrana (disponible en una
amplia gama de tamaños de corte de 2000 a 300.000 Da y módulos de fibra plana,
tubular y hueca). Esta solución filtrada en medio filtrante de celulosa permite
obtener una preparación enzimática líquida, que una vez diluida a niveles
convenientes y acondicionada con estabilizadores de la actividad enzimática, puede
envasarse para su comercialización.
3.2.3.6 - Secar en frío

Da lugar a la concentración de sales presentes en la solución inicial, y puede
provocar pérdida de actividad enzimática, pero por otro lado, una vez que se
obtiene la enzima activa en forma de polvo, es mucho más estable que en solución
acuosa. El principal cuidado que se debe tener es evitar que la solución se
descongele durante el proceso, ya que esto provocaría una gran pérdida de
actividad. No se recomienda el uso de tampón fosfato y la aplicación de aditivos
como lactosa, trehalosa y manitol (1-5%) es de gran utilidad.
69
3.3 - PASOS DE PURIFICACIÓN
3.3.1 - Cromatografía
La cromatografía se puede considerar como una separación diferencial de
los componentes de una muestra entre una fase móvil y una fase estacionaria; la
mayor parte del tiempo la fase estacionaria está formada por partículas esféricas de
un material insoluble que se coloca (empaqueta) en una columna. La mezcla de
enzimas a separar es introducida en la columna por la fase móvil y forzada a migrar
a través de la columna. Las enzimas que se sienten más atraídas por la fase
estacionaria migrarán de manera diferente a las que tienen mayor afinidad por la
fase móvil.
3.3.1.1 - Filtración en gel

También conocido como permeación de gel, exclusión por tamaño o tamiz
molecular. Este es un método utilizado para el fraccionamiento y purificación de
proteínas y también es aplicable a la determinación de sus pesos moleculares.
Esta es una forma de cromatografía en la que las moléculas se separan
según su tamaño efectivo cuando están en solución, utilizando matrices (o geles)
con porosidad definida. Por tanto, el diseño de estos geles es uno de los
componentes más importantes del método. Características como estabilidad,
rigidez, tamaño de partícula, distribución de poros e inercia química son factores
que pueden afectar el tamaño de la columna, el caudal a adoptar y la eficiencia de
separación.
El proceso de filtración en gel se puede definir como la partición por difusión
de las moléculas de soluto entre la fase móvil, que consiste en el solvente, y la fase
estacionaria formada por los poros del gel.
El gel puede describirse como una matriz abierta tridimensional, formada por
reticulaciones, que contiene poros de diferentes tamaños que permiten el acceso de
solo unas pocas moléculas. Uno de los ejemplos más simples se encuentra en
matrices formadas por reticulaciones de agarosa, poliacrilamida o dextranos
(Sephadex), en las que las moléculas más grandes se eluyen más rápidamente
porque no pueden penetrar los poros del gel, mientras que las moléculas más
pequeñas se mueven más lentamente. porque tienen un camino más largo por
recorrer (Figura 10).
Figura 10 - Representación esquemática de la permeabilidad del gel.
70
La elección del gel adecuado dependerá del objetivo que se persiga. Para
una partícula dada, las condiciones de elución dentro de un gel dado deben ser
constantes, por lo que puede calcular un coeficiente llamado coeficiente de partición
que viene dado por la ecuación (2), donde Ve es el volumen al que se eluye la
muestra (volumen de elución). ; V0, volumen en el que se eluyen partículas
mayores que el poro (volumen de exclusión o vacío); y Vt, volumen del lecho de la
columna:
Vy −V0
KA = (dos)
V Vt −V0
Si el objetivo es separar moléculas más grandes (enzimas) de moléculas
más pequeñas como sales u otros solutos con PM menor a 3000 Da, se utilizan
geles con poros pequeños (Sephadex G-25 o G-50), en este caso las enzimas son
eluido en el Vo. Para separar moléculas de tamaño más cercano se debe elegir un
gel adecuado para que las moléculas de interés no se eluyan en el Vo o en el Vt,
para ello existen geles que fraccionan varios rangos de peso molecular.
El equipo básico para realizar la filtración en gel incluye: columna adecuada,
detector UV, colector de fracciones y un medio para controlar adecuadamente el
flujo (bomba peristáltica). La elección de columnas largas aumenta la resolución,
pero también aumenta el tiempo de separación y la dilución de la muestra.
Parámetros críticos para la optimización del proceso de filtración en gel:
• volumen de la muestra - se obtienen mejores resoluciones cuando la muestra se
concentra en pequeños volúmenes - volúmenes recomendados del 1 al 5% del
volumen total de la columna;
• concentración de la muestra - para no causar problemas de viscosidad, la
muestra debe tener una concentración máxima de 20 mg / mL en proteína;
• flujo adoptado - el flujo debe adoptarse de acuerdo con la longitud de la columna
y el gel utilizado para obtener mejores resoluciones;
• altura del lecho de la columna.
Las principales ventajas de los procesos cromatográficos son la no utilización
de energía, fuerzas de cizallamiento insignificantes, sistemas de automatización
sencillos y alta recuperación combinados con máxima resolución.
Hay que tener en cuenta algunos inconvenientes, ya que la cantidad de
muestra a aplicar se limita al 1-5% del volumen total de la columna; los geles,
Sephadex y Sepharose (agarosa), tienden a compactarse; Problemas de dilución en
el proceso de elución de la columna, especialmente para partículas más pequeñas
debido a una mayor difusión.
La cromatografía en gel se suele utilizar en las etapas finales de purificación,
aunque también se puede utilizar en la desalación y en la separación de moléculas
de diferentes tamaños, además de ser muy utilizada para determinar los pesos
moleculares de muestras desconocidas.
71
3.3.1.2 - Intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico es uno de los métodos más
importantes en el fraccionamiento de sustancias biológicas que tienen similitudes en
sus propiedades químicas y físico-químicas, siendo ampliamente utilizado en la
separación de aminoácidos, péptidos, proteínas y nucleótidos.
La cromatografía de intercambio iónico es un método de fraccionamiento
basado en la fijación de sustancias cargadas a un soporte que contiene una carga
opuesta. La separación se produce porque las interacciones electrostáticas entre
los grupos son reversibles y dependen de la afinidad de cada sustancia por el
intercambiador. Esta afinidad es función del pH del medio, la temperatura, la fuerza
iónica, el tampón, etc. Vale la pena mencionar que, además de las interacciones
electrostáticas, pueden ocurrir otras interacciones como las interacciones de van
der Waals, y su efecto es generalmente pequeño.
Los soportes utilizados se denominan intercambiadores de iones o resinas, y
suelen utilizarse en columnas. Las resinas se obtienen introduciendo grupos
polares en matrices insolubles en agua. Las matrices comúnmente utilizadas son
las de celulosa, poliacrilamida, geles de dextrano y copolímeros de estireno y
divinilbenceno.
Los intercambiadores se pueden clasificar como intercambiadores de
cationes, que tienen grupos ácidos como CM (carboximetilo), o intercambiadores de
aniones, que tienen grupos básicos como DEAE (dietilaminoetilo).
Para que se produzca el intercambio iónico, es necesario que la resina de
intercambio esté cargada activamente. Los intercambiadores de cationes son
activos a valores de pH por encima del pK de disociación del grupo, mientras que
los intercambiadores de aniones pueden considerarse activos a valores por debajo
del pK del grupo del intercambiador. Al seleccionar la resina apropiada para la
purificación de una determinada enzima, se debe considerar el pH de la estabilidad
de esta enzima para determinar el rango de trabajo. Si la enzima es estable por
encima del PI, se debe elegir una resina aniónica, por otro lado, si el rango de
estabilidad está por debajo del PI, se elige una resina catiónica. La fase móvil
siempre debe tamponarse con un tampón que no interfiera con el proceso de
intercambio iónico, con el fin de minimizar las fluctuaciones del pH.
La activación del grupo resina se realiza según el pK del grupo
intercambiador. Para un intercambiador catiónico, la resina se trata inicialmente con
un ácido fuerte (HCl), se lava con agua desionizada y se trata con una base fuerte
(NaOH), se lava nuevamente con agua desionizada para eliminar el exceso y,
finalmente, se trata con tampón cuyo pK debe ser superior a la del grupo
intercambiador. Los intercambiadores catiónicos así tratados se consideran activos
en su forma sódica, es decir:
No h
R-COOH R-COO- Na +
FORMA INATIVO FORMA LATIVA
72
Es factible obtener intercambiadores catiónicos en forma de hidrógeno (H +).
El tratamiento para la activación de los intercambiadores aniónicos se realiza de
forma similar a la descrita anteriormente, sin embargo, inicialmente se utiliza el
tratamiento con NaOH y luego el tratamiento con HCl. Los intercambiadores de
aniones obtenidos de esta manera se consideran activos en su forma cloruro.
Si una solución que contiene un catión X + se pone en contacto con un
intercambiador catiónico activo, desplazará el catión presente en el intercambiador
y se fijará:
+
R-COO-Na + + X R-COO- X + + Na +
La capacidad total de intercambio depende del tipo de intercambiador. Este

parámetro se refiere a la capacidad de retener una cierta cantidad de cationes o
aniones por unidad de masa de resina. El conocimiento de este parámetro es
importante, ya que si se supera, los iones no se retendrán por completo. Sin
embargo, existe otro parámetro denominado “capacidad de intercambio disponible o
real” y que se refiere a la capacidad de cada intercambiador en una determinada
condición experimental (pH, naturaleza del tampón, fuerza iónica, etc.).
La elección del tipo de resina es fundamental para la separación. En el caso
de proteínas que tienen cargas positivas y negativas en su molécula, cuya carga es
función del pH del medio, el factor principal es la estabilidad de la molécula a
diferentes pH. También se observa que en el fraccionamiento de sustancias lábiles
(proteínas) se deben utilizar intercambiadores débiles (débilmente ácido, COO-;
débilmente alcalino, N + HR2).
Las resinas se pueden utilizar en solución o en columnas cromatográficas. La
primera posibilidad tiende a utilizarse en soluciones proteicas muy impuras mientras
que la metodología de columna es más utilizada y se aplica en la resolución de
mezclas complejas en las etapas finales de purificación.
Generalmente, las proteínas se aplican a una columna en condiciones que
maximizan las uniones y, por lo tanto, se eluyen selectivamente a través de
cambios en las condiciones iónicas. Por tanto, para un intercambiador catiónico (p.
Ej. CM-celulosa), una fuerza iónica baja y un pH = 5 son las condiciones ideales
para la fijación de proteínas. Este pH asegura que el intercambiador catiónico esté
cargado negativamente (pK típico para grupos carboximetilo = 4) y la mayoría de
las proteínas estarían cargadas positivamente (por debajo de su punto isoeléctrico).
Las enzimas se eluyen selectivamente de la columna aumentando la fuerza iónica,
el pH o una combinación de ambos.
En la cromatografía de intercambio aniónico, la mezcla de proteína bruta se
coloca en la columna con baja fuerza iónica y un pH = 8 (DEAE-celulosa tiene pK =
9,5). Las enzimas se eluyen secuencialmente aumentando la fuerza iónica,
disminuyendo el pH o combinando ambos factores.
La ventaja de este paso reside en el drástico aumento de la actividad
específica, aliado a una gran recuperación de la actividad enzimática total.
73
La regeneración de resinas de intercambio iónico es un proceso
relativamente simple y generalmente se realiza con cloruro de sodio en altas
concentraciones, para liberar las proteínas fuertemente unidas y el ácido clorhídrico
y el hidróxido de sodio, para reactivar los grupos cargados.
3.3.1.3 - Cromatoenfoque
Las proteínas se eluyen de una columna de intercambio iónico utilizando un
debilitador cuidadosamente seleccionado y, como indica el nombre del método,
existe un efecto de focalización que concentra la enzima de interés de una manera
muy prometedora. En la cromatografía de intercambio iónico convencional, la
columna se eluye inicialmente con el tampón utilizado para equilibrar la columna y,
posteriormente, se proporcionan las condiciones iónicas adecuadas ajustándolas
gradualmente.
En cromatofocus, la columna se equilibra con un buffer y, luego de aplicar la
muestra, se utiliza un segundo buffer, que debilita el pH, que es diferente para la
elución. Siempre que la composición y la fuerza del tampón de elución sean
compatibles con la capacidad de intercambio de la columna, se generará un
gradiente de pH lineal “in situ” como consecuencia de la capacidad de
debilitamiento de la resina. Este gradiente de pH autogenerado tiene un efecto de
enfoque y las moléculas con el punto isoeléctrico específico se concentran juntas.
Esta metodología produce separaciones altamente resueltas incluso si presenta
desventajas porque a gran escala es un proceso costoso.
3.3.1.4 - adsorción
En la adsorción, los componentes de la muestra quedarán retenidos o no en
la superficie de la fase estacionaria, la cual está formada por sustancias que tienen
campos de fuerza no neutralizados o valencias libres, permitiendo la atracción y
retención de las partículas en su superficie. por fuerzas de van der. Waals, enlaces
de hidrógeno o interacciones electrostáticas. El desplazamiento de las partículas
adsorbidas será función de su mayor o menor interacción con la fase estacionaria.
Las enzimas son proteínas que ejercen su actividad biológica a través de su
sitio catalítico y tienen la propiedad de unirse a otra (s) molécula (s) a través de este
sitio, u otros, como los sitios alostéricos y reguladores. Estas propiedades pueden
explotarse con fines de purificación, siempre que las moléculas con las que la
enzima tiene afinidad, llamadas ligandos, puedan unirse a una matriz. En ese caso,
el enlazador puede ser un inhibidor, un sustrato análogo, un cofactor o un cofactor
análogo, es decir, cualquier molécula por la que la enzima tenga afinidad. La
mayoría de las interacciones están compuestas por fuerzas moleculares (iónicas,
hidrófobas). A menudo, la naturaleza de la interacción no está definida y las
condiciones de elución se obtienen empíricamente.
74
3.3.1.5 - Afinidad
Tipo de cromatografía de adsorción donde el soporte tiene afinidad
específica por la sustancia a aislar. Teóricamente, es capaz de proporcionar un alto
grado de purificación, incluso para mezclas complejas, en una sola etapa.
Las propiedades específicas de este soporte se obtienen acoplando
covalentemente una molécula de unión apropiada, normalmente una proteína, a
una matriz insoluble. La molécula de unión adsorbe la sustancia a aislar de la
solución, eliminándose la que no tiene afinidad con el soporte. La desorción del
material adsorbido se realiza mediante cambios en las condiciones experimentales
(bajas concentraciones de sustrato, presencia de coenzimas).
El procedimiento en cuestión explora las especificidades funcionales de los
sistemas biológicos, aislando sustancias según su función biológica, a diferencia de
las técnicas convencionales, donde la separación depende de las diferencias físicas
y químicas de las sustancias. Fue una técnica desarrollada inicialmente para la
separación de enzimas, habiéndose extendido posteriormente a nucleótidos e
incluso células o fragmentos de los mismos.
La naturaleza de la matriz a la que se unirán las proteínas es de gran
importancia de varias formas. Debe ser física y químicamente estable en
condiciones experimentales; debería mostrar poca adsorción no selectiva; y tienen
buenas propiedades de fluidez. Un buen ejemplo es el gel de agarosa en forma de
perla, conocido comercialmente como Sepharose 4B.
3.3.1.6 - Interacción hidrofóbica

Se desarrolló a partir de la observación de que las proteínas se retenían
inesperadamente en los geles de afinidad que contenían "brazos" de hidrocarburos
(C2 a C10). Las interacciones hidrófobas son más fuertes a alta fuerza iónica y, por
lo tanto, se usan convenientemente después de la precipitación con sales o
cromatografía de intercambio iónico. La elución se puede realizar cambiando el pH
del solvente (hecho de manera decreciente, cambia el grado de ionización de los
grupos cargados en la superficie de unión, reduciendo la fuerza de interacción), la
fuerza iónica (usando un gradiente de sal lineal), o usando un modificador orgánico
(como etilenglicol).
3.3.2 - Electroforesis
Se basa en la existencia de grupos ionizables en moléculas biológicas
(proteínas, ácidos nucleicos, péptidos, aminoácidos, etc.) y, por tanto, cuando en
solución pueden existir como especies cargadas eléctricamente - separación por la
movilidad de proteínas provocada por un campo eléctrico. La velocidad de
migración de estas partículas, cuando se someten a un campo eléctrico, es
proporcional a la fuerza del campo y la carga efectiva de las partículas e
inversamente proporcional a la fricción, dependiendo de su forma y tamaño.
La electroforesis en papel es el medio más simple y más utilizado para
separar una amplia gama de productos cargados. En algunos casos, no se logra
una buena separación.
75
En la electroforesis en gel, el uso de geles, como almidón, agarosa y
poliacrilamida, como medio de soporte permitió un aumento en la resolución de las
muestras. La razón de esto radica en el uso de otros factores como la difusión (a
través de la red tridimensional) y la separación por tamiz molecular, además del
campo eléctrico. La electroforesis en gel más conocida es la poliacrilamida-SDS
que se utiliza para determinar el peso molecular y la pureza de la muestra (Figura
11).
El dodecilsulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que se une
fuertemente a las proteínas, provocando su desnaturalización y proporcionando una
carga negativa constante por unidad de masa. Por lo tanto, los complejos SDS-
proteína se moverán al ánodo durante la electroforesis. Gracias a las propiedades
de tamiz molecular del gel, su movilidad (y por tanto la distancia que migrará en un
período de tiempo determinado) es inversamente proporcional al logaritmo de sus
pesos moleculares. Si también se aplican proteínas estándar de peso molecular
conocido, se puede determinar el peso molecular de las muestras de proteína. La
resolución de las bandas de proteína aumenta si las muestras se aplican a una
pequeña pila de gel, colocada encima del gel de separación principal.
El alivio del gel proteico se puede realizar utilizando sustancias específicas
como Comassie Brilliant Blue, Bromofenol - ZnSO4 - ácido acético o Nitrato de
plata.
Figura 11 - Gel de poliacrilamida-SDS teñido con Comassie Brilliant Blue
3.3.3 - Geles bidimensionales

Las muestras se separan parcialmente por diferencias entre puntos
isoeléctricos, utilizando una columna cilíndrica. El ánodo tiene un pH más bajo que
el cátodo y se mantiene un gradiente de pH estable. Las proteínas que inicialmente
están por debajo de su pI, se encontrarán cargadas negativamente y migrarán al
cátodo, hasta encontrar una región donde el pH corresponda a su pI, cesando el
movimiento de migración. Lo contrario ocurrirá con las proteínas que están por
encima de su pI. Esta técnica se conoce como enfoque isoeléctrico.
76
Después de esta separación parcial, el gel se somete a electroforesis en gel
de poliacrilamida-SDS en la dirección perpendicular a la primera separación. En
este paso, habrá una separación basada en las diferencias de peso molecular.
Al final de la purificación, un espectrofotómetro (UV / VIS) es esencial para el
análisis de actividad y proteína total. Además, el equipo de electroforesis es muy útil
para análisis de pureza, especialmente para preparaciones finales. Como todavía
se pierde actividad en cada paso de purificación, para aumentar el rendimiento del
proceso se debe realizar un número mínimo de pasos. Analizar cuidadosamente los
procesos necesarios aplicados a cada etapa, permitiendo obtener el mejor
desempeño con un mínimo de pérdidas.
3.4 - ETAPA DE FORMULACIÓN

Las preparaciones enzimáticas se pueden comercializar en forma sólida o
líquida, para lo cual es necesario que permanezca plenamente activa durante el
tiempo que se almacena y transporta.
Por tanto, a las preparaciones enzimáticas se añaden conservantes y
estabilizantes que favorecen la conservación de la actividad enzimática. Los
ejemplos de conservantes incluyen los utilizados en las industrias alimentaria y
farmacéutica, que son sorbato, benzoato y sales de amonio cuaternario.
Los estabilizadores pueden ser NaCl, (NH4) 2SO4, albúmina, escarosa,
glicerol, PVA (alcohol polivinílico), PVP (polivinilpirrolidona), PEG (polietilenglicol) y
CMC (carboximetilcelulosa) como ejemplos.
La preparación enzimática en forma sólida se obtiene mediante secado al
vacío o mediante secado por atomización. Tiene las ventajas de un fácil
almacenamiento y transporte, y una mayor estabilidad del producto, pero, por otro
lado, existe la desventaja de la formación de polvos muy finos, que pueden causar
problemas alérgicos en quienes manipulan la enzima.
Para reducir la formación de polvo en las preparaciones sólidas, peletizar o
aglomerar este material hasta alcanzar un tamaño de partícula entre 200 y 500 µm,
o en caso contrario se encapsula la preparación.
Purificación magnética de enzimas

La desventaja de todos los procedimientos de columna de cromatografía líquida
estándar es la imposibilidad de estos sistemas de analizar muestras que contienen material
particulado. Por lo tanto, no son adecuados para las etapas iniciales del proceso de
aislamiento / purificación. En el caso de afinidad, intercambio iónico, interacciones
hidrófobas o adsorción por lotes, se ha demostrado que son útiles las aplicaciones de
lechos fluidizados estabilizados magnéticamente o sistemas bifásicos modificados
magnéticamente.
77
El principio básico de la separación magnética por lotes es muy simple. Los
portadores magnéticos tienen una afinidad inmovilizada, o aglutinantes hidrófobos, o
grupos de intercambio iónico, o partículas magnéticas de biopolímeros que tienen
afinidad por la estructura a aislar, se mezclan con una muestra que contiene el compuesto
diana. Las muestras pueden ser células lisadas, sangre, plasma, leche, suero, orina, medio
de cultivo, efluentes de la industria alimentaria y de fermentación, entre otros. Después de
un período de incubación en el que el compuesto objetivo se une a las partículas
magnéticas, todo el complejo magnético se elimina fácilmente de la muestra utilizando un
separador magnético apropiado. Después de eliminar los contaminantes, el compuesto
objetivo aislado se puede eluir y utilizar para trabajos futuros.
3.5 - REFERENCIAS
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cardosina A extraída de Cynara cardunculus. Química de los alimentos, 88, 351-359, 2004.
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79
CAPÍTULO 4 - ENZIMAS FIJAS
Inmovilización significa confinar o ubicar, mediante métodos químicos y / o

físicos, la enzima en una porción del espacio, con el fin de mantener (para
maximizar) su actividad catalítica. Por tanto, se entiende por enzima inmovilizada
aquella que se encuentra asociada física o químicamente a un soporte o matriz,
habitualmente sólida, insoluble en agua e inerte, que no es imprescindible para su
actividad. El objetivo principal de la inmovilización es poder reutilizar la enzima, lo
que también puede aumentar su estabilidad.
En 1916, Nelson y Griffin describieron el primer uso de enzima inmovilizada
(invertasa en carbón vegetal), demostrando que se mantuvo viable, sin perder su
actividad enzimática inicial. A partir de la década de 1960, se intensificó la
investigación para establecer métodos eficientes para unir enzimas. Katchalski debe
la introducción de los primeros soportes útiles en la preparación de enzimas
inmovilizadas.
En la década de los 70, los procesos con enzimas inmovilizadas comenzaron
a tener algún uso industrial a gran escala. El primer uso comercial fue en la
producción de L-aminoácidos para uso médico y alimentario mediante aminoacilasa
inmovilizada en DEAE - Sephadex. Los aminoácidos sintéticos, obtenidos
químicamente, forman una mezcla racémica y el isómero D no es nutritivo.
El uso más exitoso de enzimas inmovilizadas es la producción de jarabes de
fructosa usando glucosa isomerasa inmovilizada. El proceso utiliza enzimas
inmovilizadas y la producción de jarabe de glucosa-fructosa se lleva a cabo a gran
escala en los Estados Unidos, para producir el "azúcar" presente en los refrescos.
De manera similar a este azúcar, el azúcar invertido se puede producir por vía ácida
o enzimática, a través de invertasa inmovilizada, en un reactor continuo. El azúcar
invertido tiene sus ventajas porque es más soluble y dulce, requiere menos cantidad
y también es mejor para el metabolismo, ya que es producto de la descomposición
de la sacarosa en glucosa y fructosa, con características físicas similares a la miel
de abeja. La aplicación del proceso a mayor escala requiere un poco más de
estudio en una etapa de purificación de la solución antes de que la solución ingrese
al reactor enzimático, ya que el proceso presenta problemas en relación a la
presencia de cantidades mínimas de impurezas en el azúcar refinado, resultando en
obstrucciones del reactor de azúcar después de aproximadamente una semana de
funcionamiento. El interés por la producción surgió porque "con azúcar alto y bajos
costos de producción, el azúcar invertido presentaría ventajas económicas sobre el
azúcar refinado".
4.1 - VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS

Las principales ventajas y desventajas tecnológicas del uso de enzimas
inmovilizadas se muestran en la Tabla 1. La decisión de utilizar la enzima en su
forma libre o inmovilizada obedecerá a una evaluación económica de las
alternativas de proceso, donde las ventajas y desventajas se enfrentarán de manera
cuantitativa. .
80
Para ello, se requieren datos fiables sobre la cinética y estabilidad de las
enzimas inmovilizadas y libres, además de información sobre coste, propiedades
fisicoquímicas, eficacia de inmovilización y capacidad de carga del soporte.
tabla 1 - Uso de enzimas inmovilizadas
Beneficios Desventajas
Desarrollo continuo de sistemas Costo adicional de soportes, reactivos y
operación de inmovilización
Mayor estabilidad enzimática Pérdida de actividad durante la
inmovilización.
Uso más eficiente del catalizador mediante Posibles requisitos adicionales de
la reutilización. purificación del catalizador
Flexibilidad de diseño de reactores Técnica inadecuada para sustratos
insolubles o de alto peso molecular
Efluentes sin catalizador Mayores riesgos de contaminación
a funcionamiento
continuo de los reactores
Mayor versatilidad en el paso de separación Restricciones de difusión fuera
de juego estéreo
Menor costo de mano de obra
Instalación de automatización y control
Posibilidad de utilizar enzimas
"fresco"
Se puede asegurar que las ventajas de esta tecnología prevalecerán ya que

el costo de producción está influenciado por el costo del catalizador enzimático. Si
la enzima es de bajo costo (por ejemplo, -amilasa), el uso de enzima inmovilizada
ofrecerá menos posibilidades de desarrollo comercial en comparación con una
técnica convencional con enzima libre en solución.
4.2 - ELECCIÓN DE MÉTODOS Y APOYO A LA INMOVILIZACIÓN

Debido a la gran especificidad de las reacciones enzimáticas, no existe una
técnica de inmovilización o soporte ideal para todos los procesos enzimáticos. La
elección del método de inmovilización y el tipo de soporte dependerá de las
características peculiares de la enzima y de las condiciones de uso de la enzima
inmovilizada.
Para una elección económica del método de inmovilización es necesario
conocer la reacción deseada, el proceso de aplicación de la enzima inmovilizada,
las condiciones del medio, los cambios provocados en la estabilidad, la actividad, el
pH y otros factores. Sólo con estos parámetros determinados se puede elegir la
mejor técnica de inmovilización, tipo de soporte y diseño de reactores enzimáticos.
81
La mayoría de las veces, el procedimiento de inmovilización enzimática se
lleva a cabo sobre varios soportes utilizando diferentes métodos, y luego se evalúa
la actividad del sistema inmovilizado. El binomio soporte - método más adecuado
será el que proporcione mayor actividad tras la inmovilización. La Tabla 2 a
continuación muestra la inmovilización de B. subtilis esterasa sobre varios soportes
mediante diferentes métodos, demostrando que la inmovilización sobre DEAE-
Celulosa por adsorción sería el mejor procedimiento.
Tabla 2 - Actividad de Bacillus subtilis esterasa inmovilizada en varios soportes y por diferentes métodos
SOPORTE MÉTODO POROS ( A) UI /
g
Acetato de celulosa Microencapsulación 0,02 45
Poliacrilamida Microencapsulación 2.5 50
Perlas de vidrio Enlace covalente 0,2-1,0 200
DEAE-Sephadex A25 Adsorción 0,1 650
Dowex 1X1 Adsorción 0.4 820
DEAE- Celulosa Adsorción 0,06 4200
4.2.1 - Soportes de inmovilización

4.2.1.1 - Tipos de apoyo
Los soportes pueden ser orgánicos o inorgánicos, sintéticos o naturales.
Existen soportes que requieren cambios o inclusión de grupos reactivos para que la
enzima pueda inmovilizarse en él. Este proceso se denomina apoyo habilitador. En
la literatura existen numerosos materiales inertes que pueden utilizarse para
inmovilizar enzimas, donde la naturaleza física de estos soportes puede variar,
desde materiales geliformes hasta superficies sólidas (láminas de acero, perlas de
vidrio) recubiertas de una sustancia capaz de interactuar con la enzima. La tabla 3
muestra algunos tipos de soportes.
Tabla 3 - Clasificación de soportes utilizados en la Inmovilización de Enzimas
TIPO DE MATERIALES POROSIDAD ESTABILIDAD
SOPORTE
No poroso Vidrio, sílice, acero - Elevado
Microencapsulado Triacetato de celulosa 35 A Moderar
Entrelazado Poliacrilamida, PVP Variado Bajo
Macroporoso Alúmina, sílice 200-1000 A elevado
La retención de la actividad enzimática es un parámetro de gran importancia,
y los procesos que promueven pequeños cambios conformacionales en la molécula
enzimática (enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals e interacciones
hidrofóbicas) retienen una mayor actividad, pero a menudo conducen a una
desorción indeseable de la enzima por variaciones. en pH o fuerza iónica del medio.
Algunos autores citan los polímeros naturales y sus derivados como
compuestos ventajosos para la inmovilización de enzimas, por su marcada
característica hidrófila y por una conformación que permite la formación de
microsistemas favorables a la actividad de las enzimas, especialmente hidrolasas.
La quitina es un ejemplo de un polímero natural que se ha utilizado ampliamente
para este propósito.
82
En 1993, se desarrolló un método para producir sílice de porosidad
controlada y se evaluó su uso en la inmovilización de enzimas. La sílice esférica
(Figura 1) con porosidad controlada puede variar en el diámetro de las esferas, y se
evaluaron los efectos del tamaño de poro, tamaño de partícula y concentración de
enzima sobre la actividad de la enzima inmovilizada. Se confirmó que cada enzima
reconoce un tamaño de poro óptimo para la inmovilización (que corresponde a 4 a 6
veces el tamaño del diámetro de giro de la molécula). A partir de los estudios
realizados, también se encontró que no vale la pena producir una sílice diferente
para cada enzima a inmovilizar, ya que esto implicaría cambiar las condiciones de
tratamiento para cada caso. Para la amiloglucosidad, por ejemplo, la pérdida fue
aproximadamente del 10% cuando se utilizó sílice de 400 Å en lugar de 300Å,
considerado como el diámetro óptimo. El soporte se utilizó para inmovilizar enzimas
de aplicación industrial como para la hidrólisis (descomposición) de suero lactosa
en glucosa y galactosa como alternativa para ampliar las posibilidades de uso
comercial de este subproducto lácteo, y también, inmovilización de lipasas, con el
objetivo de aplicación. en síntesis orgánica e inmovilización de
pectinametilesterasas presentes en acerola.
Figura 1 - Imagen ampliada de las esferas de sílice
4.2.1.2 - Criterios para evaluar un sistema de soporte enzimático

Algunos criterios son importantes en la evaluación de un sistema de soporte
enzimático, entre ellos:
• Estabilidad de la fijación → la enzima debe estar firmemente unida al
soporte. Sin embargo, los problemas de desorción pueden provocar algún tipo de
inestabilidad. Las fuerzas existentes en el proceso de fijación pueden ser
insuficientes, provocando pérdidas. Por ejemplo, DEAE-Sephadex (dietil-amino-
etilo), que es un intercambiador catiónico, en un momento dado, debido a
cambios de pH en el medio de reacción, puede tener sus fuerzas de interacción
interrumpidas, desestabilizando la unión del soporte.
• Estabilidad enzimática → la enzima no debe sufrir modificaciones como la
desnaturalización, debe evitarse la fragilización de la enzima y la pérdida de
estabilidad enzimática no es común.
• Resistencia mecánica → el soporte debe soportar diversas condiciones
desfavorables, como el peso del soporte dentro del reactor. Esta es la principal
razón para no utilizar la inclusión de la enzima en los soportes. La quitina tiene
una alta resistencia mecánica.
83
• capacidad de la batería → el soporte debe fijar un elevado número de
unidades enzimáticas por unidad de superficie. Por tanto, es posible tener una
gran capacidad catalítica en un reactor pequeño.
4.2.2 - Métodos de inmovilización
Figura 2 - Métodos de inmovilización de enzimas
4.2.2.1 - Métodos para enzimas en solución

Estos métodos, basados en el uso de membranas de ultrafiltración
permeables, atrapan la enzima, pero permiten el paso del sustrato y el producto.
Una derivación de este método promueve el aumento de la cadena enzimática al
agregar polímero sin hacerlo insoluble y evitando el paso de la enzima a través de
los poros.
4.2.2.2 - Métodos para enzimas por inmovilización.
Por oclusión o encarcelamiento

Basado en la oclusión de la enzima en una matriz semipermeable que evita
la liberación de la enzima. La oclusión se subdivide en:
• Oclusión de matriz:
Las matrices empleadas pueden ser geles o fibras. En los geles, la enzima
queda atrapada en los espacios intersticiales de la red polimérica (enzima confinada
dentro de las micelas), mientras que en las fibras, la captura tiene lugar en las
microcavidades.
En la preparación del gel polimérico se utiliza una solución que contiene el
biocomponente como almidón, caucho, nailon, poliacrilamida, sílice, alginato
cálcico, agarosa, polietilenglicol, entre otros, quedando el biocompuesto atrapado
dentro de la matriz del gel que se forma con el apresto. de poro de 100-400 nm
(Figura 3).
84
El biocompuesto se encuentra aprisionado en una red tridimensional,
manteniéndose en su estado natural sin riesgo de bloquear sus sitios activos,
grupos o moléculas en el enlace químico, manteniendo su estabilidad durante
varias semanas. Las principales desventajas de este método son: la formación de
grandes barreras de difusión para el transporte de sustrato y producto,
especialmente aquellos de alto peso molecular, lo que lleva a una reacción
retardada, y la pérdida continua de actividad enzimática por el escape de la enzima
a través de los poros de la matriz (que se puede remediar reticulando con
glutaraldehído).
La eficacia del entrelazamiento, la permeabilidad del gel y su resistencia
mecánica dependerán de la composición de la mezcla de reactivos y de la
naturaleza del monómero utilizado.
figura 3 - Método de inmovilización enzimática por encapsulación en gel de agar
Microencapsulación:
En este método, la enzima se ocluye en membranas poliméricas esféricas,
semipermeables y de pequeño diámetro.
Se utilizan membranas de porosidad inerte de 300 µm (celulosa,
policarbonato, colágeno, poliftalato, polímeros en general) para encapsular el
biocompuesto (Figura 4). En promedio, las gotas tienen un diámetro del orden de
80 µm, con la membrana de 0,02 µm de espesor y el diámetro de sus poros de
aproximadamente 35 A. Debido al pequeño espesor de la película circundante y al
alto valor de la relación área / volumen, las limitaciones de difusión son menores en
este caso que en la encapsulación.
Figura 4 - Microencapsulación de enzimas en material polimérico
85
Por conexión
La inmovilización por enlace se produce mediante la formación de enlaces
covalentes o cruzados. La formación de enlaces covalentes puede ocurrir entre las
moléculas de la enzima o entre la enzima y el soporte.
• Reticulación o reticulación
Método que implica el uso de agentes bifuncionales o multifuncionales, en
general diaminas alifáticas (diisocianato) o glutaraldehído, que inducen la auto-
reticulación de enzimas, dando como resultado la formación de una red
tridimensional de moléculas enzimáticas. Este reactivo bifuncional puede actuar
agregando moléculas de proteína juntas hasta la formación de partículas
insolubles. Es un método caro e ineficaz ya que parte del material biológico actuará
inevitablemente principalmente como soporte, lo que resultará en la pérdida de
actividad enzimática. La formación de barreras de difusión al sustrato o producto y
la falta de rigidez o resistencia mecánica hacen que el método sea aún más
insatisfactorio.
• Enlace covalente
Tipo de método más utilizado para inmovilizar biocomponentes,
especialmente enzimas. Implica la unión del biocompuesto a la matriz de
inmovilización mediante grupos funcionales nucleofílicos presentes en cadenas
laterales de aminoácidos que forman la enzima y que no son esenciales para su
actividad catalítica.
El enlace covalente se produce mediante la reacción de grupos reactivos del
soporte, (matrices como vidrio, cerámica, polímeros sintéticos, celulosa, nailon y
alúmina, activados o no) con los grupos funcionales de la enzima (enlace de grupos
- NH2, - COOH, - OH, -SH, entre otros) preferiblemente en condiciones fisiológicas
suaves, baja temperatura, baja fuerza iónica, pH óptimo y a menudo en presencia
del sustrato, con el fin de proteger el sitio enzimático activo, evitando una
disminución de su actividad. cuando está inmovilizado. Este método asegura que es
poco probable que la enzima se desprenda de su soporte durante el uso, es decir,
la irreversibilidad del método por la acción del pH, la fuerza iónica o el sustrato. Son
estables durante varios meses (4 a 14 meses). La mayor desventaja es la
posibilidad de que la enzima se vuelva inactiva, parcial o totalmente,
En general, las reacciones de inmovilización se llevan a cabo en medio
acuoso, a una temperatura entre 0 y 25 ° C y un pH próximo a la neutralidad. La
elección de las condiciones dependerá de la estabilidad de la enzima y del soporte
frente al pH de formación de enlaces covalentes, así como de la estabilidad de los
enlaces soporte-enzima frente al pH de uso del sistema inmovilizado.
Por adsorción
• Conexión Metálica
Forma quelatos activando la superficie del soporte mediante el metal o su
óxido
86
• Adsorción física
Es un método sencillo que se basa en la adsorción física sobre superficies
sólidas, como alúmina, carbón, arcilla, gel de sílice, colágeno, vidrio, mediante
enlaces iónicos, polares o de van der Waals. Por lo general, no requiere el uso de
reactivos químicos, involucra especies no reactivas, por lo que no hay modificación
del biocomponente y son necesarios pocos pasos de activación. Sin embargo, estos
métodos son muy susceptibles a los cambios ambientales, como el pH, la
temperatura, la fuerza iónica o incluso la presencia del sustrato y tienen baja
estabilidad. La Figura 5 muestra un ejemplo de inmovilización enzimática ( -
amilasa) usando el método de adsorción física en carbón de cáscara de coco.
Figura 5 - Inmovilización de -amilasa por adsorción física en carbón de cáscara de coco
• Enlace iónico
Se lleva a cabo conectando grupos con cargas opuestas mediante fuerzas
electrostáticas. Proceso simple, suave y no perjudicial para la mayoría de las
enzimas, con efectos de difusión incluso insignificantes.
En los dos últimos métodos por adsorción, las fuerzas son débiles, dando
lugar a pequeños cambios conformacionales en la enzima y, en consecuencia, a la
posibilidad de su disolución (pérdida).
En general, se prefieren los procesos de inmovilización por unión cuando se
enfrentan a la eficiencia, aunque la inclusión en geles o matrices es más barata. La
mayoría de los procesos de inmovilización utilizan enzimas inmovilizadas por el
proceso de fijación de la enzima en el exterior del soporte.
87
4.3 - EFECTOS CAUSADOS POR LA INMOVILIZACIÓN
Cuando se agrega una enzima a un material inerte, por suave que sea el
procedimiento, es razonable esperar algún tipo de efecto sobre su actividad
catalítica, que está estrechamente relacionada con la estructura de la
macromolécula. La tabla 4, que describe las características cinéticas de la invertasa
soluble e insoluble (inmovilizada sobre tres soportes diferentes), muestra
claramente la interferencia de la inmovilización sobre la actividad catalítica de la
enzima, obteniendo, por ejemplo, una Km más alta y una Vmax menor para la
enzima inmovilizada en enzima soluble.
Cuadro 4 - Características cinéticas y parámetros termodinámicos de la invertasa en forma soluble e
inmovilizada sobre tres soportes diferentes (alginato cálcico (1), quitina (2) y polietileno activado (3))
PARÁMETRO INVERTASE SOLUBLE INVERSIÓN
INMOVILIZADA
Km 26,0 mM 8,1 mM (1)
52,2 mM (2)
32,2 mM (3)
Vmax 1,10 U 0,25 U (1)
0,74 U (2)
0,32 U (3)
pH 4.6 4,6 (1)
(para máxima actividad) 4,0 (2)
4,6 (3)
pH 4.0-4.6 4,5 - 6,5 (1)
(mayor estabilidad) 5,0 - 6,0 (2)
4,6 (3)
T 55-60 C 60 C (1)
(para máxima actividad) 60 C (2)
70 C (3)
T 25-37 C 45-50 C (1)
(mayor estabilidad) 25-40 C (2)
25-40 C (3)
Y el 27,8 kJ / mol 24,4 kJ / mol (1)
(energía de activación a 37 C) 51,9 kJ / mol (2)
37,5 kJ / mol (3)
 25,2 kJ / mol 21,9 kJ / mol (1)
(variación de entalpía a 37 ° C) 49,3 kJ / mol (2)
34,9 kJ / mol (3)
 -13,6 kJ / mol -13,9 kJ / mol (1)
(Variación de energía libre de -11,5 kJ / mol (2)
Gibs -14,7 kJ / mol (3)
a 37 C)
 0,125 kJ / mol 0,115 kJ / mol (1)
(variación de entropía a 37 ° C) 0,196 kJ / mol (2)
0,160 kJ / mol (3)
88
4.3.1 - Retención de actividad enzimática
Cuando una enzima se inmoviliza mediante encapsulación, algunas
moléculas pueden desnaturalizarse o inactivarse mediante reactivos o productos
implicados en la formación de la matriz encapsulante.
La actividad se puede perder de varias formas, a saber:
 Algunas moléculas de enzima
pueden inmovilizarse en una
configuración que evite por
completo que el sustrato acceda al
centro activo;
El grupo reactivo del centro activo
puede estar involucrado en la
conexión al soporte. La protección
del sitio de la enzima activa por un
inhibidor reversible durante la
unión puede resultar en una mayor
retención de la actividad;
 Las moléculas de enzima pueden haberse unido en una configuración
que las vuelve inactivas;
 Las condiciones de reacción en el
proceso de inmovilización pueden
provocar desnaturalización o
inactivación.
4.3.2 - Efectos de difusión

Cuando la enzima está inmovilizada, el sustrato debe difundirse en la
solución a través de una película líquida estacionaria presente en las superficies del
soporte y, si es porosa, a través de los poros hasta llegar al sitio activo de las
enzimas. Si la enzima inmovilizada es suficientemente activa, el problema de
difusión puede restringir la velocidad de reacción y las condiciones de flujo en las
proximidades de la enzima inmovilizada influyen en esta velocidad.
Entonces, cuando la tasa de difusión del sustrato es menor que la tasa de
transformación del sustrato por la enzima, la tasa observada es menor que la
esperada para una enzima dada en solución, ya que no todas las moléculas de
enzima estarán en contacto con el sustrato, es decir, no se alcanza la saturación.
Este fenómeno se puede expresar cuantitativamente por el factor llamado
efectividad (f) que relaciona la velocidad observada (v ') y la velocidad esperada (v),
como se ve en las ecuaciones 1 y 2, donde f es una función de la concentración del
sustrato y será no necesariamente debe ser una relación lineal.
v'
F= (1)
v
V s Vmax s
v = max → v ' = F
K METRO + s •
K METRO
+s
89
1 K 1 1
= METRO • + (dos)
v ' fVmax s fVmax
90
4.3.2.1 - Resistencia a la difusión externa
Las resistencias de difusión externa surgen debido a que el sustrato debe ser
transportado desde el seno de la solución a la superficie de catálisis, y por lo tanto
debe pasar a través de una capa líquida, por lo que el consumo de sustrato a través
de la membrana líquida puede considerarse como resultado de un gradiente.
La difusión de sustrato y productos desde los centros activos a la
solución (o viceversa) ocurre a través de mecanismos de difusión molecular y
convectiva.. Como la alta actividad catalítica se combina generalmente con una
baja difusividad (en medios acuosos), se forman gradientes de concentración de la
especie en el micro y macro ambiente de reacción, ya que es necesario superar las
películas de difusión interna y externa. Los efectos de la difusión y la resistencia a la
partición contribuyen al aumento de estos gradientes.
Los efectos de la difusión externa afectarán al transporte de masa y pueden
minimizarse tanto aumentando la agitación, en el caso de reactores de agitación
continua (CSTR), como aumentando el flujo de sustrato, en el caso del reactor de
pistón (PFR).
4.3.2.2 - Efectos de difusión interna

Tales efectos surgen debido al movimiento del sustrato dentro del medio
catalítico. En este caso, la difusión ocurre simultáneamente con la reacción, lo que
provoca un comportamiento no lineal de las variaciones en los gradientes de
concentración del sustrato dentro del sistema inmovilizado. Este efecto se observó
con la enzima -galactosidasa aprisionada en un gel de poliacrilamida, cuya
actividad fue aproximadamente un 50% menor que la de la enzima soluble, y el
aumento de la concentración de la enzima en el soporte interfirió en la difusividad
del sustrato.
4.3.3 - Efectos microambientales

Cuando la enzima está inmovilizada, está rodeada de un ambiente diferente
al que existía cuando estaba libre, especialmente si la matriz o soporte tiene carga.
Los efectos circundantes, que dependen de la naturaleza física y química del
soporte, pueden conducir a una distribución desigual del sustrato, productos y
cofactores entre la región vecina al sistema inmovilizado y el resto de la solución.
Ejemplos de esta influencia serían los efectos relacionados con interacciones
electrostáticas y / o hidrófobas entre el soporte y las especies químicas de bajo
peso molecular, lo que hace que los parámetros cinéticos dependan de su
concentración.
Los efectos electrostáticos promovidos en el valor KM y en el pH
óptimo dependen de la fuerza iónica y se supone que las propiedades catalíticas
intrínsecas de las enzimas inmovilizadas son independientes de las cargas
presentes en el microambiente.
91
Los efectos electrostáticos se suman a otros efectos como la hidrofilia del
soporte, que puede influir en la distribución del sustrato entre el microambiente
restringido por el soporte y la solución externa.
Este efecto de partición puede equipararse con el equilibrio químico de las
especies en solución, como se ve en la ecuación 3, donde pH1, representa el pH en
la región que rodea a la enzima; pH2, el pH dentro de la solución; ε, carga eléctrica
de las especies cargadas; ψ, carga electrostática del soporte; K, constante de
Boltzmann y T, la temperatura.
pH1 − pHd = 0, 43 (3)

os 
KT
  0 → pH1  pHdos → soporte aniónico
  0 → pH1  pHdos → apoyo catiónico
4.3.4 - Efectos estereoespecíficos

Existen situaciones en las que la actividad de la enzima frente a un sustrato
de alto peso molecular se reduce durante el proceso de inmovilización, de forma
más extensa que cuando se compara con un sustrato de menor peso molecular. Se
cree que este hecho es el resultado de un estéreo impedimento, formado por el
soporte, al acceso de grandes moléculas al centro activo de la enzima
(impedimento estérico).
En otro caso, la enzima adherida a un soporte sufre algún cambio en su
conformación, lo que puede afectar la actividad catalítica. Estos efectos son difíciles
de cuantificar y, para minimizarlos, la única forma es estandarizar los
procedimientos de inmovilización de la mejor manera posible.
Se puede citar un ejemplo para sustratos con pesos moleculares
comparables al de la enzima, como el almidón y la caseína, donde no pueden
penetrar los poros de las enzimas encapsuladas y, por tanto, la medida de actividad
es baja.
4.3.5 - Efectos sobre la estabilidad

Existe evidencia de que las enzimas durante la inmovilización muestran
cambios en la estabilidad térmica. Aunque la mayoría indican un aumento de la
estabilidad térmica, hay ejemplos de una disminución de la misma, lo que
demuestra que la inmovilización no confiere necesariamente un aumento de la
estabilidad. Con las enzimas proteolíticas, que favorecen el proceso de
autodigestión en soluciones, este efecto se reduce cuando se inmovilizan.
4.4 - USOS A ESCALA INDUSTRIAL

Actualmente existen cuatro ejemplos de enzimas inmovilizadas aplicadas a
procesos industriales. Todas estas enzimas son intracelulares y la inmovilización
hace que su uso sea económicamente viable.
92
4.4.1 - Resolución de mezclas racémicas de aminoácidos
Este es el primer uso de enzimas inmovilizadas a escala industrial. La
enzima aminoacilasa (p. Ej. Triptófanacilasa) cataliza la hidrólisis específica del
isómero L presente en los N-acil-D, L-aminoácidos generando L-aminoácidos y N-
acil-D-aminoácidos sin reaccionar.
Estos últimos se convierten posteriormente en forma racémica mediante
calentamiento. De esta manera, tanto los L como los D-aminoácidos se convierten
completamente en L-aminoácidos (Figura 6).
D, L - R - CH - COOH + H dosOL - R - CH - COOH + R '-
COOH NH - COR'NH dos
+
D - R - CH - COOH
NH - COR '
Figura 6 - Producción de L-aminoácidos por aminoacilasa.
4.4.2 - Producción de ácido 6-aminopenicilamico (6-APA)

Las penicilinas semisintéticas son los principales productos farmacéuticos
obtenidos por tecnología enzimática. El método de fermentación tradicional permite
producir tanto bencilpenicilina (penicilina-G) como fenoximetilpenicilina (penicilina-
V).
La vía sintética para la obtención de penicilinas semisintéticas es mediante la
eliminación del radical arilo, dando lugar al 6-APA, utilizado en la producción de un
gran número de derivados como la ampicilina (mediante acilación química). La
enzima utilizada es peniclina amidasa, que tiene como fuente Escherichia coli, y
Bacillus megaterium, y el soporte de inmovilización es bentonita entrecruzada.
4.4.3 - Producción de suero y leche retardada:

La hidrólisis de la lactosa, a través de la acción de la lactasa (o gala-
galactosidasa), genera glucosa y galactosa. Este proceso mejora la solubilidad del
azúcar y aumenta el dulzor del producto. Esta enzima proviene de Saccharomyces
lactis y Aspergillus niger, y el soporte utilizado puede ser fibras de acetato de
celulosa o vidrio poroso activado.
4.4.4 - Producción de jarabes de fructosa a partir de glucosa.

El éxito del proceso se basa en reducir el coste del biocatalizador (aumenta
la reutilización). La glucosa isomerasa proviene de Streptomyces sp. o Arthrobacter
sp., utilizando proteínas reticuladas o vidrio poroso activado como soporte.
93
Además, con el advenimiento de la técnica de inmovilización enzimática se
logró diversificar las aplicaciones de las enzimas, donde podemos mencionar: la
adaptación de reactores químicos convencionales a procesos enzimáticos
continuos, y aplicaciones en el desarrollo de electrodos enzimáticos (dispositivos
formados por un sensor y por enzima inmovilizada). También se puede decir que el
uso de enzimas inmovilizadas aún se encuentra en el umbral de su plena aplicación
y potencial económico.
En el ámbito médico, podemos destacar la aplicación de enzimas
inmovilizadas (glucosa oxidasa). Las personas con diabetes deben recibir
inyecciones de insulina periódicas, según el nivel de glucosa en sangre. Un olvido
puede provocar una hipoglucemia o una hiperglucemia. Muchos sistemas para la
liberación controlada de insulina en el cuerpo se basan en la reacción de la glucosa
en la sangre con la enzima glucosa oxidasa. Esta enzima puede ser inmovilizada
por los polímeros que forman la microesfera del fármaco. La reacción de la enzima
con la glucosa provoca una disminución del pH en el microambiente. La repulsión
electrostática entre las cadenas de polímero aumenta, lo que provoca el
hinchamiento del polímero y la consiguiente liberación de insulina. Es decir: el
sistema solo libera insulina en presencia de azúcar en sangre. Los polímeros más
utilizados para este fin son N,
Cristales de enzimas reticulados (CLEC: cristales de enzimas reticulados)

En 1964, Quiocho demostró este tipo de inmovilización con una carboxipeptidasa
A, que con la reticulación con cristales enzimáticos altamente compactados indujo la
formación de CLEC insolubles con considerable actividad, variando del 30 al 70% en
relación a los cristales de enzima nativa. Ya se han fabricado algunos otros CLEC, como
ribonucleasa A, lipasa, subtilisina, carboxipeptidasa B y alcohol deshidrogenasa en los
próximos 25 años.
Aun así, se observó que los CLEC exhiben mayor estabilidad térmica, a pH, a los
solventes orgánicos y resistencia mecánica en comparación con las enzimas inmovilizadas
solo con reticulaciones. Además, también se ha encontrado que minimizar el tamaño del
cristal, que varía entre 1 y 100 mm, es crucial para una alta retención de actividad.
Otra alternativa es diseñar un CLEC, mediante la ingeniería de las propiedades del
medio de cristalización, o seleccionando la mejor forma o tamaño del cristal, permitiendo
retener actividad y selectividad comparable a las enzimas presentes en medios acuosos o
disolventes orgánicos. La actividad también dependerá del tamaño y las propiedades del
sustrato, medio de reacción, tipo y condiciones de la reacción.
Sus principales aplicaciones, como lipasas, proteasas y acilasas, son como
biocatalizadores quirales para síntesis asimétrica; materiales microporosos para
cromatografía o liberación controlada de fármacos proteicos.
94
4.5 - REFERENCIAS
― CAO, L.; VAN LANGEN, L.; SHELDON, RA; Enzimas inmovilizadas: ¿unidas a un portador o sin portador?
Opinión Actual en Biotecnología, 14, 387-394, 2003.
― CAO, L.; Enzimas inmovilizadas: ¿ciencia o arte? Opinión actual en biología química, 9 (2), 217 -226,
2005.
― DALLA-VECCHIA, R.; NASCIMENTO, MG; SOLDI, V.; Aplicaciones sintéticas de lipasas
inmovilizadas en polímeros. Química Nova, 27 (4), 623-630, 2004.
― DURÁN, N.; ESPOSITO, E.; Aplicaciones potenciales de enzimas oxidativas y compuestos similares
a la fenoloxidasa en el tratamiento de aguas residuales y suelos: una revisión. Catálisis aplicada B:
ambiental, 28, 83-99, 2000.
1990.
1996.
― KRAJEWSKA, B.; Aplicación de materiales a base de quitina y quitosano para la inmovilización de
enzimas: una revisión. Tecnología enzimática y microbiana, 35, 126-139, 2004.
― NAKAO, K.; KIEFNER, A.; FURUMOTO, K.; HARADA, T.; Producción de ácido glucónico con
glucosa oxidasa inmovilizada en reactores de transporte aéreo. Ciencias de la ingeniería química, 52,
4127-4133, 1997.
― NOVOZYMES; Nueva técnica de inmovilización: un impulso para las lipasas. Biotimes, 3 de enero de 2002.
― NOVOZYMES; El reactor de inserción de enzimas produce más grasa vegetal natural. Biotimes, 4-5,
marzo de 2002.
― TISCHER, W.; KASCHE, V.; Enzimas inmovilizadas: ¿cristales o portadores? Trends in
Biotechnology, 17, 326-335, 1999.
http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apresentacoes/enzimas2005.ppt
http://www.iq.unesp.br/acontece/reportagem/anterior/02_06_2003.htm
95
CAPÍTULO 5 - REACTORES ENZIMÁTICOS
Las conversiones bioquímicas se pueden realizar en reactores que utilizan

como catalizadores tanto microorganismos como enzimas aisladas. El costo
adicional de aislar la enzima y, en algunos casos de inmovilización, el costo de la
fermentación debe sopesarse con las ventajas obtenidas del uso de enzimas
aisladas. En comparación con los microorganismos, las enzimas pueden
proporcionar mayores rendimientos en relación al producto, ya que no se formarían
otras sustancias resultantes del metabolismo y / o lisis celular. Además, en el caso
de enzimas inmovilizadas, existe la posibilidad de modificación de los parámetros
cinéticos de la enzima. Por tanto, la elección entre formas libres o inmovilizadas de
la enzima depende de la naturaleza de la conversión deseada y de la estabilidad
operativa de ambas formas.
En ciertos casos, no es factible recuperar las enzimas como en la industria
de panadería y ablandador de carne, ya que se utilizan en forma soluble y se
añaden en las etapas finales del proceso.
5.1 - TIPOS DE REACTORES ENZIMÁTICOS

Los procesos que utilizan enzimas inmovilizadas se pueden realizar de forma
continua o por lotes. El sistema más común es el tanque de mezcla agitado. En
algunos casos, estos reactores se han hecho funcionar de forma semicontinua
mediante la eliminación intermitente de parte del medio de reacción y la adición de
una nueva solución de sustrato. Cuando la enzima está en forma libre y soluble, los
reactores funcionan solo en lotes. Los principales reactores utilizados con enzimas
son:
5.1.1 - Reactor con enzimas libres

Los principales reactores utilizados para sistemas con enzimas en solución
son del tipo tanque agitado mecánicamente (con o sin ultrafiltración) y de pistón.
Los regímenes operativos se dividen en:
 Lote: la enzima se puede separar de la
mezcla final con facilidad
 Continuo - entrada y salida de fluido. Como se puede eliminar una cierta
cantidad de enzima, se deben utilizar sistemas de recuperación de enzimas.
En los reactores continuos es bastante habitual dividirlos en CSTR
(Continuous Stirred Tank Reactor) o PFR (Plug-Flow Reactor), según las
características de flujo.
5.1.2 - Reactor con enzimas inmovilizadas

5.1.2.1 - Cama fija (columna empaquetada o módulo fibrilar)
La enzima se empaqueta en el lecho del reactor, permaneciendo
estacionaria, incluso cuando se bombea la solución de sustrato.
96
5.1.2.2 - Cama fluidizada
La velocidad del fluido promueve el movimiento de las partículas de enzima
inmovilizadas dentro del reactor, evitando la deposición de las partículas en el fondo
del reactor, y es lo suficientemente débil como para evitar que sean arrastradas al
efluente.
5.2 - CRITERIOS DE SELECCIÓN DE REACTORES

5.2.1 - Sobre el desarrollo del proceso
Los procesos por lotes son más adecuados para pequeña escala, ya que con
la gran flexibilidad operativa que brindan, se pueden utilizar en un carácter
polivalente.
Para producciones mayores, los reactores continuos son más adecuados ya
que presentan mayor productividad. Se agregó la facilidad de control automático y
la mayor consistencia en las condiciones operativas, permitiendo un producto de
calidad constante.
5.2.2 - Respecto al tipo de reactor a utilizar (Requisitos operacionales

y costo)
Se deben tener en cuenta los aspectos operacionales que son característicos
de cada proceso, ya que tales requisitos pueden limitar la elección del reactor. Por
tanto, cuando existe la necesidad de un control estricto del pH y la temperatura, el
reactor más adecuado es el tanque agitado, ya que la agitación proporciona una
mejor homogeneidad en todo el sistema de reacción.
También se debe considerar el uso y el costo del reactor; básicamente, el
modo de operación del reactor es una función de la producción deseada: si el costo
es bajo, el reactor discontinuo es el mejor, ya que es un sistema barato y flexible, y
se puede utilizar en diferentes procesos.
En procesos continuos, como el tiempo de operación es más largo, puede
haber una pérdida de actividad catalítica, requiriendo la adición de una nueva
cantidad de enzima. En este caso, el reactor de agitación continua es el más
adecuado ya que en los demás se debe interrumpir el proceso para la adición.
En los reactores tubulares, es necesario que el sustrato se suministre de
forma intermitente, ya que los sustratos en alta concentración pueden inhibir la
enzima.
Para los fluidos de alimentación que contienen sólidos insolubles, el
reactor de lecho fijo no se puede utilizar.
5.2.3 - Respecto a la reutilización de la enzima

Con la excepción de algunas enzimas extracelulares (por ejemplo, amilasas
y proteasas), las otras son inestables cuando se usan durante más tiempo en los
reactores, en cuyo caso la inmovilización puede resultar atractiva. La economía del
proceso dependerá del costo del catalizador (enzima) / costo del proceso, y el
reactor debe promover la eficiencia en el modo de retención del biocatalizador.
97
5.2.4 - Respecto a las características cinéticas
Las características cinéticas de los procesos también son de fundamental
importancia a la hora de elegir el tipo de reactor. Las reacciones que obedecen a la
cinética de Michaelian muestran una mayor eficiencia en reactores de lecho fijo y
fluidizado. Cuando ocurre la inhibición por el sustrato, es más apropiado utilizar el
tanque agitado. Esto se debe a que, en este tipo de reactor, la concentración de
sustrato en cualquier punto del reactor es igual a la concentración de sustrato en la
salida del reactor, que suele ser baja.
En reactores continuos, donde se elimina la enzima, puede ser necesario
agregar una nueva enzima, debido a la pérdida de actividad durante una operación
prolongada. Esto se puede lograr fácilmente en un reactor CSTR, en cualquier
momento sin interrupción. Sin embargo, en otros sistemas es necesario interrumpir
la operación. La Tabla 1 presenta las características de cada tipo de reactor
enzimático continuo.
tabla 1 - Tipos de reactores enzimáticos continuos y sus características

Tipo de Régime Eficiencia Relació Control de Características Costos
reactor n de Conversió n Parámetros hidrodinámica Operació
flujo n enzima / s n
volume
n
Reactor
Tanque Mezcla Columna
agitado perfect menor que Bajo Fácil Bien Bajo
Continuo a (excepto en
casos de
inhibición)
Columna Pistón Más grande Regular
Empaquetado que el Elevado Difícil (problemas de Interme
tanque compactación y diario
agitado plomería)
(excepto en
casos de
inhibición)
Reactor Mezcla Columna Regular
continuo perfect menor que Interme Fácil (problemas con Elevado
Ultrafiltració a (excepto en diario concentración
n (UF) casos de de membrana)
inhibición)
Reactor Interme Intermedio
de lecho diario diario entre el Interme Intermediar Bien Elevado
Fluidizado tanque diario io
agitado y la
columna
Módulo Pistón Más grande Elevado Difícil Regular Elevado
fibrilar que el (problemas con
tanque concentración
agitado de membrana)
(excepto en
casos de
inhibición)
98
5.2.5 - Respecto a la característica de la corriente de alimentación
Otro aspecto que influye en la elección del reactor es cuando el sistema es
muy viscoso o contiene material particulado. En estos casos, el más adecuado es el
tanque de agitación. El lecho fluidizado también tiene pocas restricciones a estos
factores, mientras que el lecho fijo está indicado solo para viscosidades bajas y
ausencia total de material particulado con riesgo de bloqueo del reactor.
Cuando el proceso utiliza enzimas inmovilizadas, debemos tener en cuenta
las características físicas del soporte. No se deben utilizar soportes frágiles en el
tanque de agitación, ya que esto provocaría su rotura. El continuo movimiento de
partículas en el lecho fluidizado también hace inviable el uso de estos soportes.
Este problema no ocurre en el lecho fijo, sin embargo, por el contrario, no se deben
utilizar soportes comprimibles. Tampoco deben utilizarse soportes muy pequeños
en reactores de lecho fijo, ya que provocan grandes caídas de presión.
5.3 - CINÉTICA DE REACTORES ENZIMÁTICOS

Para facilitar la comprensión de las ecuaciones, la tabla 2 presenta varias
definiciones de parámetros que se utilizarán en las ecuaciones para determinar el
tiempo total de reacción y la conversión enzimática de los reactores discontinuos y
continuos.
tabla 1 - Definición de parámetros cinéticos de reactores enzimáticos

Parámetros Definició
n
Vb Volumen de reacción de mezcla (L)
METRO Masa del sistema de reacción (Kg)
Rana Caudal másico de entrada de sustrato (Kg / h)
jajaja Salida de sustrato de caudal másico (Kg / h)
Rc Relación de consumo de sustrato en el reactor (Kg / h)
Re Relación de variación del sustrato en el reactor (Kg / h)
 Densidad (Kg / L)
Solo Concentración inicial de sustrato (g / L)
s Concentración de sustrato en cualquier momento (g / L)
metro Masa de sustrato inicial (Kg)
X' Masa de sustrato consumido / masa total (M)
X Masa de sustrato consumido / masa Sustrato inicial (m)
v Masa S consumida / unidad de tiempo volumen (Kg / Lh)
LA Masa de alimentación total (Kg)
X' Masa de sustrato consumida / masa total de alimentación (A)
Xs Masa de sustrato / masa total de alimentación (A)
Vr Volumen del reactor (L)
Q Flujo de alimentación volumétrico (L / h)
OK Tiempo de residencia = Vr / Q (h)
99
5.3.1 - Reactor por lotes
5.3.1.1 - Tiempo total de reacción
Balance de masa para sustrato

RLa − Rs − RC = Ry
Proceso por lotes → = R s = 0 → R C = −R y
Rana
RC = vVB dx ' t X' t
X'
dx '
vVB = M dt → dt = METRO dx '
R = −M dx ' 00 B
 vV00 →  dt =   v
y
dt
Considerando la densidad constante, se obtiene que:

x dx
mdx = Mdx '→ t = s0  (1)

0
v
Suponiendo condiciones de flujo ideales, cinética de Michaelis-Menten para
reacción irreversible, sin inhibición y con un solo sustrato, y reemplazando en la
ecuación 1, llegamos a la ecuación descriptiva del proceso discontinuo.
V s
v = max xS0 K ME T RO
KMETRO + s t= − en (1 − (dos)
V V
X) max max
s = s0 (1 − X)
5.3.1.2 - Conversión enzimática

Para un reactor de lastre en condiciones isotérmicas, la ecuación de
Michaelis-Menten se puede integrar en relación con el tiempo, utilizando So como
concentración inicial de sustrato, donde r es la velocidad de reacción (mol / (sL)) y
V, el volumen (L) .
dS 1 Vmaxs  s  Vmax (3)
r=− =
dt VKME + s → (S0 − S) − KMETRO  0 ln S t
V
TRO
sO − S ,
Definiendo como la proporción de sustrato convertido, es decir,  =
sO
y reemplazando en la ecuación 3, es posible describir la conversión enzimática en
un reactor discontinuo.
Vmax
s 0− K en (1 − ) = t (4)
M V
ETRO
100
Para un proceso por lotes (Figura 1), valores bajos de So / Km, (donde la
velocidad de reacción es esencialmente cero), el valor de t, para un dado en
particular, es casi independiente de So / Km. Por otro lado, valores altos de So /
Km, (donde la velocidad de reacción es prácticamente de 1er orden), el tiempo
empleado para alcanzar un cierto valor de es proporcional a la relación So / Km.
Figura 1 - Variación en la cantidad de sustrato convertido () con el tiempo de reacción (t) para
diferentes relaciones So / Km.
5.3.2 - Reactor continuo

5.3.2.1 - Reactor tubular (PFR)
Tiempo total de reacción

Considerando el reactor en estado estacionario:
Balance de masa para sustrato
R La − R s − R C = R y
Régimen permanente → Ry = 0 → RLa − Rs − RC = 0
RLa = HACHAs − AX '

Rs = HACHAs − A (X AdX ' = vdVr
'+dX ') RC = v • dVr
Se obtiene reordenando e integrando la ecuación de diseño del reactor, donde A =

 Q y tA = Vr / Q, tenemos que:
V X 'dX' X 'dX' X'
K +s
r
= →

t LA = →
'
t LA =   METRO
dX (5)
LA 0 v Vmaxs
0v 0
Reemplazando las expresiones anteriores en (5) y sabiendo que dx '= (m / M) dx,

 = 1 y S = Entonces e integrando obtenemos la ecuación para el diseño del reactor tubular:
xS0 KMETRO en (1
tL = − (6)
Vmax
A − X) Vmax
101
Aunque la ecuación es similar a la del reactor discontinuo en este último, t es
el tiempo total de reacción mientras que tA es el tiempo de residencia de las
partículas en el reactor.
Si no se produce mezcladura durante el flujo a través del reactor (reactor de
pistón) y Q permanece constante durante el paso de la mezcla a través del reactor,
entonces ta sería de hecho el tiempo medio de residencia de cada partícula en el
reactor.
Conversión enzimática
Asimismo, para un CSTR y un PFR, la ecuación de Michaelis-Menten puede
integrarse dando como resultado ecuaciones idénticas a la conversión enzimática
en un reactor discontinuo, utilizando Q como alimentación volumétrica de sustrato al
reactor (en [L / s]).
 s  Vmax
(7)
r • dV = Q (S0 − S) − Q • dS → (S0 − S) + KMETRO en 
=  0 s
Q
La conversión enzimática en un reactor PFR se define por:
s 0− K en (1 − ) = (8)
Vmax M Q
ETRO
5.3.2.2 - Reactor continuamente agitado (CSTR)
Tiempo total de reacción

En este caso, el equilibrio vale la pena seguir el estado Q (S0 − S) = v • VB ,
estacionario.
y sabiendo que S = Entonces (1-x) y asumiendo que una reacción enzimática es un
modelo de Michaelis y Menten, la ecuación del proceso para este reactor será:
 X  Vmax Vmax
xS 0+ K  = = t L (9)
M 1 −  Q VB A
ETRO
X
En este caso, los reactores se consideraron ideales, donde el sistema está
perfectamente homogeneizado o sujeto a pistoneo.
Conversión enzimática
r = Q (S − S) = Vmaxs → (S − S) − K (S0 − S) = Vmax (10)
KM + s
0 0 METRO
SQ
E
O− s T
 s −
Admitiendo S , R = O y la ecuación de conversión enzimática
O
1 − SS
pronto
sO
en un reactor CSTR es definido
 Vmax
por: s 0− K = (11)
M1
− Q
102
En las ecuaciones del reactor discontinuo, CSTR y PFR, las contribuciones
relativas del primer término (reacción de primer orden) y del segundo término
(reacción de orden cero) en el tiempo de proceso, para alcanzar un valor dado de
, dependen de los valores de So y Km.
Figura 2 - Relación entre conversión () y el flujo volumétrico (Q) en ambos reactores enzimáticos
para diferentes relaciones So / Km.
De acuerdo con la figura 2, se pueden sacar conclusiones con respecto al

rendimiento de los reactores PFR y CSTR continuos. Con valores altos de So, es
decir, So / Km> 10, y valores bajos de , las curvas para ambos reactores son
prácticamente idénticas. Ésta es una región donde prevalece el primer término de
las ecuaciones (reacción de primer orden). Con valores bajos de So / Km, los
valores altos de solo se pueden lograr con caudales más bajos en el CSTR que
en un sistema PFR. Esto indica conversiones más altas para los reactores PFR a
un valor dado de Q.
Las ecuaciones de conversión cinética demuestran que la cantidad de
enzima en el reactor es un parámetro importante, ya que determina la velocidad de
reacción. El proceso de reacción es teóricamente independiente del tamaño del
reactor y estos deben compararse en función de la cantidad de enzima requerida.
Para un reactor discontinuo, la cantidad de enzima será mucho mayor que en un
reactor en modo continuo, especialmente si consideramos el tiempo perdido
(tiempo muerto) entre lotes.
5.3.3 - Efectos que afectan el desempeño de un Reactor Enzimático

Otros efectos que pueden afectar el desempeño de los reactores enzimáticos
y reducir el rendimiento del proceso deben ser considerados para el estudio de la
cinética de estos:
5.3.2.1 - Efectos inhibidores por sustrato o producto

La inhibición por sustrato, cuando ocurre, es mucho más grave en un reactor
tubular que en uno de agitación continua, ya que en este la enzima está operando
en una concentración idéntica a la del efluente.
103
Este tipo de inhibición se puede minimizar introduciendo sustrato
intermitentemente en un reactor tubular (pistonado) alimentando en varios puntos a
lo largo del reactor, o en un reactor de agitación continua utilizando varios reactores
dispuestos en serie, cada uno alimentado continuamente con sustrato.
Inhibición del sustrato

La ecuación que describe la inhibición de la enzima por el sustrato viene dada por:
dS Vmaxs
r=− =1 dos
dtV K M + s + s (12)
E
KE
T S
R
A través del balance de masa para un CSTR, se obtiene la siguiente
O
relación como conversión enzimática con inhibición por el sustrato:

 sd V
s 0 + K M 1 + 0 (os  −  dos
) = max (13)
−  KE Q
S
De la misma manera, llegamos a una ecuación similar para la conversión

enzimática con inhibición por el sustrato en un PFR:
sd Vmax
s =
s 0+ K en (1 − ) os 0 (  −  do (14)
do E ) Q
ETRO
M
+
sK S
Comparando las ecuaciones, se puede observar que la inhibición por el
sustrato es más evidente en los sistemas PFR (Figura 3). El efecto es menor en un
reactor CSTR, ya que la enzima opera en condiciones en las que la concentración
de sustrato es idéntica a la de la corriente efluente en el reactor.
figura 3 - Efecto de la inhibición del sustrato sobre la conversión () en función del caudal volumétrico (Q) para
un
PFR () es un ---------------- CSTR () por diferentes razones Entonces / Km.
Teóricamente, cuando la inhibición por el sustrato es más severa en un

CSTR, es posible obtener más de un estado estacionario bajo ciertas condiciones
operativas y algunos valores de se vuelven imposibles de lograr.
104
Inhibición del producto
Consideremos dos tipos de inhibición:
Competitivo (cambia el valor de Km): r = dS = Vmax s

1
dtV   
 s + K metro I 
 1K+
  
  ip 
No competitivo (cambia el valor de Vmax): r Vmax s

dS
1
dtV   (S Km )
1+ I 
et
 
 K ip  r
o
La conversión enzimática con inhibición competitiva por el producto en un

CSTR es dado por:
 − K V
s 0+ K M 1 s 0 METRO
= max (15)
−  1 −
dos
K IP Q

Mientras que la conversión enzimática con inhibición competitiva por el
producto en un PFR viene dada por:
 K   s V
1 − METRO
s − 1 + 0 K ln (1 − ) max (dieciséis)
= 0 METRO Q
 K IPIP
  K
Cuando la relación So / Kip es pequeña, la inhibición por el producto no es

grave, pero a valores altos de esta relación y conversiones altas, este efecto
aumenta dramáticamente y la continuidad de la reacción se vuelve desfavorable. El
mismo efecto ocurre con el reactor PFR, pero es más grave en un CSTR ya que el
contenido del reactor es siempre con una alta concentración de producto.
Cuando la enzima está sujeta a inhibición no competitiva, las conversiones
enzimáticas para un CSTR y PFR se describen mediante:
  0 K METRO Vmax
CSTR : s 0 + K − dosS2 1 = (17)
M 1 −  K IP + s0 (1 − )  Q
ETRO 
 s0 KM  (dos −  s 
PFR : 1 + − E s 00
− s do − 1 + 0  K M en (1 − ) = (18)
 KKIP IP 
T s )do IP  K IP  E Vmax Q
R T
O sK R
Para los mismos valores de So, Km, Kip y O se observa que la inhibición no
competitiva provoca un mayor efecto en el progreso de la reacción que la inhibición
competitiva (Figura 4).
105
Figura 4 - Efecto de la inhibición competitiva y no competitiva sobre la conversión () en función del tiempo de
reacción
(t) para la relación So / Km = 10 y diferentes relaciones Kip / Km.
5.3.2.2 - Limitaciones de difusión

Varios autores han observado la influencia de la limitación en la transferencia
de masa externa en reactores de lecho fijo. Este efecto es más significativo a
caudales lineales inferiores a 1 - 2 cm / min. A velocidades de flujo más altas, la
limitación de la difusión externa será pequeña, pero el aumento de la caída de
presión a través del lecho puede convertirse en un problema.
Los reactores de lecho fijo con caudales inferiores a 1-2 cm / minuto causan
problemas de transferencia de masa y, a caudales más altos, este efecto se
minimiza.
La limitación de difusión interna de la velocidad de reacción de una enzima
inmovilizada puede reducirse por varios factores, tales como:
 Disminución de la relación actividad / volumen del soporte, lo que
conduce a una menor concentración de salida por unidad de volumen
del reactor;
 Mayor concentración de sustrato;
 Disminución del grosor o diámetro
del soporte enzimático inmovilizado.
Dado que la concentración de sustrato en un CSTR es igual a la
concentración final de la corriente efluente, es evidente que la limitación de difusión
en el poro se vuelve más grave en un CSTR que en un PFR o en un reactor
discontinuo, donde la concentración de sustrato varía desde el valor inicial de la
alimentación hasta el valor final de la producción.
5.3.2.3 - Efecto de retromezcla en el reactor de flujo de pistón

Es importante conocer el grado de empaquetamiento del lecho y la extensión
de la retromezcla antes de establecer la ecuación cinética de la ecuación del
proceso de un reactor enzimático dado: para valores de So >> Km, el efecto de
retromezcla es insignificante, mientras que para valores de 0,2 <So / Km <100, este
efecto debe ser considerado.
106
5.3.2.4 - Transferencia de temperatura y calor
La temperatura y la transferencia de calor también influyen en la velocidad
de la reacción enzimática y la desnaturalización de la enzima. Estos efectos son
favorables en los reactores de lecho fluidizado y los realizados en lotes y
desfavorables en los reactores de lecho fijo.
5.3.2.5 - Caída de presión

En los reactores de lecho fijo, se deben considerar las posibles variaciones
de presión durante el proceso. Cuanto más pequeñas sean las partículas, mayor
será la caída de presión. Las partículas de menos de 50 mallas no deben usarse en
reactores que operan a gran escala.
5.3.2.6 - Operación de reactores enzimáticos

Durante el funcionamiento del reactor enzimático, puede producirse una
caída de la productividad debido a la pérdida de actividad enzimática debido a la
presencia de inhibidores, producción de calor o espuma, cizallamiento de las
enzimas, contaminación o incluso un patrón de flujo variable.
Un ejemplo que puede citarse es la -galactosidasa, la cual unida
covalentemente a la alúmina porosa sufrió inactivación a temperaturas iguales o
superiores a 25 ° C, quedando completamente inactivada después de 50 ° C.
Los sistemas de monitoreo y control de pH mal diseñados pueden conducir a
la formación de regiones localizadas de valores de pH altos o bajos, lo que provoca
la inactivación enzimática o la hidrólisis de sustratos y productos. Este problema
puede superarse mediante una mezcla más eficaz; sin embargo, esto puede
conducir a la desnaturalización de la enzima libre. En el caso de partículas de
enzima inmovilizadas, una agitación muy intensa provoca fricción entre ellas.
Se sabe que el resultado de la reacción depende de la actividad enzimática
total presente en el reactor. Sin embargo, la actividad por unidad de volumen del
reactor también puede ser un parámetro muy importante. Si los sustratos y / o
productos son inestables en las condiciones de reacción, una alta concentración de
enzima reducirá el tiempo de residencia de estas sustancias en el reactor y, en
consecuencia, las pérdidas.
Para las enzimas inmovilizadas, se puede lograr una alta actividad por
unidad de volumen aumentando la actividad en peso del soporte o aumentando la
cantidad de soporte con la misma carga que la enzima. La unión de una mayor
cantidad de enzima requiere un aumento de la porosidad o una reducción del
tamaño de la partícula no porosa.
En enzimas libres, lo habitual es no reutilizar salvo en el caso de reactores
con ultrafiltración. Suponiendo que los sustratos y productos no son sensibles al
calor, la temperatura de funcionamiento se puede elevar de modo que quede poca
o ninguna enzima activa al final del lote. Si el proceso es continuo, la temperatura
en la corriente de salida aumenta. La desnaturalización de la enzima puede facilitar
la separación de la enzima.
107
La enzima presente en un reactor puede perder actividad con el tiempo
debido a la desnaturalización o al envenenamiento. La desnaturalización puede ser
térmica o resultar de altas tasas de cizallamiento. La enzima puede envenenarse
con inhibidores presentes en la corriente de alimentación, como metales pesados o
productos tóxicos (peróxido). Es importante recordar que a menudo son más
estables térmicamente en presencia del sustrato.
La pérdida de actividad enzimática también puede ocurrir debido a la
contaminación microbiana, que puede minimizarse o eliminarse operando el reactor
a temperaturas superiores a 45oC y / o pH lejos de la neutralidad. Cuando esto no
sea posible o no sea adecuado, la corriente de alimentación se puede filtrar
previamente o tratar con tolueno o formaldehído.
La actividad aparente de la enzima en el reactor disminuirá si cambia la
corriente de flujo en el reactor o si cambia la distribución de la enzima en el reactor.
Otro problema se debe a los reactores con el uso de barreras físicas, como la
membrana de ultrafiltración, donde la enzima (inmovilizada o no) puede acumularse
en la salida.
Puede producirse una pérdida de enzima del reactor debido a la naturaleza
del soporte. Dado que muchos soportes están hechos de polímeros hidrófilos,
pueden solubilizarse con el tiempo. Es importante que cualquier polímero hidrófilo
utilizado como material de soporte sea razonablemente homogéneo en su
estructura química para evitar la solubilización gradual.
En el caso de enzimas inmovilizadas por adsorción, la desorción se producirá
con el tiempo. La adsorción inicial generalmente se realiza en condiciones en las
que el equilibrio favorece fuertemente la unión. Sin embargo, la exposición continua
de la enzima inmovilizada al medio de reacción reducirá la cantidad de enzima que
permanece unida. La tasa de desorción aumentará debido a la presencia de altas
concentraciones de sustrato y sales.
Reactores enzimáticos de membrana

En este reactor hay un caso especial de inmovilización enzimática, donde la
enzima se separa del sustrato o producto a través de una membrana semipermeable,
generalmente una membrana de ultrafiltración con un límite de corte de 10 kDa. Sus
principales ventajas son el alto grado de permeabilidad y el control de la contaminación
microbiana. Los tipos más importantes de reactores enzimáticos se ilustran a
continuación:
108
Tipo 1: Permite que el producto pase a través de la membrana, mientras retiene la enzima
y permite un tiempo de retención suficiente del sustrato en el reactor. Los ejemplos
comerciales están en la producción de L-aminoácidos y en la aminación reductora
estereoselectiva de- cetoácidos con aminoácido deshidrogenasa, formato deshidrogenasa
y NAD +.
Tipo 2: Solo permite el paso limitado de sustrato y producto a través de la membrana,
mientras que la enzima circula por el otro lado cerrado de la membrana. Un ejemplo
comercial fue el desarrollo de un reactor de diálisis con membranas esterilizables en
autoclave.
Tipo 3: La enzima está inmovilizada dentro de la membrana y pueden surgir problemas
con soluciones que contienen partículas o con alta viscosidad. Un ejemplo comercial es la
hidrólisis
5.4 de lactosa.
- REFERENCIAS
― BALCÓN, VM; PAIVA, AL; MALCATA, FX; Biorreactores con lipasas inmovilizadas: estado del
arte. Tecnología enzimática y microbiana, 18, 392–416, 1996.
― GIORNO, L.; DRIOLI, E.; Reactores de membrana biocatalítica: aplicaciones y perspectivas. Trends
in Biotechnology, 18, 339-349, 2000.
1996.
― MARANGONI, AG; Cinética de enzimas: un enfoque moderno; Wiley-Interscience; Nueva Jersey, 2003.
― RIOS, GM; BELLEVILLE, MP; PAOLUCCI, D.; SANCHEZ, J.; Progreso en los reactores
enzimáticos de membrana: una revisión. Journal of Membrane Science, 242, 189-196, 2004.
109
CAPÍTULO 6 - INDUSTRIA DE LA DEGUSTACIÓN
6.1 - CUERO
Los cueros y pieles contienen proteínas y grasas entre las fibras de
colágeno. La proteína es el componente principal del cabello y la piel. El cabello
está compuesto de -queratina (estructura fibrosa), que consta de moléculas de
proteína insolubles que contienen fracciones significativas de residuos de cisteína y
conformación de -hélice. Las diferentes capas de la piel están compuestas por
colágeno, -queratina (epidermis) y elastina. Además, están presentes albúmina,
globulina, glicoproteínas y otras proteínas globulares. El colágeno contiene grandes
fracciones de glicina, alanina, prolina e hidroxiprolina, y tiene una configuración de
triple hélice. El uso de enzimas, con diferentes especificidades, posibilita la hidrólisis
selectiva de los constituyentes no colágenos de la piel.
En el procesamiento de cueros, las proteasas encuentran una amplia
aplicación durante las distintas fases, siendo las más utilizadas las de origen
animal, fúngico o bacteriano, pero en algunos casos especiales, como la producción
de cueros extra suaves, se puede utilizar la papaína..
En la figura 1, el procesamiento del cuero se presenta de forma resumida.
Figura 1 - Pasos de procesamiento de cuero wet-blue
110
6.2 - PASOS DEL PROCESAMIENTO Y APLICACIÓN ENZIMÁTICA
6.2.1 - Salazón
Para conservar los cueros y cueros crudos antes de su elaboración, se
deshidratan y envasan con sal anhidra, o se sumergen en salmuera y se secan al
sol, permitiendo su transporte a largas distancias hasta llegar a la curtiduría. En
esta etapa, lo más importante es evitar la contaminación microbiológica, que podría
dañar el tratamiento enzimático en las otras etapas, generando cueros de baja
calidad.
6.2.2 - Repollo
En las curtidurías, los cueros y pieles se rehidratan para eliminar la sal, las
impurezas, la sangre y los residuos grasos, en una etapa denominada pre-salsa.
Luego, en la etapa de remojo, se eliminan las proteínas no fibrilares, como las
albúminas y globulinas, y se recupera la hidratación original del cuero crudo. En
esta etapa, se utilizan generalmente tensioactivos y conservantes.
Para facilitar este proceso, se utilizan proteasas alcalinas para eliminar estas
proteínas no fibrilares, facilitando la absorción de agua por el cuero y reduciendo el
tiempo de remojo. Las enzimas se pueden usar junto con tensioactivos aniónicos y
no iónicos.
6.2.3 - Desengrasante
El desengrasado con lipasas está asociado con el paso de remojo y se ha
utilizado como una alternativa a los tensioactivos y disolventes. Las lipasas
hidrolizan no solo la grasa de la superficie de los cueros y pieles, sino también la
grasa interna de la estructura del cuero. El uso de lipasas tiene ventajas ya que no
interfieren en la estructura del producto simplemente hidrolizando la grasa.
Además, el uso de enzimas permite la sustitución completa de los
tensioactivos (en el caso de las pieles de bovino) o la reducción de la cantidad de
estos compuestos como en el caso de las pieles de oveja y cordero. De esta
manera, el proceso a base de lipasa es mucho más aceptable para el medio
ambiente que los procesos a base de solventes y tensioactivos.
6.2.4 - Depilación (encalado)

En el proceso de depilación se eliminan tanto el pelo como la epidermis del
cuero crudo, es decir, se eliminaron todas las proteínas no fibrilares residuales
remanentes del paso de remojo, con una mezcla de cal hidratada (CaO), soda
(NaOH) y sulfuro de sodio (Na2S).
Esta etapa tiene varios problemas para generar efluentes con alto contenido
de materia orgánica, 60 a 70% de queratina solubilizada y liberación de sulfuro, en
forma de H2S, que es un gas nocivo.
111
Con el uso de proteasas alcalinas, la cantidad de cal y sulfuros requeridos se
reduce a más de la mitad, y el proceso en pocos días se reduce a 6 horas. Como
resultado, se mejora la calidad final del cuero, se produce menos efluente, se
obtiene un aumento de alrededor del 2% en la relación rendimiento / área en el
caso de las pieles bovinas, con un aumento del 1% pagando el costo de la enzima.
.
6.2.5 - Purgar
Antes del curtido, el cuero encerado debe neutralizarse parcialmente con
ácidos orgánicos, antes de comenzar el paso de purga.
El propósito del purgado es suavizar el cuero mediante un tratamiento
enzimático que elimina las glicoproteínas y residuos de las otras etapas y relaja las
fibras de colágeno del cuero. El grado de purga depende de las características
deseadas en el cuero acabado. El cuero de los guantes, por ejemplo, debe ser
suave y flexible y, por lo tanto, se somete a un fuerte purgado, mientras que el
cuero para suelas de zapatos se purga ligeramente. El cuero de la parte superior de
los zapatos se somete a una purga intermedia, es decir, entre los dos extremos
mencionados anteriormente.
Tradicionalmente, los excrementos de perros y palomas se usaban como
agente de purga. Además de ser un proceso difícil de controlar, con resultados
impredecibles, los excrementos no contribuyeron exactamente a la creación de un
ambiente de trabajo saludable, siendo actualmente, en el proceso de depuración se
utilizan proteasas pancreáticas, como la tripsina, y hongos ácidos.
6.2.6 - Bronceado
Después del tratamiento anterior, el cuero se curtió con cromo, taninos o
aceites animales, que deshidratan el cuero, provocando que las fibras de colágeno
se peguen y luego se tiñe. Aunque las enzimas no están directamente involucradas
en este paso, los tratamientos enzimáticos previos influyen en la calidad del
bronceado.
Ya existen tratamientos enzimáticos para cueros curtidos con aplicación de
proteasas, específicos para la degradación de la elastina, lo que genera un
aumento de la superficie del cuero, resultando también en un mejor precio.
Proceso enzimático en 1 paso

Este proceso fue creado para abarcar los pasos de remojo, desengrasado, encerado
y purgado en una sola operación. En comparación con el proceso convencional, este
consigue reducir a la mitad el tiempo de tratamiento y el consumo de agua, ocurriendo
como máximo en 24 horas y utilizando una cantidad de proteasas y lipasas de 0,2 a 0,3%
(v / p).
112
6.3 - REFERENCIAS
― DAYANANDAN, A.; KANAGARAJ, J.; SOUNDERRAJ, L.; GOVINDARAJU, R.; RAJKUMAR, G.
S.; Aplicación de una proteasa alcalina en el procesamiento del cuero: un enfoque ecológico. Journal
of Cleaner Production, 11, 533-536, 2003.
1990.
1996.
― NOVOZYMES; El miedo a los bronceadores. Biotimes, marzo de 2003.
― NOVOZYMES; Las curtidurías de Pakistán se benefician. Biotimes, marzo de 2005.
― THANIKAIVELAN, P.; RAO, JR; NAIR, BU; RAMASAMI, T.; Avances y tendencias recientes en
los métodos biotecnológicos para el procesamiento del cuero. Tendencias en biotecnología, 22 (4),
181-188, 2004.
113
CAPÍTULO 7 - INDUSTRIA TEXTIL
7.1 - PASOS DEL PROCESAMIENTO DE FIBRA DE ALGODÓN
El procesamiento textil consiste en beneficiar, es decir, transformar y mejorar
la materia prima para aumentar la resistencia mecánica, conferir diferentes
propiedades sensoriales, permitir nuevos patrones, entre otros. Las industrias
textiles pueden utilizar fibras naturales, como algodón, lana, seda, lino y ramio; o
fibras artificiales, como rayón (viscosa) y acetato; o incluso fibras sintéticas,
poliéster, nailon, acrílico y lycra.
El algodón, considerado un producto básico, se presenta empacado en
fardos donde se procesa en abresurcos, batidores, cardas, tacos, tocadores,
mecheras, hiladoras, torcedoras y canicaleiras, sin generar residuos líquidos. El
proceso es idéntico para otras materias primas utilizadas.
7.1.1 - Limpieza
El propósito de la preparación para el hilado es eliminar la suciedad del
algodón y hacer que las fibras sean paralelas para el inicio de todo el
procesamiento posterior, como se muestra en la figura 1.
Materia prima Fibra Hilo

Limpieza Hilado
Tela cruda
Tec se Cantando Planchar Tejer
Acab vol Desengomaje
vió
dul
ce
Purga
Blanqueamiento
De coser Tintura
Ropa
terminad
Ropa a
Lavado
Figura 1 - Etapas del procesamiento textil
7.1.2 -
Alambra
do
El hilo se produce en máquinas especiales llamadas máquinas de hilar. El
algodón en forma de hilo, se enrolla en rollos (urdimbre) o conos (trama), para teñir
o tejer.
114
7.1.3 - planchado
Es el proceso por el que pasan los hilos para aumentar su resistencia
mecánica, resistir esfuerzos en los telares y dar como resultado un hilo más
incorporado en la etapa de confección. Con este proceso se consigue un mejor
estiramiento del hilo que se está trabajando.
Las gomas utilizadas son adecuadas para cada tipo de hilo, si el objetivo es
un tejido más firme se agrega una solución de goma más concentrada.
Generalmente, se utilizan dos tipos básicos de chicle:
• Goma de almidón de mandioca;
• Gomas sintéticas, a base de poliacrilato, carboximetilcelulosa y alcohol
polivinílico (PVA);
Los alambres se planchan a una temperatura aproximada de 100ºC,
mediante procesos continuos o por inmersión.
7.1.4 - Costura
Es el proceso mediante el cual los hilos se transforman en tela en los telares.
No hay generación de residuos en esta etapa.
7.1.5 - Cantando
Es la combustión del plumón de la tela, que se obtiene al pasarla en contacto
con una llama directa. Este paso es posterior al tejido y tampoco genera residuos.
7.1.6 - Desgomado y lavado

El desgomado es la eliminación, mediante el uso de productos químicos, de
la goma de mascar aplicada a la tela antes de tejer. Suele desarrollarse en una
impregnación o impregnadora "Foulard", donde se empapa el tejido en un baño con
enzimas, detergentes o jabones alcalinos calientes, y emolientes, disueltos en agua
con la función de eliminar las encías, lo que ocurre después de un período de de
dos a diez horas, dependiendo de la cantidad de chicle a quitar del tejido, a una
temperatura superior a 120º C.
Otro proceso de impregnación que se diferencia de este es el uso de vapor
como medio de solución, que también ayuda en el proceso de blanqueo al acelerar
la oxidación, ya que elimina los aceites orgánicos del algodón. El proceso de
vaporización significa que la cocción se realiza mediante vapor, sosa cáustica y
productos químicos.
Esta operación de desgomado es responsable de aproximadamente el 50%
de la carga orgánica de los residuos textiles. Las gomas naturales producen un
efluente biodegradable y, por lo tanto, se prefieren a las sintéticas.
115
7.1.7 - Pre-blanqueo
Es el proceso de blanqueo inicial de la malla, tiene la función de limpiar las
impurezas de la misma, como eliminar grasas y otros componentes, o compuestos
químicos. Este paso dura aproximadamente 1 hora y media.
Otro proceso muy utilizado también para este fin es el purgado, en el que los
batidores giran durante dos horas, para una mejor eliminación de grasas, con el fin
de obtener un tejido básicamente libre de residuos. Generalmente se utiliza para
teñir colores oscuros, ya que requieren un tejido en condiciones adecuadas para la
fijación de los tintes. El pre-blanqueo es un proceso previo para teñir el tejido.
7.1.7 - Blanqueamiento
El blanqueamiento consiste en el blanqueamiento de la tela, de forma más
precisa, para obtener una malla o tejido con suficiente claridad y uniformidad. Se
buscan el blanco óptico y las condiciones para teñir en colores claros.
En estos procesos de blanqueo previo y blanqueo, siguen los lavados con
agua limpia. El hipoclorito de sodio y el peróxido de hidrógeno son algunos de los
productos químicos muy agresivos que se utilizan en este paso.
7.1.8 - teñido
El teñido consiste en el proceso de teñir los tejidos, variando en infinidad de
colores, muchas veces similares, con poca diversidad de tonos, pero que requieren
una especificación específica para su fabricación. Para ello se utilizan recetas, que
son únicas para cada color, presentando cantidades exactas de tinte o mezcla.
Cada receta específica es un factor determinante para obtener el resultado
esperado.
El baño preparado para la etapa de tintura se desarrolla en un proceso
continuo o discontinuo. En el proceso continuo, la tela, luego de ser impregnada en
un baño que contiene tinta y productos químicos, se exprime entre rodillos y se
seca, generalmente elaborada en los "Foulards". En el proceso de lote o
agotamiento, la tela se tiñe por cargas, se coloca en las máquinas y se espera que
la operación finalice para teñir una nueva carga. Se puede desarrollar de tres
formas diferentes:
• Procesar con tejido en movimiento y el baño en reposo. Fabricado en "barcazas"
y "jiggers".
• Procesar con tejido en reposo y baño en movimiento. Fabricado en "autoclaves"
y "turbos".
• Procesar con la tela y el baño en movimiento. Celebrada en los "chorros".
116
7.1.9 - Lavado
Los tejidos estampados, teñidos y los destinados al corte directo, se lavan en
jaboneras. Estas lavadoras pueden ser de flujo continuo, en las que la tela entra y
pasa por cámaras, generalmente de tres a cinco, de donde sale lavada al final.
El lavado se puede hacer en las máquinas que hacen el teñido, y luego
pasar directamente a las secadoras. O se pueden utilizar arandelas de
contracorriente, donde el tejido entra por un lado y agua limpia por el otro (punto de
salida del tejido), de manera que el tejido a su salida se aclara con agua limpia, sin
dejar impurezas acumuladas en el operación.
7.2 - APLICACIÓN ENZIMÁTICA
7.2.1 - Limpieza
La producción de fibras textiles naturales implica el paso de liberar fibras
celulósicas del tallo de las plantas, mediante la destrucción total de la pared
secundaria, que está compuesta por sustancias pécticas en su gran totalidad. Las
fibras están hechas de celulosa y generalmente se encuentran en haces, que son
las llamadas fibras naturales del comercio.
La presencia de estas sustancias pécticas hace que los haces fibrosos,
obtenidos en el campo, necesiten un tratamiento para que esta fibra pueda hilarse.
Este tratamiento se realiza, en general, con el uso de sosa cáustica bajo presión y
acción de altas temperaturas. El uso de sosa cáustica es problemático debido a la
seguridad laboral y la contaminación ambiental, lo que genera un aumento de los
costos. De ahí la búsqueda de procesos alternativos de desgomado como el uso de
enzimas pectinolíticas que actúan sobre las sustancias pécticas de las plantas
fibrosas.
En un estudio comparativo de tratamientos químicos y enzimáticos, se
demostró que el uso de enzimas permite obtener resultados más rápidos, además
de la posibilidad de una marcada reducción en el tratamiento de los efluentes
producidos habitualmente con el uso de productos químicos.
En la elección del microorganismo productor de pectinasas para la industria
textil, se debe considerar la eficiencia en la producción de enzimas pectinolíticas,
asociada a la baja actividad de las celulasas, ya que estas enzimas actúan
debilitando las fibras naturales que se componen de celulosa. Hongos del género
Penicilium sp. fueron seleccionados porque tienen tales características. Las
principales fibras naturales en estudio son: yute, malva y lino.
7.2.2 - Degomaje
Este proceso de desgomado se puede realizar tratando el tejido con
productos químicos fuertes como ácidos, bases o agentes oxidantes. Sin embargo,
durante muchos años, el uso de enzimas que hidrolizan el almidón ha sido el
método preferido debido al alto grado de eficacia y su acción específica.
117
Las amilasas eliminan completamente la encía sin dañar el tejido. Otra
ventaja es el hecho de que las enzimas son inocuas para el medio ambiente, por lo
que los efluentes de este proceso son más aceptables desde el punto de vista de la
protección ambiental. Las principales enzimas amilasas utilizadas en el
procesamiento textil son las -amilasas bacterianas termotolerantes, capaces de
actuar a altas temperaturas (105-110 ° C), pero también se pueden utilizar otras,
como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1 - Enzimas comerciales utilizadas para eliminar los adhesivos a base de almidón de los tejidos
Tipo de enzima temperatura pH inhibidores activadore

de s
funcionamie
nto (ºC)
Amilasa de malta 55-65 4.5-5.5 iones metálicos, álcalis, iones de
contaminantes de calcio
almidón
Amilasa del 40-55 6.5-7.0 iones metálicos, -
páncreas ácidos
Amilasa fúngica 50-55 4.5-5.5 iones metálicos, álcalis, iones de

depuradores calcio
Amilasa bacteriana 60-75 5.5-7.0 secuestradores, iones de

tensioactivos aniónicos calcio
Amilasa bacteriana 85-110 5,0-7,5 tensioactivos iones de

termoestable aniónicos calcio
Este proceso de desgomado enzimático continuo (figura 2) se produce en

unos pocos pasos:
• Prelavado: promueve la hinchazón de las fibras y el almidón, permitiendo que
las enzimas se difundan en el tejido, utilizando agua caliente y tensioactivos no
iónicos, eliminando ceras, grasas y encías sin almidón.
• Impregnación: similar al prelavado, pero realizado con licor que contiene la
enzima ya una temperatura y pH adecuados para su acción. Por lo general,
proporciona la absorción de una solución de 90-110% en función del peso de la
tela.
• Hidrólisis de almidón: etapa en la que el tejido permanece incubado con la
enzima, demorando de 2 minutos a 16 horas, dependiendo del proceso. En un
sistema por lotes, el rollo de tela se cubre con una cubierta de plástico para no
perder humedad. Con el uso de enzimas termoestables, este paso de hidrólisis
puede ser tan rápido como 30-60 segundos, con temperaturas mantenidas con
vapor saturado entre 90 y 110ºC. El progreso de la degradación del almidón se
controla mediante la reacción de la solución diluida de I2 / KI con el almidón,
generando un color azul índigo.
• Lavado: la eliminación de los productos de hidrólisis es fundamental para el éxito
del proceso de eliminación del almidón. Por lo general, la temperatura en esta
etapa es lo más alta posible (95-100ºC). También es conveniente agregar
118
lavar algunos detergentes y NaOH que faciliten la solubilización del almidón
hidrolizado.
• Lavado final: destinado a la eliminación de detergente y álcali (a veces, el álcali
se neutraliza primero).
Amilasa
Prelavado Impregnación Hidrólisis de

almidón
Lavado
Figura 2 - Desengrase enzimático continuo
7.2.3 -
Blanqueamien
to
Las telas naturales, como el algodón, generalmente se blanquean con
peróxido de hidrógeno antes de teñirlas. Los blanqueadores son productos
químicos altamente reactivos y algo de peróxido que queda en la tela puede
interferir con el proceso de teñido. Es por eso que se necesita una “focalización más
eficiente”. En el método tradicional, la lejía se neutraliza con un agente reductor,
pero la dosis debe controlarse con precisión.
Las enzimas ofrecen una alternativa más conveniente porque son más
fáciles y rápidas de usar. Una pequeña dosis de catalasa puede descomponer el
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. En comparación con los métodos
tradicionales, el proceso enzimático da como resultado una descarga de agua
menos contaminada o una reducción del consumo de agua.
7.2.4 - teñido
Un tratamiento enzimático con celulasas conocido como biopulido se ha
utilizado, hasta ahora, principalmente para tejidos de algodón. Otras fibras naturales
a base de celulosa también se pueden mejorar con este tratamiento. Como sugiere
el nombre, el tratamiento confiere al tejido un aspecto más regular y brillante. El
tratamiento se utiliza para eliminar los diminutos filamentos de la fibra que
sobresalen de la superficie del alambre y forman concentraciones en forma de
microfibrillas.
119
Estas pequeñas concentraciones pueden representar un serio problema de
calidad ya que dan como resultado un tejido nudoso, con un aspecto poco atractivo.
Después del biopulido, es mucho menos probable que el tejido forme estas
microfibrillas. Otras ventajas de eliminar la pelusa son un manejo más suave y fluido
y un brillo superior en los colores.
La lana está formada por proteínas y, por tanto, el tratamiento debe
realizarse con proteasa. Boca arriba es el término industrial para surcar la superficie
de los tejidos de lana a través de la acción abrasiva durante el teñido. Para teñir, las
telas de lana generalmente se colocan en baños grandes en máquinas de paletas
laterales. Las cuchillas giran durante 2 a 3 horas, lo que hace que la superficie de la
lana sea más escamosa. Ésta es una de las principales razones para hacer frente.
Hasta la llegada de las enzimas, ningún tratamiento previo pudo reducir este
fenómeno. Ahora es posible minimizar el problema y, además, obtener tejidos más
suaves. Las pruebas muestran que el rendimiento de los tejidos en términos de
formación de microfibrillas ha mejorado significativamente. Y si se forman, tienen
mayor tendencia a caer, porque hay menos puntos de anclaje en la superficie de la
lana. Tratamiento enzimático, sin embargo, no elimina la necesidad de agregar
suavizante a la lana, pero la cantidad puede reducirse. Esto puede evitar la
sensación grasosa que a veces se obtiene como resultado del acondicionador.
Aunque el tratamiento enzimático modifica las fibras de lana, no afecta
significativamente las propiedades mecánicas de la lana. Se probó la resistencia a
la rotura de la lana, mostrando solo una ligera reducción después del tratamiento
enzimático. Es importante tener en cuenta que las enzimas, en este caso, son
efectivas solo en lana que ha sido previamente clorada, un tratamiento para
estabilizar la tela contra el encogimiento durante el teñido. Aparentemente, la
cloración abre la estructura de la lana a la acción enzimática.
7.2.5 - Acabado de jeans

Muchas prendas de vestir informales se someten a un tratamiento de lavado
para darles una apariencia de desgaste superficial. El ejemplo principal es el denim
lavado a la piedra. En el proceso tradicional de lavado a la piedra, el denim azul se
desvanece superficialmente por la acción abrasiva de la piedra pómez.
Actualmente, los lavados de jeans utilizan una celulasa especial para acelerar la
abrasión. La celulasa trabaja para disolver la tinta azul índigo de la mezclilla en un
proceso conocido como biolavado (biostonización). Una pequeña dosis de enzimas
puede reemplazar varios kilos de cálculos. El uso de menos piedras da como
resultado menos daño a la ropa, menos gastos de las máquinas y menos cantidad
de polvo de piedra pómez en el entorno de la lavandería.
El biolavado trajo un aumento de nuevas posibilidades para el acabado de
jeans. Es posible, por ejemplo, desteñir los jeans en mayor medida sin riesgo de
dañar la tela. También se puede aumentar la productividad, ya que las lavadoras
utilizan menos piedra y más ropa.
120
Las principales enzimas utilizadas son las celulasas producidas por
Trichoderma sp. y Humicola sp., que actúan a pH 4-7. Las celulasas neutras tienen
una ventaja sobre las ácidas debido al pH neutro, en el que se produce poca o
ninguna reposición del colorante, y la enzima ofrece una menor reducción de la
resistencia del colorante. hilos que al obtenido con celulasas ácidas.
Procesamiento de seda
El filamento de seda tiene un recubrimiento compuesto principalmente por una
proteína llamada sericina o goma de seda, que engloba y se une a la fibroína, que es la
principal fibra proteica de la seda. El filamento de seda consta de 20% de sericina y 80%
de fibroína, y para la eliminación de la sericina se utilizaron soluciones alcalinas y
tensioactivos.
Actualmente, las proteasas bacterianas alcalinas se utilizan para eliminar la
sericina (desgomado) entre 0,5 a 1 hora de proceso, a una temperatura de 55 a 60 ° C,
seguido de blanqueo con peróxido de hidrógeno y lavado del material.
7.3 - REFERENCIAS
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mediante enzimas celulasa y xilanasa comerciales. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 11,
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― PAZARLIOGLU, NK; SARIISIK, M.; TELEFONCU, A.; Tratamiento de tejidos de mezclilla con
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1996.
http://www.cataguases.com.br/eng/index.htm
121
CAPÍTULO 8 - INDUSTRIAS DEL PAPEL Y CELULOSA
Hasta hace poco, el uso de enzimas en la industria del papel y la celulosa no
se consideraba técnica y económicamente viable. Sin embargo, la investigación de
instituciones científicas y productores de enzimas ha llevado al desarrollo de nuevas
enzimas que ofrecen importantes beneficios para la industria de la pulpa y el papel,
particularmente desde el punto de vista ambiental. Adicionalmente, el significativo
incremento en la producción de papel observado en los últimos años (figura 1)
justifica las inversiones realizadas en el sector.
Figura 1 - Evolución de la producción de celulosa (Fuente: Aracruz Celulose)
Algunos ejemplos de aplicación se pueden implementar en diferentes etapas

del procesamiento industrial de la madera en las fábricas de papel: uso de
pectinasas en el descortezado de madera, biolignificación de astillas por hongos
lignolíticos, bioblanqueo de pulpas por xilanasas y pulpa de papel por celulosas en
reciclaje y tratamiento. de efluentes por enzimas lignolíticas o por sus hongos
productores.
Los productos a base de enzimas también actúan directamente para romper
cadenas carbonatadas de grasas, aceites, grasas, proteínas y carbohidratos,
favoreciendo así la limpieza de los equipos y aumentando su vida útil. El proceso
hace que los residuos se desprendan más fácilmente de la superficie, colaborando
con el tratamiento del efluente generado dentro del propio proceso productivo,
contribuye a un aumento significativo de la producción y reduce los tiempos muertos
por limpieza.
8.1 - PRODUCCIÓN DE PAPEL Y CELULOSA

La materia prima utilizada en la producción de papel y celulosa es la madera,
que consta de 3 sustancias principales - celulosa, hemicelulosa y lignina - y
pequeñas fracciones de extracción. Cada fibra de madera está hecha de celulosa y
hemicelulosa. La lignina tiende a volverse amarilla y, a veces, marrón. Los
extractos, también conocidos como savia o "brea", actúan como mecanismo de
defensa del árbol frente al ataque de microorganismos.
122
En el proceso de remoción de celulosa, busca desintegrar la madera y formar
una suspensión de fibras. Básicamente, se utilizan dos procesos para obtener
celulosa:
• Remoción mecánica: las fibras se separan mediante prensado y generalmente
se consideran celulosas de alto rendimiento, ya que todos los componentes de
la madera se conservan en la pulpa, incluida la lignina. Es relativamente
económico de producir, pero tiene la desventaja de oscurecerse cuando se
expone a la luz solar.
• Eliminación de productos químicos: Las astillas de madera se sumergen en
compuestos químicos a altas temperaturas hasta que la lignina se disuelve,
liberando las fibras de celulosa. El proceso químico de eliminación de celulosa
más utilizado es el proceso KRAFT, en el que se obtiene una celulosa de color
marrón oscuro. La celulosa debe blanquearse antes de poder procesarla en
papel fino.
La Figura 2 muestra un resumen de la producción tradicional de papel con
alternativas enzimáticas.
Figura 2 - Producción de papel con alternativas enzimáticas
8.1.1 - Decapado de madera

La remoción de la corteza es el primer paso en el procesamiento de la
madera y es necesaria debido al pardeamiento que esta fracción provoca en los
productos finales.
El tratamiento enzimático de los troncos tiene como objetivo facilitar el
trabajo de las máquinas. El efecto del pretratamiento proporciona disminuciones de
hasta un 80% del gasto energético mediante la acción de las enzimas pectinolíticas.
Además de la poligalacturonasa, las enzimas pectinolasa y xilanasa también están
presentes en la mayoría de las preparaciones más eficaces.
En Brasil, este problema apenas ocurre debido al gran uso del eucalipto
como materia prima, que no tiene corteza. Los lugares donde se utilizan pinos
requieren un descortezado eficaz.
123
8.1.2 - Blanqueo de pulpa
El cloro y sus derivados son, con mucho, los agentes blanqueadores más
baratos y versátiles para la celulosa obtenida químicamente. Sin embargo, tienen el
inconveniente de formar sustancias orgánicas cloradas (algunas tóxicas) durante el
blanqueo. La industria de la pulpa y el papel está sometida a una presión cada vez
mayor por parte de las autoridades, los consumidores y los grupos ecologistas para
reducir el uso de blanqueadores químicos a base de cloro y, en consecuencia, la
descarga de estos compuestos orgánicos clorados.
La gran mayoría de las ligninas se descomponen en la etapa de cocción
alcalina; una pequeña parte de la celulosa y la hemicelulosa se disuelve en esta
etapa. Las hemicelulosas son, en su mayor parte, polímeros de xilano. Este
polisacárido es un gran inhibidor del blanqueo de la pulpa de celulosa, ya que
vuelve a precipitar sobre las fibras. Esto aumenta la necesidad de utilizar agentes
oxidantes.
Con el tratamiento enzimático (mediante el uso de xilanasas) de la pulpa
KRAFT antes del blanqueo, es posible obtener una hidrólisis parcial de
hemicelulosa muy selectiva. La enzima tiene dos efectos indirectos:
• Permite eliminar más lignina de la celulosa y;
• Hace que la celulosa sea más susceptible a los abrillantadores químicos.
La técnica se denomina "mejora del blanqueo", que reduce significativamente
la necesidad de un uso excesivo de agentes químicos en la etapa de blanqueo
posterior. Las xilanasas no solo eliminan el xilano, sino que también conducen a
una disminución en su grado de polimerización. Las xilanasas no solo se han
aplicado en secuencias con cloro elemental o dióxido de cloro, sino también con el
uso combinado de oxígeno, ozono y peróxido de hidrógeno.
En el proceso KRAFT, las astillas de madera se hierven en un líquido de
celulosa alcalina que contiene hidróxido de sodio y sulfato de sodio. La pasta de
celulosa obtenida en este proceso se lava en varias etapas, pero sigue siendo
bastante alcalina con un pH entre 8-11 y una temperatura típica entre 55-65 oC.
Para utilizar las enzimas en esta etapa, se realizaron estudios para producir
xilanasas más adecuadas a las condiciones de fabricación. Esta nueva xilanasa se
considera alcalina y termoestable porque actúa mejor a pH 6,5 - 9,5 y a
temperaturas de 40 - 65 oC, por lo que es más resistente a las fluctuaciones en las
condiciones del proceso. Esto ofrece una mayor flexibilidad operativa en la sección
de orientación.
En Escandinavia, el cloro elemental ha sido reemplazado por completo por
dióxido de cloro, porque genera un efluente menos dañino cuando se desecha en el
medio ambiente. Por otro lado, las celulosas totalmente sin cloro se blanquean con
peróxido de hidrógeno y ozono.
124
El peróxido de hidrógeno no es tan barato y eficaz como el cloro o el dióxido
de cloro, pero por el contrario no produce compuestos clorados en el efluente.
Todavía es muy difícil obtener una celulosa blanqueada con una blancura
suficientemente alta con un blanqueo hecho solo con peróxido de hidrógeno.
Además, el blanqueamiento con ozono representa una importante inversión de
capital.
La introducción del paso de refuerzo enzimático puede tener un efecto
valioso en la conservación de estas cualidades. Los experimentos han demostrado
que al tratar una celulosa química con xilanasa antes de blanquear con peróxido de
hidrógeno, es posible mejorar el nivel final de blancura con un ISO de 1,5 a 3%.
Esta nueva xilanasa permite mantener el mismo nivel de blancura, utilizando un
10% menos de peróxido de hidrógeno.
8.1.3 - Reducción del contenido de resina (tono)

El término brea se refiere a una variedad de resinas orgánicas de bajo y
medio peso molecular y los depósitos que originan estas resinas. La brea incluye
ácidos grasos, resinas ácidas y sus sales solubles y ésteres de ácidos grasos como
glicerol y esteroles, así como grasas y ceras.
Los problemas de tono son comunes en las fábricas de papel. Las razones
son los extractos que están presentes en la eliminación mecánica de la celulosa,
nada más entrar en las máquinas de papel. Los glóbulos de brea tienden a perforar
equipos, como cajas de válvulas, filtros y cilindros. Las piezas perforadas pueden
provocar agujeros en el papel, que luego tendrán una calidad reducida o se
reciclarán. En el peor de los casos, el rollo de papel puede romperse provocando
costosas paradas de producción.
Estos depósitos se pueden encontrar en la pulpa o en los molinos de la
empresa papelera y pueden alterar fuertemente la calidad del producto, la velocidad
de producción, disminuir la eficiencia de lavado de la pulpa, centrifugación y
refinado. También pueden generar impurezas y hacer que aparezcan agujeros,
perforaciones o costras en la hoja de papel final.
Se desarrolló una lipasa comercial para su uso en fábricas de papel. Esta
enzima demostró ser capaz de reducir significativamente los depósitos de brea en
cilindros y otros equipos. De esta forma, conduce a un aumento considerable de la
productividad, manteniendo la calidad del producto final.
Esta enzima hidroliza muchos triglicéridos en la resina de celulosa de la
misma manera que el crecimiento de bacterias y hongos reduce el volumen de
resina de madera durante el secado convencional.
Se logró una reducción de brea en pilas de chips, utilizando un producto
fúngico que produce lipasas y hemicelulasas, sin celulasas ni ligninasas.
Actualmente, se cree que el uso de mezclas de cepas es más eficiente, así como el
uso de poligalacturonidasas tiene un gran potencial en la eliminación de polímeros
catiónicos en la producción de papel.
125
8.2 - REVESTIMIENTO DE PAPEL
En la fabricación de papel, los adhesivos a base de almidón se utilizan tanto
para reforzar la base del papel como para revestir su superficie. El almidón natural
no es adecuado para estos fines. Para obtener suficiente poder adhesivo con
almidón natural, sería necesario aplicar una solución bastante fina para un uso
práctico.
En cambio, con almidón modificado químicamente, se usa una solución que
tiene una viscosidad mucho menor. Como alternativa económica a la modificación
del almidón por agentes oxidantes agresivos, se puede tratar el almidón con
enzimas ( -amilasas) y obtener el mismo efecto fluido. El almidón modificado se
puede obtener de los productores de almidón o se puede fabricar en fábricas de
papel mediante un proceso de producción por lotes o un proceso continuo.
8.3 - RECICLAJE DE PAPEL
El reciclaje ahorra energía y árboles y reduce la presión sobre los vertederos,
provocada por la gran cantidad de residuos generados. Según estimaciones, no
habrá suficiente espacio en los vertederos para depositar todos los residuos
municipales en el futuro. El papel representa el 37% del peso total de los residuos
sólidos.
Una mezcla de enzimas compuesta por celulasas y hemicelulasas tiene un
efecto notable en el procesamiento de fibras secundarias. En este proceso, se
puede utilizar papel de baja calidad para lograr buenas propiedades mecánicas del
producto reciclado final. Las pruebas de laboratorio, con papel industrial sometido a
la acción de enzimas, permitieron mejorar notablemente la capacidad de drenaje y,
en algunos casos, las propiedades mecánicas. El punto clave es controlar el
progreso de la reacción enzimática. Las enzimas actúan sobre la superficie de las
fibras produciendo el efecto peeling. La reducción de las interacciones pulpa-agua
permite un mejor drenaje de la suspensión de fibras secundarias, sin afectar las
propiedades finales del papel. Además,
8.4 - DESTINO
Antes de que se pueda reciclar el papel de oficina viejo y similares, se debe
quitar la tinta. Los métodos actuales involucran la celulosa del papel en una
solución altamente alcalina. En estas condiciones, la celulosa tiene una fuerte
tendencia a oscurecerse y se utilizan grandes cantidades de peróxido de hidrógeno
para mantener la celulosa blanca. Para estabilizar el peróxido, se necesitan más
productos químicos.
Sin embargo, es posible limpiar el papel mezclado usando solo dosis bajas
de enzimas sin agregar hidróxido de sodio o peróxido. Las celulasas alcalinas son
las más adecuadas para distinguir papeles mixtos.
126
Una de las principales razones es el altísimo contenido de material de relleno
en el papel, especialmente carbonato cálcico, que confiere a la celulosa un alto
valor de pH, y no es práctico desde el punto de vista productivo ajustar el pH a
valores inferiores a 7, 0.
Las celulasas no tienen ningún efecto sobre la tinta, pero actúan sobre la
celulosa que atrapa las partículas de tinta en el papel. Se cree que las enzimas
eliminan las microfibrillas que sobresalen de la superficie de las fibras del papel. El
resultado es que las partículas de tóner (tinta) impresas en el papel se aflojan, lo
que las hace más susceptibles a cortes mecánicos. Para obtener los mejores
resultados, se debe utilizar una consistencia menos diluida al recuperar la celulosa
con un contenido de sólidos del 10 al 20%.
La celulasa puede eliminar pequeños trozos de material de celulosa
adheridos a las partículas de tinta, haciéndolas más hidrófobas. Esto mejora
significativamente la flotación, tradicional para remover pintura, usando solo 200 a
300 ml de solución enzimática por tonelada de celulosa.
8.5 - TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES

Aunque han surgido resultados sobre la eficacia de las lacasas, peroxidasas
y ligninasas en el tratamiento de efluentes de plantas de producción de celulosa y
papel, es necesario que las enzimas estén inmovilizadas para que las técnicas sean
económicamente viables.
La lacasa y la peroxidasa de rábano (Raphanus sativus) (sin ninguna
inmovilización) fueron eficaces en la decoloración de efluentes fenólicos, pero la
lacasa inmovilizada en alginato y por copolimerización con gel fue extremadamente
más eficaz. La peroxidasa libre e inmovilizada demostró ser eficaz en la
biodegradación de fenoles y clorofenoles.
Además, el tratamiento enzimático realizado en otras etapas del
procesamiento del papel ya ayuda mucho al tratamiento biológico de los efluentes,
ya que los tratamientos químicos convencionales terminan alterando y destruyendo
la microflora que actúa en el proceso de degradación y mineralización de la materia
orgánica en el efluente. .
Eliminación de limo
Al igual que la brea, la deposición de lodo causa importantes problemas
operativos. El limo generalmente está formado por un polímero de fructosa con enlaces-
2,6, denominada levana, secretada por Bacillus sp. y Pseudomonas sp., que crecen en
agua que se recircula en equipos y donde la concentración de compuestos biocidas es
baja.
El uso de la enzima levanasa puede hidrolizar este polímero a oligómeros de baja
masa molar, que son solubles en agua, eliminando así el fango del sistema. Levanase
actúa en óptimas condiciones en un rango de pH entre 4 y 8, y una temperatura de 50 ° C.
127
8.6 - REFERENCIAS
― ARCHIBALD, FS; BOURBONNAIS, R.; JURASEK, L.; PAICE, MG; REID, ID; Pulpa kraft
blanqueamiento y deslignificación por Trametes versicolor. Revista de biotecnología, 53, 215-236, 1997.
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calidad no maderera mediante el sistema lacasa-mediador. Tecnología enzimática y microbiana, 35,
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http://www.irani.com.br/ estrutura.php? id = 96
128
CAPÍTULO 9 - HORNEAR
El uso del grano de trigo como alimento se inició hace unos 17000 años,
donde el hombre lo molía para obtener harina, que mezclada con agua y cocida en
piedras calientes, formaba el primer pan. Luego, con nuestra evolución en el
tiempo, la fermentación y la cocción se implementaron en la repostería.
El pan blanco tiene un alto valor energético, proporcionando alrededor del 20
al 50% de las necesidades energéticas diarias, variando en cada región del mundo
según su consumo, como se ve en la figura 1.
Figura 1 - Consumo de pan en Brasil y Europa, respectivamente (dado 1999)

Como todos los demás materiales vivos, las células de los cereales que se
utilizan en la harina contienen enzimas. Las enzimas más importantes de la harina
son las amilasas y las proteasas. Sin embargo, las cantidades de estas enzimas no
siempre son las ideales y, a menudo, es necesario agregar enzimas
complementarias. Estos se utilizaron para mejorar el pan, afectando realmente su
sabor, volumen, aroma, estructura de la cáscara y la miga, proporcionando
suavidad y durabilidad en el almacenamiento.
El pan dicho “como granos blandos” solo se puede elaborar con harina de
trigo, ya que el gluten es el responsable de esta suavidad, que se compone de dos
proteínas principales: Gliadina, responsable del control de volumen del pan y
Glutelin, responsable del tiempo. amasado y desarrollo de la masa. Las expresiones
“trigo blando” y “trigo duro” surgen del contenido de gluten. Por ejemplo, el pan
francés debe elaborarse con un equilibrio de trigo duro y blando; la pasta debe
prepararse con trigo duro.
9.1 - EL PAPEL DE LAS AMILASAS

En el grano de trigo, el endospermo (figura 2) contiene almidón que se
transforma en harina durante el proceso de molienda. También contiene
importantes enzimas (amilasas) capaces de hidrolizar el almidón en azúcares
solubles. Estos azúcares son luego transformados por la levadura durante la
cocción.
Dos tipos diferentes de amilasas se encuentran naturalmente en los granos:
-amilasas y -amilasas, cada una con una función diferente pero complementaria.
Las -amilasas hidrolizan el almidón en dextrinas, moléculas de tamaño mediano,
compuestas por unidades de glucosa interconectadas.
129
Cuando el almidón se hidroliza a dextrina, las -amilasas pueden llegar aún
más lejos al convertir la dextrina en maltosa. La harina de buena calidad debe
contener una combinación de amilasas y.
1 - PLEGAR
2 - ENDOSPERMA
3 - FARELO
4 - ALEMANIA
5 - ENDOSPERMA
6 - ALEURONA
7 - HIALINA
8 - FRENTE
9 - CÉLULAS TUBULARES
10 - CÉLULAS CRUZADAS
11 - HIPODERME
12 - EPIDERMIS
13 - ALEMANIA
Figura 2 - Secciones longitudinales y transversales de un grano de trigo (fuente: EMBRAPA - CTAA

- [Manual EMBRAPA - págs. 16])
9.2 - FABRICACIÓN DE PAN

La masa para pan blanco, panecillos y productos similares se compone de
harina, agua, levadura, sal y posiblemente otros ingredientes como azúcar y grasa.
Una vez preparada la masa, la levadura comienza a consumir azúcares
fermentables, transformándolos en alcohol y dióxido de carbono.
Cuando comienza la fermentación, las proteínas del gluten compondrán una
red que se rellenará con los demás componentes (almidón, por ejemplo). Cuando
se lleva el pan al horno, las burbujas de CO2 liberadas por las levaduras hacen que
el pan crezca y se vaya dejando espacios vacíos que se irán llenando de aire,
dando una textura agradable, con una miga más ligera.
Si, en el momento en que empiezan a salir las burbujas, las proteínas del
gluten no han alcanzado su punto de coagulación y no están listas para la fase de
endurecimiento, decimos que la masa “sopló” porque las glutelinas y gliadinas no
tienen la capacidad de sostén la masa y se marchita. La propiedad de soporte se
debe a los enlaces disulfuro formados por la presencia de aminoácidos de azufre en
las cadenas de proteínas.
El inicio de la fermentación es fácil con o sin azúcar porque la harina
contiene una cierta cantidad de azúcares fermentables. Pero cuando se agotan, el
proceso de fermentación cesa a menos que se agregue una nueva cantidad de
azúcar a la masa. Si la harina tiene un contenido razonable de enzimas
(principalmente amilasas), comenzarán a hidrolizar el almidón en maltosa tan pronto
como la masa esté lista.
130
Si hay suficientes enzimas, siempre habrá suficiente producción de azúcar
para que la fermentación pueda continuar. Por lo tanto, como resultado, no será
necesario agregar azúcar. Sin embargo, muchas harinas son deficientes en
amilasas. Este es principalmente un factor estacional. El contenido de
              
             

Pero si la humedad es alta, parte del trigo puede germinar. En este caso, el
contenido de amilasa del grano siempre será demasiado alto, lo que puede resultar
en un pan con una estructura de miga frágil y abierta. Por ejemplo, el trigo cultivado
en el clima templado de Europa tiende a tener un nivel razonable de
−          
        −  
9.3 - COMPLEMENTACIÓN DE HARINA

Las amilasas tienen efectos significativos sobre los productos de panadería.
Un contenido bajo significa una baja producción de dextrina y gas. Esto, a su vez,
da como resultado un pan de mala calidad con un tamaño pequeño y una corteza
mal coloreada.
Para compensar las deficiencias del grano, es necesario agregar azúcar o
           
              
          
           
               
             
           
     
levaduras
Glucosa dos etanol + 2 CO2
El extracto de malta se puede utilizar como suplemento enzimático porque es

rico en amilasas, pero sigue siendo preferible utilizar una amilasa fúngica. Las
preparaciones de malta comerciales pueden variar ampliamente en términos de
acción enzimática, mientras que las enzimas industriales tienen una acción
estandarizada. Además, a diferencia de la amilasa de malta, la amilasa fúngica no
se mantiene estable durante mucho tiempo a temperaturas superiores a 50oC
porque son enzimas mesófilas, con un pH en el rango entre 4.5 y 5.5.
Esto es importante porque a una temperatura aproximada de 70oC el
almidón comienza a gelatinizar y ofrece sustrato más fresco para la acción del
             
             
            
          
               
   
131
9.4 - OTRAS APLICACIONES ENZIMÁTICAS
9.4.1 - Color de la corteza del pan

La glucosa destaca las reacciones de Maillard, responsables del color
dorado de la corteza del pan; cuanta más glucosa, más oscura es la piel. Para
aumentar la formación de glucosa en la masa, se puede usar amiloglucosidasa.
O
oxidaciones / polimerización
C + H dosN - R consistencia y
Hcoloring de caramelo
AzúcarProteína
9.4.2 - Pastas frías y congeladas

Tan pronto como la masa esté lista, la levadura comienza a descomponer el
azúcar. Cuando una masa se enfría o congela, puede ser necesario agregar una
combinación de amilasa fúngica con amiloglucosidasa para asegurar que haya
azúcares fermentables en cantidades suficientes para que la levadura hornee el
pan.
9.4.3 - Retraso en el proceso de envejecimiento

El envejecimiento del pan blanco parece estar relacionado con un cambio en
el almidón. La humedad del almidón se libera cuando los gránulos del almidón
cambian de forma soluble a insoluble. Cuando el almidón ya no puede retener
agua, pierde su flexibilidad y el pan se endurece y se vuelve quebradizo.
Al elegir la amilasa correcta, el almidón se puede modificar durante el
proceso de horneado para retrasar el envejecimiento. Así, el pan permanece blando
durante más tiempo. Se utiliza una exoamilasa bacteriana maltogénica que es lo
suficientemente termoestable para actuar en el horno después de la gelatinización
del almidón y se inactiva antes de que el pan esté completamente horneado,
reteniendo así más componentes volátiles que le dan el sabor y aroma del pan
recién horneado. horno.
También es posible extender la vida útil de 8 a 10 días a 15 a 18 días,
observándose también una mejora en la calidad del pan.
9.4.4 - Mejora masiva

En la harina de trigo y centeno hay un pequeño porcentaje de pentosanos.
Los pentosanos previenen el desarrollo de gluten, que es de vital importancia en la
formación de la estructura del pan.
Al hidrolizar los pentosanos a través de una pentosanasa, la masa es más
fácil de manipular y el pan es más voluminoso con una mejor estructura de la miga.
A medida que el pan se hornea, ralentiza la formación de migas, lo que permite que
la masa suba.
132
9.4.5 - Galletas
Los requisitos para la harina en la producción de galletas son diferentes de
los requeridos para la fabricación de pan. Para galletas y crackers, es preferible
utilizar una “harina blanda” que produzca una masa con propiedades plásticas
acentuadas. Para ello, se utiliza una harina con un contenido proteico relativamente
bajo. La estructura del gluten no debe ser demasiado fuerte ni resistente, ya que
esto puede dificultar la manipulación de la masa.
Si no se dispone de una harina con estas propiedades, será necesario añadir
un agente que debilite el gluten. Se han utilizado para este propósito agentes
reductores (sustancias que rompen enlaces S - S, insertando átomos de hidrógeno
en estos sulfuros), especialmente bisulfito de sodio. El bisulfito tiene el efecto
deseado sobre el gluten, pero tiene un efecto adverso sobre otras sustancias en la
harina, incluido el contenido de vitamina B1 (tiamina). Esta vitamina se destruye
total o parcialmente. El bisulfito de sodio se ha prohibido en ciertos países y se está
volviendo menos popular debido a los riesgos para la salud humana.
Una alternativa es la aplicación de una enzima desintegradora de proteínas
que ablanda el gluten sin afectar al resto de ingredientes de la masa. Para ello, se
pueden utilizar diversas proteasas fúngicas y bacterianas, y se pueden utilizar en la
fabricación de pan con “harina dura”, es decir, con un alto contenido en proteína de
gluten. En síntesis, las proteasas se utilizan para ajustar la dureza de la harina.
Otras enzimas en la elaboración de

pan
La lipoxigenasa se utiliza en EE. UU. Y Canadá como blanqueador de harina,
promoviendo la oxidación de carotenoides y ácidos grasos insaturados. Su principal
fuente es la harina de soja desgrasada, que se utiliza en torno al 0,5% en relación al peso
total de la harina. Además, esta enzima influye en las propiedades de mezcla de la masa y
en la estructura interna del pan.
También se puede utilizar glucosa oxidasa, que reacciona con glucosa y oxígeno,
liberando ácido glicónico y peróxido de hidrógeno, y esto fortalece la masa, formando
puentes de sulfuro, que hacen que el pan sea menos pegajoso y mejor para su
manipulación. Esta enzima puede actuar en conjunto con la sulfhidril oxidasa, siendo
sustitutos del bromato, que ya ha sido prohibido en varios países por su potencial
carcinogénico.
9.5 - REFERENCIAS
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biotecnología en la producción de alimentos, vol. 4; Editora Edgard Blücher Ltda., São Paulo, 2001.
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http://www.nutrinews.com.br/edicoes/9905/mat01.html
134
CAPÍTULO 10 - CERVECERÍA
La cebada se cultiva en climas templados. En Brasil, se produce en algunas
partes de Rio Grande do Sul y Paraná. Después de la cosecha, las semillas de
cebada se envían a la planta maltera, donde la cebada se transforma en malta.
La cerveza se produce tradicionalmente mezclando malta de cebada molida
y agua caliente en un recipiente circular grande. Este proceso se llama maceración.
Además de la malta, se añaden a esta mezcla otros cereales con almidón, como el
maíz, el sorgo, el arroz y la cebada, o el propio almidón puro. Se les conoce como
agregados o adjuntos.
Después de la maceración, la mezcla se filtra. A continuación, el líquido
conocido como mosto dulce se vierte en la tina de maceración, donde se hierve con
lúpulo. El mosto con lúpulo se enfría y se traslada a los tanques de fermentación,
donde se agrega la levadura.
Después de la fermentación, la llamada "cerveza verde" se madura antes de
la filtración final y el embotellado. Esta es una descripción simplificada de cómo se
produce la cerveza, como se puede ver en las figuras 1 y 2.
RECIBO DE
MALTAR MOLIENDA
MALTA
COCCIÓN DE FILTRACIÓN MOSTO

MALTA MACERADA FERVURA
SEPARACIÓN DEL ENFRIAMIENTO FERMENTACIÓN /

TRUB FRÍO MADURACIÓN
FILTRACION ALMACENAMIENTO /
DE CERVEZA ENVÍO DE CERVEZA ENVOLVIMIENTO
FILTRADA
Figura 1 - Esquema general de producción de cerveza
135
Figura 2 - Elaboración del proceso clásico de elaboración de cerveza.
10.1 - CEBADA Y MALTA

En los cereales, los nutrientes potenciales de la levadura no se presentan en
la forma en que el microorganismo puede utilizarlos. Por lo tanto, es necesario
hidrolizar las grandes moléculas de almidón del grano.
La malta utilizada en la cervecería proviene del grano de cebada que ha sido
sometido a un proceso de germinación controlado, lo que la hace más suave y
soluble. La semilla de cebada consta de tres partes fundamentales, tegumento
(recubrimiento de la semilla, es la cáscara que la protege de los daños mecánicos
durante el malteado y transporte, además de incorporar sabor, color y aroma al
mosto), endospermo (la zona de almacenamiento de almidón y otros carbohidratos,
entre los que predomina la sacarosa), y el embrión latente (figura 3)
El contenido de azúcar de una semilla de cebada seca es bastante bajo, pero
el endospermo mantiene una enorme reserva de almidón. Los gránulos de almidón
son generalmente pequeños y la fracción de almidón consiste, en promedio, en:
• 24% de amilosa (cadena lineal, formada por unidad -D-glucosa unida por
enlaces glicosídicos  (1-4), soluble en agua)
• 76% de amilopectina (cadena ramificada de 20 a 40 unidades de glucosa unidas
por enlaces glicosídicos (1-4) entre usted y la cadena principal (larga) por
conexiones
 (−)      ) ( )
También es posible obtener variedades de aproximadamente un 47% de
amilosa mediante mejora genética.
136
(-Glucana)
Corteza
Endospermo
Cotiledón (almidón)
Epicotiledone
Radícula
figura 3 - Estructura del grano de cebada
Figura 4 - Amilopectina y amilosa, respectivamente
El estudio de semillas mostró que la cubierta de la semilla / fruto es

resistente al agua y, por lo tanto, reduce su tasa de absorción. Esta absorción de
agua es fundamental para la germinación de las semillas, aumentando la
producción de azúcar.
Así, en la producción de cerveza se germina la cebada (proceso de
malteado), luego de que los granos de cebada son limpiados para remover los
escombros, estos se maceran durante 40 a 120 horas para brindar la humedad
necesaria para la germinación (45% de humedad) y hacer granos suaves bajo
condiciones controladas de aireación y humedad. Entonces comienza el proceso de
germinación y el punto óptimo de este se alcanza cuando la radícula de la semilla
tiene dos tercios del tamaño del grano, donde la producción enzimática es grande
(formación / activación de enzimas) asegurando así que la malta tendrá una alta
acción enzimática y un alto contenido de almidón más soluble.
Luego se seca en hornos a temperaturas controladas para interrumpir la
germinación sin, sin embargo, destruir las enzimas ( - y -amilasas), obteniendo,
según el proceso de secado utilizado, diferentes tipos de maltas, las claras y las
oscuras, permitiendo la producción de diferentes tipos de cerveza. Para el secado
se utiliza aire caliente (la temperatura se eleva gradualmente para evitar la
vitrificación del grano y la inactivación de las enzimas).
Así, el malteado promueve transformaciones en el grano; modificación del
almidón; producción de enzimas; y agrega color a la malta.
137
A continuación, la malta se muele para que todos los elementos que la
componen sean accesibles a la acción de la acción enzimática. Poco después, se
calienta y se filtra para ser utilizado como mosto en la preparación de la bebida. La
Tabla 1 muestra la composición promedio del grano de cebada y la malta.
Cuadro 1 - Composición media del grano de cebada y cebada malteada

Componentes Cebada Malta
Masa de grano (mg) 32 - 36 29 - 33
Humedad (%) 10 - 14 4-6
Almidón (%) 55 - 60 50 - 55
Azúcares (%) 0,5 - 1,0 8 - 10
Nitrógeno total (%) 1.8 - 2.3 1.8 - 2.3
Nitrógeno soluble (% 10 - 12 35 - 50
Ntot)
Potencia diastática, °% L 50 - 60 100 - 250
− (  Huellas 30 - 60
)
Actividad proteolítica Huellas 15 - 30
DY (Equivalente de dextrosa) Gratu Dy hidrolizay = (Azúcars Reducirs totales / sólidos iniciales) x 100
Por lo tanto, la malta todavía se considera el único agente sacarificante

permitido en la fabricación de cerveza, aunque se han propuesto técnicas para
reemplazarla con el uso de enzimas puras. En su preparación es posible mantener
activo el sistema enzimático, compuesto principalmente por y
− (   − −  )    
            
             
    ( )
Granos de almidón Granos de almidón modificado
(envueltos por capa de Betaglucana) (capa perforada de betaglucano)
Grano
grande (más
suave)
Grano pequeño
(más duro)
Figura 5 - Granos de almidón con y sin -glucanos, respectivamente.

138
A medida que el almidón se gelifica, la -amilasa ataca las cadenas de
almidón por el extremo no reductor, dando lugar a polímeros de cadena más corta
llamados dextrinas, compuestos por al menos cinco a seis unidades de glucosa. El
ataque se realiza solo en conexiones -1,4. La -amilasa prepara el material para
un ataque más eficaz de la -amilasa. También ataca las cadenas de almidón por
los extremos no reductores, actuando sobre los enlaces
-1,4 y dejando -1,6 intacto, con la diferencia de producir solo maltosa, azúcar
compuesto por dímeros de glucosa.
Del ataque conjunto de las enzimas se obtiene la hidrólisis del almidón, con
producción de maltosa y ocasionalmente glucosa, si la cadena de polisacáridos
tiene un número impar de unidades. Como la malta tiene maltasa, la maltosa se
hidroliza posteriormente a glucosa (Figura 6).
Figura 6 - Hidrólisis de maltosa a glucosa

Entonces en el medio hay polímeros de tamaño variable, que no son
atacados por las enzimas de la malta y permanecen en solución, en la malta y la
cerveza, ya que no son fermentados por las levaduras. Son dextrinas que contienen
enlaces -1,6, los cuales son importantes en el procesamiento de la cerveza
porque aumentan su consistencia dándoles “cuerpo”, además de estar asociados
con el aroma y sabor del producto. Por ello, los almidones, en los que predomina la
amilosa, aportan una mayor cantidad de maltosa y en consecuencia glucosa, por
hidrólisis enzimática, con mayores rendimientos alcohólicos en fermentación.
Los almidones con un mayor contenido de amilopectina, como las raíces y
los tubérculos almidonados de los cereales "cerosos", proporcionan rendimientos
alcohólicos más bajos y una cerveza más completa. El uso adecuado del
complemento permite aprovechar estos factores, teniendo en cuenta el tipo de
cerveza a producir, ligera o densa.
10.2 - ENZIMAS DE MALTA Y ENZIMAS INDUSTRIALES

El malteado es un método relativamente caro para producir enzimas. Se
pueden lograr ahorros considerables reemplazando al menos parte de la malta con
enzimas industriales y cereales sin maltear, como la cebada. Además de las
ventajas desde el punto de vista económico, el proceso de producción de cerveza
se puede controlar con mayor precisión, debido a la calidad y acción uniforme de
las enzimas industriales. Por el contrario, la malta es un ingrediente que varía
mucho porque su calidad depende de las características de la cebada empleada y
de las técnicas de malteado.
139
Las aplicaciones de las enzimas industriales en la producción de cerveza son
las siguientes:
10.2.1 - Degradación del almidón

Investigaciones recientes han propuesto el uso de enzimas bacterianas,
como las pululanasas, capaces de actuar sobre los enlaces -1,6, desplegando las
cadenas ramificadas de las dextrinas en cadenas rectilíneas que las hacen
susceptibles a las enzimas de la malta.
Enzimas específicas para conexiones  (1-6):
ENDO (1-6) GLUCANASAS (pululanasas e
isoamilasas) EXO (1-6) GLUCANASAS
(exopululanasas)
Enzimas específicas para conexiones  (1-4) y  (1-6):
Glucoamilasas
10.2.2 - Sustitución de malta por cebada

La cebada sin maltear es un sustituto natural y económico de la malta de
cebada porque contiene los mismos componentes básicos. La principal diferencia
es que la cebada contiene un bajo contenido de enzimas, a excepción de la -
amilasa. Se puede sustituir una gran cantidad de malta por cebada sin maltear. Sin
embargo, es necesario añadir a la mezcla -amilasa, glucanasas y proteasas, para
obtener una hidrólisis satisfactoria de polisacáridos y proteínas.
Un ejemplo es lo que ocurre en Nigeria. La importación de malta ha sido
prohibida por el gobierno nigeriano desde 1988 y las cervecerías locales han
logrado hacer buena cerveza sin usar malta. Es posible elaborar cervezas con
hasta un 100% de cereales sin maltear, utilizando enzimas auxiliares. Esto es
exactamente lo que están haciendo los nigerianos para reemplazar la malta por
maíz o sorgo. En África, el maíz, el sorgo y la yuca se utilizan como coadyuvantes.
Cuando la cebada es de calidad inferior, la malta que produce puede ser
deficiente en una o más de estas enzimas. Ésta es una de las razones para utilizar
enzimas auxiliares. Otra razón es que permite la sustitución de parte o toda la malta
por cereales sin maltear. Por ejemplo, en lugar de 70% de malta y 30% de
adyuvantes, se puede obtener la misma cerveza con 35% de malta, 35% de cebada
no malteada y 30% de adyuvantes más enzimas auxiliares.
10.2.3 - Incremento de la proporción de adjuntos

Los adyuvantes se utilizan como fuente adicional de almidón en la
fabricación de bebidas fermentadas y generalmente consisten en grupos de
cereales que se obtienen fácilmente. La cebada sin maltear, la sémola de maíz, el
arroz, el sorgo y varios azúcares son los complementos más comunes.
Las proteínas juegan un papel vital en la fermentación, proporcionando
compuestos de nitrógeno necesarios para la supervivencia de la levadura. Dado
que la contribución de las proteínas a algunos tipos de agregados es muy pequeña,
puede
140
es necesario aportar proteínas extra en el mosto. Esto se puede hacer utilizando la
proteína presente en la malta de manera más eficiente: en la maceración
convencional, solo del 30 al 40% de la proteína de la malta se vuelve soluble.
Añadiendo enzimas proteolíticas, es posible solubilizar más proteínas para
levaduras.
10.2.4 - Licuefacción de Adjuntos

En su forma natural, los cereales que contienen almidón, como el maíz y la
sémola de arroz, son muy resistentes al ataque de las enzimas. Para eliminar esta
resistencia se hierve antes de añadirlo a la mezcla. Los cereales hervidos
(gelatinizados) son muy viscosos y difíciles de manipular. Es necesario diluirlos
(licuarlos) antes de bombearlos a la tina de maceración. Esta licuefacción se realiza
con una -amilasa. La -amilasa de malta en sí puede usarse para este propósito,
sin embargo, se usan cada vez más enzimas suplementarias, ya que son más
económicas y actúan a temperaturas más altas (100 ° C) que las enzimas de malta.
10.2.5 - Filtrado mejorado

La filtración lenta suele ser un problema cuando la maceración se drena al
tanque de clarificación (eliminación de turbidez en frío) y cuando la cerveza se filtra
(con el objetivo de eliminar la levadura aún presente y mantener la estabilidad física
y microbiológica). Esto puede deberse a la presencia de ciertos polisacáridos,
principalmente -glucanos y pentosanos, que se pueden encontrar en la cebada y
en la malta de cebada mal modificada.
Para la industria cervecera, los glucoglucanos de cebada se consideran un
factor negativo. Estos están presentes en las paredes celulares del endospermo
almidonado y contienen aproximadamente un 20% de arabinoxilanos y un 70% de
-glucanos. Durante el malteado, los -glucanos son degradados por las -
glucanasas, desde aproximadamente 3,0 - 4,5% hasta 0,2 - 1,0%. La eficiencia de
la degradación depende de varios factores, que no se comprenden completamente,
tales como:
• Distribución de la humedad a través del endospermo almidonado;
• Tasa de síntesis de enzimas hidrolíticas;
• Liberación de estas enzimas dentro del endospermo almidonado; y
• Estructura del endospermo que determina la resistencia a la degradación.
Si los -glucanos no se degradan completamente, impiden el paso de otras
enzimas desde la porción frontal a la porción distal de los granos, produciendo una
modificación irregular del endospermo. Esto da como resultado un bajo rendimiento
de mosto y una posible turbidez de la cerveza, así como un procesamiento menos
eficiente debido a la obstrucción del filtro.
Los -glucanos y pentosanos aumentan la viscosidad del mosto, dificultando
su filtración. Estos también pueden causar problemas en la filtración final de la
cerveza, por la formación de una capa de gel que bloquea los diminutos orificios de
los filtros.
141
Aunque normalmente los glucanos son normalmente solubles, se vuelven
insolubles en determinadas concentraciones de alcohol cuando forman un
precipitado. Esto puede suceder durante la fermentación y maduración de cervezas
fuertes.
Para evitar las pérdidas económicas ocasionadas por los -glucanos, es
necesario seleccionar cuidadosamente la materia prima, eligiendo cultivares y
lugares de cultivo que produzcan cebada con bajo contenido de de-glucanos y / o
alto contenido de -glucanasa o con microestructura de grano que no obstruye la
actividad de las enzimas.
Hay otras formas de solucionar el problema, como agregar enzimas durante
el procesamiento, cambiar las temperaturas y usar tiempos de malteado más
largos, pero puede haber problemas legales en algunos países, además de factores
económicos. Una solución sencilla es hidrolizar los -glucanos añadiendo una -
glucanasa a la maceración o al inicio de la fermentación.
Los -glucanos y su degradación son, por tanto, de extrema importancia
para la producción de malta y la obtención de cerveza de calidad.
10.2.6 - Reducción del tiempo de maduración

Durante las etapas de fermentación, el -acetolactato está formado por
levaduras. Esta sustancia se convierte lentamente en diacetilo, una sustancia muy
desagradable. Al final de la fermentación y durante la maduración, la levadura
convierte la mayor parte del diacetilo en acetoína, que tiene un sabor mucho más
neutro (Figuras 7 y 8).
La formación de diacetilo y sus posteriores conversiones dependen de varios
factores, como la calidad del agente microbiano y la temperatura de fermentación.
Recientemente, se desarrolló una enzima ( -acetolactato descarboxilasa) que
redujo significativamente la producción de diacetilo y, por lo tanto, permitió reducir el
tiempo de maduración de la cerveza. La enzima hidroliza el -acetolactato
directamente a acetoína y se agrega al mosto con lúpulos enfriados al comienzo de
la fermentación.
142
FERMENTACIÓ OH Hidroxietilo
N TPP
CH3 C TPP
OH H OH
CH3 C COOH CH3 C COOH

CHdos
CO CO
CH3 CH CÉLULA
3
 − Acetohidroxibutirato  − Acetolactato
Agentes oxidantes
BAST
ANTE
O O O O
+ 2 [H] + + 2 [H] + COdos
CH3 CHdos C C CH3 COdos CH3 C C CH3
2.3 - Pentanediona Diacetil
o
Máximo = 0,10 ppm
(sabor a mantequilla)
Figura 7 - Metabolismo microbiano con formación de diacetilo
- Inicio de
Vigilancia Maduración:
Diacetil;
Temperatura (oC) o - Incorporación de CO2;
Extracto (oP)
- Recuperació
15 - Clarificación de cerveza;
n Levadura.
13
Purga - Definición de "sabor".
11
de
Trub 9
frío 7
5 Purgar antes
de la
3 filtración
1
-1
01461012 13 15
Extraer Tiempo
(días)
temperatura
Figura 8 - Curva de fermentación con el inicio de la producción de diacetilo.
143
10.3 - PANORAMA
En la industria cervecera, las perspectivas de aumentar el uso de enzimas se
pueden lograr mediante:
• Introducción a la comercialización de glucanasas y proteasas termoestables para
su uso en las etapas de malteado y filtración.
• Disponibilidad de extractos enzimáticos con alta actividad específica para permitir
el uso de monodosis en las etapas del proceso donde deben utilizarse,
facilitando la adición automatizada del catalizador, situación deseable en
cervecerías con alto grado de automatización.
• Ejecución de la etapa final de elaboración de cerveza con papaína inmovilizada.
• Se está utilizando con éxito una combinación de amilasas y lipasas, en
pasteurización, para limpiar el springer (circulador de cerveza, equipo utilizado en
la pasteurización de cerveza). La pasteurización de la cerveza tiene como
objetivo inactivar los microorganismos que aún pueden estar en la cerveza
embotellada (botellas y latas) o no (barril), utilizando el binomio tiempo x
temperatura. Durante la pasteurización en el springer, considerado un problema
importante de la cervecería, varias botellas se rompen en el equipo provocando
contaminación biológica, el procedimiento normal es detener la máquina para
una limpieza alcalina semanalmente, lo que aún tiene el inconveniente de dañar
el sistema. Con las enzimas, una dosificación semanal, sin parar el springer,
permite operaciones ininterrumpidas de hasta tres meses en clientes como
Ambev y Molson (empresa matriz canadiense de Kaiser).
Cerveza baja en calorías

En condiciones normales en la producción de cerveza, las enzimas naturales de la
malta no pueden hidrolizar todo el almidón en azúcares fermentables. Aproximadamente
1/3 del almidón se convierte en dextrinas no fermentables, que pasan a la cerveza final.
Las dextrinas son carbohidratos, lo que significa calorías.
Para hidrolizar las dextrinas en glucosa, también se pueden agregar enzimas
durante la maceración o fermentación. La glucosa se transforma casi por completo en
etanol y CO2 por la levadura. Si esto se tiene en cuenta al preparar el mosto, es decir, si el
mosto se ajusta a un extracto más bajo, es posible producir una cerveza con un contenido
de alcohol normal, pero con 1/3 menos de calorías.
Esta cerveza baja en carbohidratos es de interés no solo para los diabéticos, que
necesitan limitar su consumo de carbohidratos, sino también para todos los consumidores
de cerveza que desean mantenerse en forma.
144
10.4 - REFERENCIAS
― AGU, RC; PALMER, GH; Una reevaluación del sorgo para la elaboración de cerveza lager.
Tecnología de fuentes biológicas, 66, 253-261, 1998.
― BRANDAM, C.; MEYER, XM; PROTH, J.; STREHAIANO, P.; PINGAUD, H.; Una cinética original
modelo para la hidrólisis enzimática del almidón durante la maceración. Revista de ingeniería
bioquímica, 13, 43-52, 2003.
1996.
― JONES, BL; MARINAC, L.; El efecto del macerado sobre las actividades endoproteolíticas de la
malta. Revista de química agrícola y alimentaria, 50, 858-864, 2002.
― LI, Y.; LU, J.; GU, G.; SHI, Z.; MAO, Z.; Estudios sobre arabinoxilanos extraíbles en agua durante el
malteado y la elaboración de cerveza. Química de los alimentos, 93, 33-38, 2005.
― LOPEZ, M.; EDENS, L.; Prevención eficaz de la neblina fría en la cerveza utilizando una
endoproteasa específica de praliné ácido de Aspergillus niger. Revista de química agrícola y
alimentaria, 53, 7944-7949, 2005.
― NOVOZYMES. Una nueva dieta para adelgazar promueve un nuevo tipo de cerveza. Biotimes, enero de 2005.
― NOVOZYMES. Novozymes sorprende a las cervecerías en Brasil Brau 2005. Biotimes, págs. 8-9,
marzo de 2005.
― NOVOZYMES. Ceremix® Plus reduce los costos sin comprometer la calidad. Biotimes, págs. 3-4,
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― NOVOZYMES. Las enzimas reemplazan la malta lenta pero firmemente. Biotimes, pág.2, mayo de 2006.
― THOMPSON, JW; SHOVERS, J.; SANDINA, NOSOTROS; ELLIKER, PR; Eliminación enzimática
de diacetilo de la cerveza, III. Protección enzimática y regeneración de cofactor. Microbiología
aplicada, 19 (6), 883-889, 1970.
― TOLLS, TN; SHOVERS, J.; SANDINA, NOSOTROS; ELLIKER, PR; Eliminación enzimática de
diacetilo de la cerveza, II. Estudios adicionales sobre el uso de diacetil reductasa. Microbiología
aplicada, 19 (4), 649-657, 1970.
http://www.cervesia.com.br/index.asp
145
CAPÍTULO 11 - INDUSTRIA DE ZUMOS
Todos los tipos de frutas de importancia industrial y nutricional contienen
cantidades variables de sustancias pécticas, que son polisacáridos complejos, con
la cadena principal formada por ácidos galacturónicos unidos por enlaces -1,4 (o
enlaces cuantidade-1,4 menores), y también con 2 a 4% de enlaces -1,2 ramnosa
(figura 1).
Cubreobjetos
mediano
celulosa
pared
primario
pectina
Membrana hemicelulosa
plasmático
Figura 1 - Estructura de la pared celular vegetal

En la fruta verde, la sustancia péctica se encuentra en su forma insoluble,
denominada protopectina, que es la responsable de su firmeza. Cuando la fruta
madura, se produce una hidrólisis parcial de la protopectina, lo que genera pectina,
que es un polímero del ácido metil galacturónico, que varía en los grados de
polimerización y sustitución del radical metilo, y es soluble, dejando la fruta más
tierna.
Debido a la solubilidad parcial en esta etapa, parte de la pectina pasa al jugo
durante el prensado, lo que aumenta la viscosidad y dificulta la optimización de los
rendimientos de la producción del jugo. El jugo extraído es pobre en cuanto a color
y componentes aromáticos. Además, es difícil de aclarar y filtrar.
Las enzimas, especialmente las pectinasas, se han utilizado para los
siguientes propósitos:
• Incrementar el rendimiento del jugo debido al mejor prensado de la fruta;
• En la licuefacción de la fruta para el máximo aprovechamiento de la materia prima;
• Incrementar el rendimiento de ácidos y sustancias que imparten color y aroma;
• En la clarificación de jugos, con el objetivo de aumentar la estabilidad;
• En la descomposición de carbohidratos poliméricos, como pectinas,
hemicelulosas y almidón.
146
11.1 - MACERACIÓN Y LICUACIÓN
En el pasado, los jugos turbios se producían mediante procesos mecánicos
que incluían tratamientos térmicos, lo que afectaba sus cualidades sensoriales. La
adición de enzimas “maceradoras”, como la poligalacturonasa, sirve para disolver el
tejido vegetal, formando una suspensión celular. Si la suspensión macerada y
viscosa se trata posteriormente con celulasas, la lisis de la pared celular aumenta
dando lugar a una degradación casi completa de los carbohidratos solubles e
insolubles, con una mejor extracción del color.
11.2 - DIGESTIÓN DE PULPA

Después de la extracción, una parte considerable del jugo aún permanece
dentro de las pulpas prensadas debido a la gelatinización. El tratamiento enzimático
de la pulpa facilita la liberación del jugo y da como resultado rendimientos y
capacidad de prensado considerablemente mejores.
La despectinización completa a través de un adecuado complejo de
pectinasas asegura una adecuada clarificación y filtrado de los jugos, así como una
buena estabilidad de los jugos concentrados producidos.
Los frutos macerados forman sistemas complejos desde el punto de vista
físico que se pueden dividir en 3 fases: jugo, capa intermedia y materiales sólidos.
Los objetivos de la despectinización en estas 3 fases son diferentes, a saber:
• Jugo → reducción de la viscosidad, que inicialmente aumenta debido a la
solución de protopectina, hasta que el final del tratamiento enzimático alcanza el
valor inicial o inferior.
• Capa intermedia → destrucción de la estructura gelatinosa por degradación
de la pectina no disuelta, liberando así más jugo y aumentando adicionalmente la
porosidad de los materiales sólidos
• Sólidos → liberan por maceración de la estructura celular, las sustancias que
influyen en la calidad sin alterar la consistencia del fruto macerado.
En algunos casos es necesario calentar mediante intercambiadores de calor
en espiral o en tubos, ya que las sustancias sólidas de la fruta macerada se
presentan en una estructura física suficientemente firme. Las uvas, por ejemplo, se
procesan enzimáticamente a 50oC. Las manzanas y las peras tienen una estructura
física que forma mermelada a altas temperaturas. Por este motivo, el tratamiento
enzimático se realiza en estos casos a temperaturas entre 15 y 30oC.
Cada reacción enzimática depende del tiempo. La duración de esta reacción,
a su vez, es función de la concentración de enzima, la temperatura y la
concentración de sustrato. Los tiempos medios de tratamiento enzimático de la fruta
macerada varían de 20 minutos a 4 horas, siendo el más habitual el tratamiento de
2 horas (excepto manzanas y peras).
147
Además de la pectina, en este proceso se pueden disolver otros polímeros,
como el arabane (un polímero de pentosa arabinosa), que es una parte importante
de las paredes celulares vegetales y puede causar turbidez en los concentrados de
frutas. Con las tecnologías modernas para la obtención de zumos de frutas que
tienden a rendimientos cada vez más altos, se extraen cantidades apreciables de
araban de las paredes celulares y el riesgo de turbidez por este polisacárido se ha
incrementado en los últimos años.
Desafortunadamente, la turbidez aparece solo algún tiempo después de que
el jugo se ha concentrado y es difícil de predecir, ya que no existen pruebas
analíticas convenientes que puedan realizarse antes de concentrar los jugos. Los
complejos de pectinasas industriales para la despectinización de jugos contienen
suficiente actividad arabinasa, que puede usarse contra la formación de turbidez en
el concentrado.
La eliminación de pectinas también se puede realizar mediante
desesterificación seguida de floculación del ácido péctico resultante con iones Ca2
+, utilizando preparaciones de pectinesterasa, libres de enzimas despolimerizantes.
11.3 - CLARIFICACIÓN DE JUGO

Los tratamientos de jugo entre la prensa y el filtro tienen los siguientes objetivos:
• Desestabilización de la materia en suspensión para permitir o facilitar su
separación;
• Estabilización del jugo mediante la eliminación suficientemente amplia de todas
las sustancias que podrían causar más turbidez;
• En algunos casos, mejora las propiedades sensoriales.
La necesidad de descomposición de la pectina se explica por dos factores:
1º La protopectina previene la reacción entre la proteína y los polifenoles solubles
en el jugo, evitando, al mismo tiempo, la floculación de las partículas en
suspensión.
2do- La pectina soluble es la principal responsable de la viscosidad del jugo,
disminuyendo la velocidad de precipitación de las partículas en suspensión.
Una clarificación adicional con gelatina, sílice o bentonita puede ocurrir con
éxito cuando la pectina se ha eliminado por completo del jugo.
Los participantes en la reacción de aclaración son:
• Materiales suspendidos, cuya capacidad para reaccionar con polifenoles
disueltos es posible o aumentada por la descomposición de protopectina;
• Polifenoles disueltos, cuya concentración es normalmente superior a la que
puede eliminarse totalmente del jugo solo por reacción con los materiales en
suspensión;
• Gelatina, que por reacción con los taninos, tiene la capacidad de eliminar los
polifenoles disueltos del jugo, los cuales podrían causar turbidez.
148
En el proceso de clarificación, solo los materiales en suspensión, libres de
pectina, reaccionan con los polifenoles disueltos, provocando la floculación de las
partículas. El contenido residual de polifenoles se precipita mediante la adición de
gelatina. En la práctica industrial, es difícil determinar exactamente cuánta gelatina
se necesita. Ésta es una de las razones por las que se utiliza más gelatina de la
necesaria para eliminar los polifenoles, precipitando su exceso con ayuda de
bentonita y / o tierra de diatomeas.
En la práctica, la aclaración se puede realizar básicamente de dos formas:
• Caliente, temperatura entre 45 - 55oC, durante 1 hora;
• Frío, temperatura entre 15 - 25oC, durante 8 horas y pH 2,0 - 2,4.
La Tabla 1 presenta un resumen del uso de enzimas en la producción de
jugo.
Tabla 2 - Resumen de enzimas utilizadas en la producción de zumos de frutas
Etapas Enzimas empleadas

Maceración (obtención de pulpas Poligalacturonasas
estables)
Licuefacción (concentrados de pulpa) Celulasas, hemicelulasas, pectinasas y
amilasas
Digestión de la pulpa Celulasas, hemicelulasas, pectinasas
Aclaración Pectinasas y amilasas
11.4 - ZUMOS DE CÍTRICOS

Los complejos pectinolíticos también se utilizan en la industria del jugo de
cítricos. En el proceso de lavado de pulpa, se utilizan enzimas para reducir la
viscosidad y aumentar el rendimiento de extracción. La reducción de la viscosidad
es importante para prevenir la gelatinización de la pectina durante la concentración.
Las enzimas pectinolíticas también se utilizan para la clarificación de jugos de
cítricos (particularmente jugo de limón), en la extracción de aceites esenciales y en
la producción de extractos muy turbios a partir de cáscaras de cítricos. Estos
concentrados turbios se utilizan en la fabricación de refrescos.
El mercado de enzimas en el sector de fabricación de jugos de frutas
involucra cifras del orden de US $ 16 millones / año, siendo el potencial de enzimas
en este sector:
• En el desarrollo de pectinasas activas a pH bajo (alrededor de 2.5) para su uso
en la producción de jugo de limón;
• En la oferta de preparados pectinolíticos con baja actividad esterasica, para no
perjudicar la turbidez final de los jugos;
• Ofreciendo naringinasa para reducir el sabor amargo del jugo de limón causado
por la naringina.
149
Frutas tropicales
La producción de jugos enzimáticos de frutas tropicales se suele realizar con: piña,
mango, maracuyá, anacardo, guayaba, acerola, papaya, cajá y plátano.
Piña (Ananas comosus)
La piña es la fruta tropical más importante en términos de volumen procesado. El
jugo suele ser un subproducto de la producción de piña enlatada y se elabora a partir de
las partes no utilizadas de la piña. En una prueba con Pectinex® Ultra SP en un puré de
piña, la producción de jugo aumentó de 65% a 77% después del tratamiento. La
producción de trituración también ha aumentado.
Otra aplicación es aumentar el caudal en la ultrafiltración de jugo opaco, con el fin
de producir jugo claro para piña en conserva. La piña tiene un alto contenido de
galactomanano, un polisacárido neutro que forma soluciones viscosas. Para aclarar el jugo
de piña, es necesario descomponer esta sustancia con una preparación enzimática.
Pectinex Ultra SP-L, de Novozymes, se ha utilizado, con excelentes resultados, en la
producción de jugos claros, mediante el proceso de ultrafiltración.
Plátanos (Musa sp.)
Novozymes ha desarrollado con mucho éxito un proceso que utiliza enzimas para
reducir la viscosidad del puré de plátano. Las enzimas para maceración permiten obtener
la reducción del volumen, por lo que se puede utilizar un simple decantador para la
separación entre el líquido y el sólido. Se puede producir un jugo de plátano claro o un
jugo concentrado clarificado de 70 ° Brix comenzando con un puré o con plátanos pelados
o enteros. En el caso de los plátanos enteros, se debe aplicar un finalizador después del
tratamiento enzimático para eliminar las cáscaras.
Fruta de la pasión (Passiflora edulis)
Normalmente, la producción de jugo es algo pequeña debido al alto contenido de
pectina de la pulpa de la fruta que rodea las semillas. El uso de enzimas pectolíticas
aumenta la producción de jugo al 40% o más. Además, se vuelve mucho más fácil separar
las semillas de la pulpa, hay una mayor estabilidad de opacidad y un enriquecimiento del
sabor natural. Se puede obtener jugo claro de maracuyá agregando preparaciones de
pectinasa y amilasa al jugo opaco. Alternativamente, se puede producir un jugo claro
directamente a través del tratamiento con enzimas pectolíticas y hemicelulolíticas.
Cajá (Spondias lutea)
Para promover la despectinización total del jugo de pulpa de cajá se utilizaron
concentraciones enzimáticas del orden de 500 ppm y tiempo de acción enzimática de 120
minutos a 45 ° C, a pH natural del jugo, precedido por tratamiento en la pulpa con enzima
pectinolítica Pectinex Ultra. SP-L. Este demostró ser eficaz con respecto a la degradación
completa de la pectina, ofreciendo condiciones favorables para el proceso de clarificación.
150
11.5 - REFERENCIAS
― BARROS, STD; MENDES, ES; PERES, L.; Influencia de la despectinización en la ultrafiltración de
jugos de cereza antillana (Malpighia glabra L.) y piña (Ananas comosus (L.) Meer). Ciencia y
tecnología de los alimentos, 24 (2), 194-201, 2004.
1996.
― JAYANI, RS; SAXENA, S.; GUPTA, R.; Enzimas pectinolíticas microbianas: una revisión. Process
Biochemistry, 40, 2931-2944, 2005.
― KASHYAP, DR; VOHRA, PK; CHOPRA, S.; TEWARI, R.; Aplicaciones de las pectinasas en el
sector comercial: una revisión. Tecnología de fuentes biológicas, 77, 215-227, 2001.
― LEE, WC; YUSOF, S.; HAMID, NSA; BAHARIN, BS; Optimización de las condiciones para la
clarificación enzimática del jugo de banano mediante la metodología de superficie de respuesta (RSM).
Revista de Ingeniería de Alimentos, 73, 55-63, 2006.
― MIHALEV, K.; SCHIEBER, A.; MOLLOV, P.; CARLE, R.; Efecto de la maceración en puré sobre el
contenido polifenólico y los atributos de calidad visual del jugo de manzana turbio. Revista de química
agrícola y alimentaria, 52, 7306-7310, 2004.
― NOVOZYMES. Más jugos de los trópicos. Biotimes, marzo de 2002.
― NOVOZYMES. XXL: la nueva generación de pectinasas. Biotimes, 4-5 de marzo de 2003.
― PURI, M.; BANERJEE, UC; Producción, purificación y caracterización de la enzima desamparante
naringinasa. Avances en biotecnología, 18, 207-217, 2000.
― ROLDÁN, A.; PALACIOS, V.; PEÑATE, X.; BENÍTEZ, T.; PÉREZ, L.; Utilización de extractos
enzimáticos de Trichoderma en la vinificación de uvas Palomino fino en la región de Jerez. Revista de
Ingeniería de Alimentos, 75, 375-382, 2006.
― SILVA, APV; MAIA, GA; OLIVEIRA, GSF; FIGUEIREDO, RW; BRASIL, IM; Estudio de
producción de jugo de cajá clarificado (Spondias lutea L.). Ciencia y tecnología de los alimentos, 19
(1), 33-36, 1999.
― YU, J.; LENCKI, RW; Efecto de los tratamientos enzimáticos sobre el comportamiento de
ensuciamiento del jugo de manzana durante la microfiltración. Revista de Ingeniería de Alimentos, 63,
413-423, 2004.
http://www.ippa.info/what_is_pectin.htm
151
CAPÍTULO 12 - INDUSTRIA DEL VINO
El vino es considerado uno de los productos más nobles entre los que
elabora el hombre. Según la legislación vigente, el vino se considera un producto
natural y, como tal, es el resultado de una serie de reacciones enzimáticas, que se
producen durante la maduración de la uva, la fermentación alcohólica y maloláctica,
la clarificación y, finalmente, en el almacenamiento. .
Las aplicaciones enzimáticas son muy similares en las industrias del vino y
de los zumos de frutas. Sin embargo, existen diferencias en la composición de las
uvas y en la composición de manzanas y peras, por ejemplo.
En la elaboración del vino, el objetivo es extraer tantos componentes de
sabor como sea posible. En el caso del vino tinto, la extracción de color también es
muy importante. Estos componentes deben conservarse durante el almacenamiento
que, en algunos casos, puede llevar muchos años. Sin embargo, la calidad de los
vinos podría mejorar durante la conservación debido a la maduración, que es un
proceso muy complicado.
Los complejos enzimáticos ideales para la vinificación son diferentes de los
que se utilizan para procesar zumos de frutas. En la vinificación se requieren
muchas actividades enzimáticas específicas para obtener el efecto deseado y, al
mismo tiempo, asegurar la mejor calidad.
En el procesamiento de jugos de frutas, las enzimas se desnaturalizan
mediante pasteurización, poco después de haber cumplido su función en el
proceso. En la vinificación, este tratamiento térmico no ocurre. Por esta razón, las
enzimas mantienen su actividad durante mucho tiempo. Los aspectos de las
actividades que benefician el procesamiento de zumos de frutas pueden ser menos
deseables para la vinificación porque pueden influir negativamente en la calidad del
vino durante la conservación. Los complejos enzimáticos específicos para la
vinificación han sido desarrollados con el fin de mejorar la calidad y al mismo tiempo
garantizar las deseables ventajas tecnológicas.
El uso de enzimas se puede dividir en una fase previa y posterior a la
fermentación. Las etapas de pre-fermentación emplean enzimas en el tratamiento
de la uva (extracción) y del mosto obtenido (clarificación) mientras que después de
la fermentación se realizan tratamientos enzimáticos para mejorar la liberación de
aromas y la filtración del vino.
El uso de enzimas comerciales es todavía un hecho relativamente nuevo en
la elaboración del vino. Es cierto que el vino se puede producir sin enzimas
comerciales, pero es imposible hacer vino sin enzimas. Las enzimas juegan un
papel clave en la elaboración del vino. Sin enzimas, el jugo de uva nunca se
convertiría en vino. Sin embargo, la actividad enzimática de las uvas a menudo es
insuficiente para tener el efecto deseado. Y es en este nicho donde las
preparaciones enzimáticas comerciales pueden ayudar, reforzando las actividades
que se encuentran naturalmente en las uvas.
152
El estudio de las actividades pectinesterasa y poligalacturónica en uvas
durante la maduración indica que son muy bajas en uvas verdes, aumentando
mucho al inicio de la maduración. Las condiciones climáticas durante la maduración
de la uva influyen en la producción de estas enzimas y esto, a su vez, influye en la
hidrólisis de la pectina de la uva. Si hay una hidrólisis incompleta de las pectinas por
las propias enzimas de la uva, puede haber problemas en las etapas de prensado y
clarificación.
La elaboración de vinos de calidad requiere una buena clarificación, antes de
que comience la fermentación alcohólica, que puede verse obstaculizada por la
presencia de pectinas. Por esta razón, las pectinasas son las enzimas comerciales
más importantes para la vinificación.
Cuando se agregan a las uvas durante el estrujado, estas enzimas pueden
reducir el tiempo de prensado y proporcionar un rendimiento de jugo satisfactorio.
También aumentan la extracción de color para los vinos tintos y la extracción de
aromas para los vinos blancos.
Debido a las diferentes características inherentes a los vinos tintos y blancos,
estos se abordarán por separado. Los vinos rosados están cubiertos por la columna
de producción de vino blanco, ya que el proceso es similar, con la excepción de un
contacto más prolongado con los hollejos para extraer el color.
12.1 - VINIFICACIÓN ROJA
12.1.1 - Fermentación clásica

Las ventajas de tratar la uva triturada durante su fermentación son:
• Fermentación más rápida y menos violenta;
• Menor producción de espuma;
• Ahorro de tiempo gracias a una extracción de color mejor y más rápida;
• Mayor rendimiento de vino que fluye libremente;
• Prensado y filtrado facilitados;
• Mayor rendimiento global;
• Clarificación más rápida y mejor de los vinos jóvenes;
• Vinos aromáticos, con bajo contenido en taninos; y
• Elaboración y maduración más rápida.
La presencia de enzimas exógenas favorece una fermentación más rápida y
completa, además de la eliminación, en gran parte, de fermentaciones incorrectas
para permitir una reducción considerable de ácidos volátiles junto con un ligero
aumento de contenido alcohólico.
153
Este tratamiento también permite obtener una mejora considerable de la
extracción de color en todos los casos en los que es necesario trabajar con tiempos
de fermentación cortos. La extracción del color con ayuda de pectinasas se realiza
con cierta lentitud. El mucílago que se encuentra debajo de la piel (principalmente
pectina) debe descomponerse primero durante 6 a 8 horas. Los tintes solo serán
accesibles a partir de este momento.
La implementación práctica de este proceso pasa por agregar la enzima al
tanque lleno de uvas trituradas, mezclar bien el contenido y repetir la operación a
intervalos de 12 horas. El tiempo de contacto con las conchas varía de 3 a 10 días
a una temperatura de 15 a 35 oC.
12.1.2 - Termovinificación
Es una variante de la fermentación clásica y ofrece la posibilidad de mejorar
la calidad al utilizar uvas que ya han iniciado el proceso de putrefacción. Según el
estado de la cosecha, la termovinificación se practica con calentamiento rápido a
altas temperaturas. Mediante este tratamiento térmico se reproduce la plasmólisis
de las células, se desnaturalizan las membranas celulares, aumentando su
permeabilidad y, con ello, la velocidad de extracción de sustancias celulares como
azúcares y ácidos, incluidos colorantes y sustancias aromáticas.
Las ventajas de utilizar enzimas pectinolíticas en termovinificación se basan
en:
• Extracción más rápida de tintes y aromas;
• Reducción del tiempo de reacción a 50oC y, con ello, aumento de la capacidad
de separación del mosto;
• Mayor rendimiento global;
• Mayor facilidad de prensado;
• Clarificación y filtración más eficientes;
• Menos espuma durante la fermentación.
La extracción se realiza cuanto más rápidamente cuanto mayor es la
cantidad de mucílago que se descompone y menor es la viscosidad del extractor, es
decir, del mosto. La disolución del mucílago, que consiste principalmente en
protopectina, conduce a hasta un 20% más de mosto, que puede fluir más
fácilmente del fruto triturado. Por su viscosidad, la pectina disuelta retrasa la
clarificación y es la causa por la que se produce una espuma que impide el pleno
desarrollo del poder fermentativo.
La reacción enzimática en este caso toma de ½ a 4 horas y se detendrá tan
pronto como se alcance la intensidad de color deseada. Suele realizarse a
temperaturas de 50 a 55 oC.
154
12.1.3 - Tratamiento enzimático de vinos tintos
Al final de la fermentación alcohólica, los vinos generalmente tienen una
actividad pectinolítica reducida debido a la adición de SO2, la producción de alcohol
y los polifenoles extraídos del mosto conducen a una inactivación enzimática
relativamente rápida. Por este motivo, especialmente en vinos que proceden de
uvas o mostos que no han sido tratados con enzimas, se encuentran cantidades
considerables de pectina. La filtración y la autoclaración, en tales casos, son
complicadas y requieren un tiempo considerable.
Durante la clarificación de los vinos tintos, la enzima debe aplicarse al inicio
del proceso. Esto es necesario para que sea posible utilizar la reacción enzimática
durante la elevación de la temperatura producida por la fermentación, pero también
porque la pectina fresca se descompone más fácilmente. Además, al comienzo de
la fermentación hay cantidades reducidas de ciertas sustancias retardantes como el
alcohol y el SO2, y la adición anticipada sugiere una ganancia en el tiempo de
sedimentación.
12.2 - VINIFICACIÓN EN BLANCO
12.2.1 - Maceración de uvas

Las principales ventajas del tratamiento enzimático en la etapa de maceración
ellos son:
• Prensado más fácil y rápido después de la cosecha;
• Aumento de los ingresos generales;
• Los jugos obtenidos tienen un mayor contenido de azúcares fermentables,
sustancias aromáticas, ácidos, oligoelementos y, posiblemente, colorantes;
• Mejora global de la calidad del vino.
El contenido de azúcar de la uva tiene su valor máximo justo debajo de la
piel. Especialmente en variedades ricas en pectina, a menudo ocurre que este
azúcar no se extrae completamente durante el prensado y se retiene en las
cáscaras. Mediante la acción de las enzimas, este azúcar pasa íntegramente al
mosto, lo que supone un mayor rendimiento de alcohol. Lo mismo ocurre con los
componentes aromáticos y otras sustancias.
En la práctica, el tiempo mínimo de reacción debe ser de 2 a 4 horas, siendo
necesario considerar la temperatura de la fruta triturada. A temperaturas por debajo
de los 15 oC, se debe extender el tiempo de reacción o aumentar la cantidad de
enzimas. Las temperaturas habituales varían entre 10 y 25oC y los tiempos de
contacto entre 4 y 12 horas.
155
12.2.2 - Clarificación de jugo exprimido
Las ventajas de tratar el jugo antes de la fermentación son:
• Reducción del tiempo de eliminación de mucílagos;
• Mejor oxidación;
• Menor volumen de lodos;
• Fermentación mejorada sin fugas;
• Inicio más rápido de la descomposición biológica de ácidos;
• Clarificación más corta y filtración más fácil;
• Exaltación y refinamiento del aroma, fragancia y sabor típicos.
La reducción del tiempo de eliminación de mucílagos garantiza una óptima
sedimentación de los lodos antes de que comience el proceso de fermentación.
Dado que las polifenoles oxidasas siempre se combinan con los componentes del
lodo, la mejora en la clarificación reduce el riesgo de oxidación.
La espuma obtenida es fina y se descompone más rápidamente, por lo que
el fermentador se puede alimentar a un nivel más alto que en el caso donde no se
utilizan las enzimas, y se pueden observar incrementos en el volumen de
fermentación del orden de 30 a 40%.
La eliminación de mucílagos por acción enzimática conlleva mejoras tanto en
la clarificación del mosto como en el vino elaborado, indicando también una suave
filtración. Se cree que esta acción enzimática también es responsable de mejorar la
calidad del vino, especialmente el aroma y el sabor. En la práctica, la cantidad de
enzima a aplicar es función del contenido de pectina y del tiempo deseado para la
eliminación del mucílago. Suelen utilizarse condiciones de 10 a 25oC y tiempos de
12 horas a 10 días.
12.2.3 - Mecanismos de aclaración

Este complicado proceso se puede dividir en 3 fases bien definidas, a saber:
desestabilización, floculación y sedimentación.
En la fase de desestabilización, a menudo llamada fase enzimática, es
necesario descomponer ciertas sustancias mucilaginosas que mantienen el lodo en
suspensión. La pectina es uno de estos estabilizadores naturales más importantes.
Ciertas gomas vegetales, como arabanas, xilanos y otros pentosanos, así como
dextrano y polímeros similares de origen microbiano tienen el mismo efecto. La
mayoría de estas sustancias pueden descomponerse enzimáticamente, lo que
permite desestabilizar el sustrato, requiriendo solo una hidrólisis parcial de estas
para que se produzca una reducción de la viscosidad, que se obtiene mediante la
disociación del 2 al 3% de los enlaces -1, 4 - glucósidos de pectina. Como es
natural, la filtración de un mosto de este tipo no sería posible ya que los fragmentos
de pectina son demasiado grandes. Aún,
156
La fase de floculación se caracteriza por una rápida agrupación de moléculas
de tanino cargadas negativamente y pequeñas partículas de lodo disueltas
coloidalmente, con proteínas cargadas positivamente (proteínas del mosto), y con
los agentes clarificantes que se suelen aplicar (gelatina, pez cola, etc.) en diferentes
regiones.
En la tercera fase de clarificación, sedimentación o precipitación, el lodo se
deposita en el fondo. En este proceso, el tamaño de partícula y la diferencia de
peso específico de ambas fases son importantes, ya que esta última está sujeta en
gran medida al teorema de Stokes. La velocidad de sedimentación también
depende de la altura de la columna de líquido, ya que es proporcional a la distancia
que deben recorrer las partículas.
12.2.4 - Fortalecimiento de los ramos

El desarrollo del potencial aromático de una variedad de uvas (Rieslig,
Chenin Blanc, Moscatel, etc.) se realiza mediante el uso de un compuesto
enzimático pectinolítico que contiene actividades secundarias glucosídicas para
fortalecer los terpenos libres en el vino. Se utilizan temperaturas de 14oC durante
30 días.
12.2.5 - Filtración y Clarificación de Vinos

Las pectinas y los glucanos son dos causas principales de problemas de
clarificación y filtración. Ambos forman coloides, sustancias solubles de alto peso
molecular que permanecen en suspensión en el vino y se adhieren a las partículas
sólidas. La pectina, por ejemplo, es la sustancia que agregan los productores de
gelatina para espesarla. Los glucanos son sustancias gomosas que pueden causar
problemas extremos de clarificación. Un tipo conocido es el glucano de Botrytis y
tiene su origen en Botrytis cinerea, un hongo o "podredumbre" que ataca a las uvas.
Aunque solo una pequeña proporción de las uvas se ha visto afectada por esta
"podredumbre", los vinos resultantes suelen ser difíciles de filtrar.
El enturbiamiento estable generalmente es causado por pectinas residuales,
glucano de Botrytis o gluco-mananos en las paredes de las células de levadura.
Estos coloides adversos son degradados por un complejo enzimático pectinolítico
con actividad lateral de glucanasa, que se añade al vino poco después de la
fermentación alcohólica. La temperatura del vino joven (superior a 15oC) es
necesaria para que las enzimas funcionen de forma eficiente. La adición de este
complejo enzimático a menudo da como resultado una clarificación espontánea del
vino. El tiempo de contacto considerado es entre 10 y 15 días.
Las ventajas obtenidas con esta tecnología enzimática se deben
fundamentalmente a una mejor clarificación y una filtración más libre de obstáculos.
Los ahorros conseguidos en el proceso de filtración se pueden ver en una prueba
de vino blanco donde, sin el tratamiento enzimático, solo se podrían filtrar 60 hL
antes de que se obstruyera el filtro de diatomeas. Cuando se utilizó el complejo
pectinolítico que contenía -glucanasas, se pudieron filtrar sin problemas 450 hL de
vino.
157
El tratamiento enzimático no solo ahorra medios filtrantes, también ahorra
vino. Un simple experimento muestra cuánto vino se pierde durante la filtración. Si
dejamos secar 3 kg de diatomeas saturadas de vino, acabaron pesando sólo 1 kg,
los 2 kg que faltan representan aproximadamente 2 litros de vino que se evaporan.
Oxidación del vino

El oscurecimiento, la formación de precipitados y el desarrollo de turbidez durante
el procesamiento o almacenamiento de los vinos pueden ser los principales problemas
para la industria. Esto ocurre por la presencia de compuestos fenólicos, que sufren
oxidación, donde generalmente son adsorbidos y eliminados por gelatina o bentonita, que
tienen baja especificidad, pueden afectar el color y aroma, y generar problemas de
eliminación.
La lacasa y otras oxidasas, de Polyporus versicolor o Trametes versicolor, se
pueden utilizar para eliminar o modificar estos compuestos fenólicos y mejorar las
características organolépticas y la estabilidad del vino. Después del tratamiento
enzimático, los polifenoles oxidados indeseables pueden eliminarse mediante filtración o
clarificación con sílice.
12.3 - REFERENCIAS
― BURNS, J.; GARDNER, PT; MATTHEWS, D.; DUTHIE, GG; LEAN, MEJ; CROZIER, A.;
Extracción de fenólicos y cambios en la actividad antioxidante del vino tinto durante la vinificación. Revista de
química agrícola y alimentaria, 49, 5797-5808, 2001.
1996.
― HUMBERT-GOFFARD, A.; SAUCIER, C.; MOINE-LEDOUX, V.; CANAL-LLAUBÈRES, RM;
DUBOURDIEU, D.; GLORIAS, Y.; Un ensayo de actividad glucanasa en vino. Tecnología enzimática y
microbiana, 34, 537-543, 2004.
― MINUSSI, RC; PASTORE, GM; DURÁN, N.; Posibles aplicaciones de la lacasa en la industria alimentaria.
Tendencias en ciencia y tecnología de los alimentos, 13, 205-216, 2002.
― NOVOZYMES. Cómo producir el vino tinto preferido por los consumidores. Biotimes, 6-7, junio de 2005.
― PALOMO, ES; HIDALGO, MCDM; GONZÁLEZ-VIÑAS, MA; PÉREZ-COELLO, MS;
Potenciación aromática en vinos de diferentes variedades de uva mediante glucosidasas exógenas.
Química de los alimentos, 92, 627-635, 2005.
― RIZZON, LA; MIELE, A.; MENEGUZZO, J.; ZANUZ, MC; Efecto de tres procesos de vinificación
sobre la composición química y la calidad del vino Cabernet Franc. Pesquisa Agropecuária Brasileira,
34 (7), 1285-1293, 1999.
― ROLDÁN, A.; PALACIOS, V.; PEÑATE, X.; BENÍTEZ, T.; PÉREZ, L.; Utilización de extractos
enzimáticos de Trichoderma en la vinificación de uvas Palomino fino en la región de Jerez. Revista de
Ingeniería de Alimentos, 75, 375-382, 2006.
― XU, F.; Aplicaciones de las oxidorreductasas: avances recientes. Biotecnología industrial, 1 (1), 38 -50, 2005.
158
CAPÍTULO 13 - PRODUCCIÓN DE ALCOHOL
13.1 - ALCOHOL EN BEBIDAS
Durante siglos se ha practicado la producción de bebidas alcohólicas
fermentadas a partir de materias primas que contienen almidón. La elección de la
materia prima difiere en todo el mundo, como se ve en la tabla 1.
Cuadro 1 - Bebidas alcohólicas de cereales y tubérculos

Bebidas Países Fuentes
Whisky América del norte Maíz; Trigo
Whisky de Reino Unido Cebada; Otros cereales
malta
Ginebra Holanda, Inglaterra Cebada, centeno o maíz y enebro
(Juniperus communis)
Aquavit Escandinavia Papa; Cereales
Vodka Europa del Este, Rusia Centeno o patata;
adjuntos: cebada, trigo,
avena
Kornbrand Alemania Trigo, cebada, centeno,
avena
Retirar Lejano Oriente Arroz
Cualquiera que sea la materia prima, el almidón es siempre el ingrediente

básico. Como ya se vio en el capítulo 9, el almidón está compuesto por largas
cadenas de moléculas de glucosa, que deben hidrolizarse en moléculas más
pequeñas, como dextrinas y disacáridos, para que la levadura pueda transformarlas
en alcohol.
Tradicionalmente, las enzimas se obtenían agregando malta, pero desde la
década de 1960 se ha producido un cambio radical en muchos países y la malta ha
sido reemplazada por completo en las destilerías por el uso de enzimas industriales.
El uso de enzimas industriales tiene muchas ventajas:
• Unos pocos litros de preparación enzimática pueden reemplazar 100 kg de malta;
• En términos de costos de materias primas, se pueden esperar ahorros del 20 al
30%;
• Las enzimas industriales tienen una actividad uniforme y estandarizada, lo que
hace que la destilación sea más predecible y ofrece una mayor posibilidad de
obtener buenos rendimientos en cada una de las fermentaciones;
• La calidad de la malta puede variar según las condiciones climáticas y los
aspectos estacionales, de un año a otro y de un lote a otro;
• Finalmente, las enzimas industriales funcionan mejor que la malta. Las amilasas
microbianas con mejor actividad están disponibles a valores de pH bajos.
También están disponibles amilasas extremadamente termoestables que
continúan licuando el almidón a 100C, mucho después de que se hayan
destruido las enzimas de la malta.
159
13.1.1 - Licuefacción de almidón
Antes de que las enzimas puedan atacar el almidón, se debe gelatinizar.
Esto generalmente se hace cocinando a presión. Las patatas, por ejemplo, se
calientan a 150 C, a una presión de 5 atm. Cuando la presión se libera
repentinamente, las paredes celulares de las patatas explotan literalmente,
liberando el almidón. En este caso, las enzimas se añaden al tanque de maceración
después de la cocción, pero en otros casos se puede usar una enzima altamente
termoestable en el propio recipiente de cocción.
La aplicación del método de cocción sin presión ha aumentado
especialmente en las pequeñas destilerías. En lugar de 150 C, la temperatura
máxima es de 60 a 95 C, hay un evidente ahorro energético y no hay necesidad
de invertir dinero en la compra de recipientes a presión. En este caso, el tiempo y la
temperatura de gelatinización del almidón varían dependiendo de la cantidad de
amilosa presente en el almidón constituyente de la verdura. Así, cada tipo de
almidón tiene un rango de temperatura de gelificación característico,
correspondiente al punto de máxima viscosidad del sólido (tabla 2). Este intervalo
se mide desde el inicio de la desaparición de las áreas cristalinas del grano hasta
su final, visible al microscopio con luz polarizada.
Tabla 2 - Contenido de amilosa e intervalos de gelificación del almidón
Almidón % Amilosa Gelificación,
ºC
Arroz 18 61 - 77
Papa 22 56 - 62
Mandioca 10 51 - 63
Maíz 27 62 - 71
Trigo 24 58 - 64
Independientemente de la técnica utilizada para la gelificación del almidón,

después de este procedimiento se utilizan -amilasas para hidrolizarlo (almidón
gelatinizado) en fragmentos moleculares cortos (dextrinas). Brevemente, la
licuefacción del almidón corresponde a la primera etapa en la producción de
edulcorantes a partir de la materia prima del almidón, es la hidrólisis parcial del
almidón.
En el pasado se realizaba mediante la acción de ácidos (generalmente ácido
clorhídrico) seguida de neutralización. El uso de ácidos genera subproductos
indeseables desde el punto de vista de la industria alimentaria, como el
hidroximetilfurfural y sus derivados. Este problema alentó la búsqueda de
reacciones catalizadas por enzimas específicas que permitieran la hidrólisis "más
limpia" (mostrada en la figura 1).
Se han desarrollado varios procesos de licuefacción enzimática:
• Uso de enzimas - Calefacción - Enzima
• Uso a baja temperatura
• Doble Enzima / Doble Calentamiento
• Enzima doble / calentamiento individual
• Licuefacción Térmica
160
El uso de -amilasas permite una licuefacción "más limpia", sin la formación
de subproductos indeseables.
Figura 1 - Licuefacción de Almidón por el proceso tradicional y por vía enzimática (amilasas)
Las endo- -amilasas utilizadas en la licuefacción del almidón a menudo son

producidas por Bacillus subtiliis, utilizado en la licuefacción enzimática-calefactora-
enzimática. La consistencia del almidón en el tratamiento es 30-40% p / vy la
reacción de conversión se desarrolló a 85ºC / 1h y pH 6.0-6.5.
El proceso también se puede realizar en una sola etapa con amilasas de
extrema tolerancia térmica. En este caso, el tratamiento se realiza a pH 5,8-6,2 a
105-107ºC. Las amilasas son producidas por Bacillus licheniformis o por B.
stearothermophilus utilizado en licuados de los tipos Baja temperatura, Doble
Enzima / Doble Calentamiento, Doble Enzima / Calentamiento Simple y
Licuefacción Térmica.
El principio en la licuefacción del almidón por amilasas es la hidrólisis del
polímero al azar por acción de endo-amilasas, lo que da lugar a oligómeros de
menor masa molar, que, por tanto, presentan menor viscosidad en solución.
13.1.2 - Sacarificación del almidón

La sacarificación comprende la etapa final de la degradación enzimática del
almidón e implica la conversión casi completa del polímero en glucosa. En la
sacarificación se utilizan exo- -amilasas (amiloglucósidos), que principalmente
convierten maltosa en glucosa. Por tanto, la enzima amiloglucosidasa es capaz de
lograr una hidrolización casi completa del almidón en azúcares fermentables
(glucosa).
161
Maltodextrina producida a partir de almidón licuado, cuando es sacarificado a
un mayor grado de hidrólisis, utilizando enzimas ( -amilasa fúngica de Aspergillus
oryzae,
−   (       
)           
 ()   − () − (  
)  − (   ©)
Las condiciones para la sacarificación suelen ser: temperatura de 60ºC / pH
4-5 / tiempo de proceso entre 48-96 h / proceso realizado en lote o continuo).
Aplicando enzimas como -amilasas, glucoamilasas y pululanasas, se
pueden obtener jarabes con niveles intermedios de conversión a maltosa.
13.1.3 - Fermentación alcohólica
Así, durante la fermentación, los azúcares obtenidos de la sacarificación del
almidón se convierten en alcohol mediante la acción de las levaduras y luego se
destila el alcohol.
Las enzimas se pueden utilizar como ayudas tecnológicas. Los cereales que
contienen almidón, especialmente el maíz, tienden a tener un bajo contenido de
compuestos nitrogenados. Esto da como resultado un menor crecimiento de
levadura y tiempos de fermentación más largos. La adición de una pequeña
cantidad de enzima hidrolizante a la masa resuelve este problema.
13.2 - ALCOHOL COMBUSTIBLE

En países con capacidad agrícola inactiva, el etanol producido a partir de
biomasa puede representar un sustituto, diluyente o agente para aumentar el
octanaje del combustible de motor tradicional. Mientras que las materias primas a
base de azúcar como la garapa o la melaza, pueden fermentarse directamente;
esto no es posible con materias primas a base de almidón, que primero deben
hidrolizarse a azúcares fermentables.
Aunque el equipo es diferente, el principio de aplicación de enzimas en la
producción de alcohol combustible a partir de almidón es exactamente el mismo
que el principio de producción de alcohol para bebidas.
En este caso, el tiempo de sacarificación puede variar y es menor que el
tiempo requerido en el paso análogo para la producción de azúcar ya que una
conversión completa a glucosa antes de la fermentación puede no ser necesaria o
deseable.
Gran parte del alcohol se produce mediante un proceso de "molienda en
seco", en el que el grano se muele entero y luego se mezcla con agua. El mosto
resultante contiene proteínas, aceites, grasas, fibras y almidón. El primer paso
después de moler el grano es abrir el almidón de estructura estrecha e hidrolizarlo
enzimáticamente en oligosacáridos (polisacáridos pequeños y solubles). Es mucho
más difícil hidrolizar el almidón en el mosto molido en seco que en una suspensión
de almidón puro, debido a las grasas y proteínas solubles.
162
Además, el calcio, que es un estabilizador de -amilasa, reacciona y se
vuelve menos disponible para la enzima, por lo que es necesario agregar piedra
caliza. Desafortunadamente, el calcio puede formar un depósito cristalino duro de
oxalato de calcio durante las etapas de evaporación. Esta película reduce la tasa de
transferencia de calor en los intercambiadores de calor y debe limpiarse, un proceso
que requiere el apagado temporal de la instalación.
Otro revés para la producción de etanol es la viscosidad del mosto licuado. Si
un mosto es demasiado espeso, no pasará eficientemente a través de los
intercambiadores de calor.
También se debe minimizar el nivel de sal. Las enzimas de licuefacción
convencionales funcionan mejor a un pH cercano a 6.4, pero no menos de 6.2.
Primero, el pH se aumenta lo suficiente para una hidrólisis enzimática eficaz y luego
se reduce de nuevo para la sacarificación y fermentación posteriores. La sal se
forma debido a este ajuste de pH.
Por tanto, se obtuvo una -amilasa altamente activa en forma líquida, que
aporta los siguientes beneficios en comparación con las -amilasas
convencionales:
• Tolerancia a un pH más bajo (el óptimo es 5,8, pero la enzima se ha utilizado en
niveles cercanos a 5,0), formándose menos sal ajustando el pH.
• Menor necesidad de calcio, disminución de la deposición de oxalato y el costo de
agregar piedra caliza.
• Disminución más rápida de la viscosidad. Esto reduce la caída de presión en el
intercambiador y también mejora la transferencia de calor y extiende la vida útil
del equipo.

Materiales lignocelulósicos
La producción de alcohol puede utilizar como materia prima no solo almidón,
como maíz, arroz, papa, mandioca, residuos de procesamiento, por ejemplo, harina de
babasú y cereales, así como lignocelulósico, con los principales ejemplos de azúcar de
caña de azúcar y su residuos (bagazo y paja), y algunos residuos celulósicos, como
mazorca de maíz y paja de arroz y trigo.
Los materiales lignocelulósicos se componen principalmente de celulosa (40 - 60%
de la masa seca), hemicelulosa (20 - 40%) y lignina (10 - 25%), y antes de su conversión
por fermentación en alcohol, necesitan un procesamiento previo. pasos.tratamiento e
hidrólisis.
El pretratamiento consiste en un paso mecánico de limpieza y trituración de la
materia prima hasta tamaños de 1 a 3 mm, facilitando los pasos físicos, químicos y / o
biológicos de eliminación de hemicelulosa y lignina y modificación de la estructura
celulósica.
163
Los principales pretratamientos utilizados son:
• Hidrólisis ácida  H2SO4, HNO3 y HCl diluidos (0,5 - 1,5%), T> 160 °
C, rendimiento de xilosa de 75 a 90%.
• Hidrólisis alcalina  NaOH y KOH, eliminación total de lignina y
hemicelulosa parcial
• Explosión de vapor Inyección de vapor (20 - 50
bar, 210-290 ° C) y descompresión
repentina; rendimiento de xilosa de 45 -
65%.
• Biodignificación  Uso de hongos y / o lignina peroxidasa para eliminar la
lignina
Estos métodos se utilizan generalmente en combinación para obtener una mayor
hidrólisis de la hemicelulosa. Se ha desarrollado un método enzimático para la producción
de etanol a partir de la hidrólisis de hemicelulosa con xilanasa, o bien, la isomerización de
xilosa a xilulosa, que luego se fermenta con etanol.
Después de los pretratamientos realizados, comienza la etapa de hidrólisis de
celulosa a azúcares fermentables mediante el uso de ácidos, que pueden ser diluidos o
concentrados, o mediante celulasas.
La hidrólisis enzimática está influenciada negativamente por características
estructurales tales como cristalinidad, grado de polimerización de celulosa y contenido de
lignina, y positivamente por el área superficial. El uso de un complejo celulósico de
diferentes microorganismos facilita la hidrólisis, ya que algunos productos, como la
celobiosis,
13.3 pueden inhibir enzimas, como-glucosidasas.
- REFERENCIAS
― BARUQUE FILHO, EA; BARUQUE, MGA; SANT'ANNA JR., GL; Almidón de coco babasú
Licuefacción: un enfoque a escala industrial para mejorar el rendimiento de conversión. Tecnología de
fuentes biológicas, 75, 49-55, 2000.
― COLLINS, T.; GERDAY, C.; FELLER, G.; Xilanasas, familias de xilanasas y xilanasas extremófilas.
Reseñas de Microbiología FEMS, 29, 3 -23, 2005.
1996.
― GRIS, KA; ZHAO, L.; EMPTAGE, M.; Bioetanol. Opinión actual en biología química, 10, 141-146,
2006.
― HAMELINCK, CN; VAN HOOIJDONK, G.; FAAIJ, APC; Etanol a partir de biomasa
lignocelulósica: comportamiento tecnoeconómico a corto, medio y largo plazo. Biomasa y bioenergía,
28, 384-410, 2005.
― NIGAM, JN; Producción de etanol a partir del hidrolizado de hemicelulosa de paja de trigo por Pichia stipitis.
Revista de biotecnología, 87, 17-27, 2001.
― NOVOZYMES. La superenzima produce alcohol de calidad superior. Biotimes, marzo de 2003.
― NOVOZYMES. De paja a combustible. Biotimes, 4-5 de diciembre de 2003.
― NOVOZYMES. Las enzimas reemplazan la malta lenta pero firmemente. Biotimes, pág.2, mayo de 2006.
164
― SAHA, BC; Bioconversión de hemicelulosa. Revista Industrial de Microbiología y Tecnología, 30,
279-291, 2003.
http://www.clubedavodka.com.br/como_e_prodendido.asp
http://www.culturajaponesa.com.br/htm/saque.html
http://www.cyberclip.com/Katrine/NorwayInfo/words/aquavit.html
http://www.debiq.faenquil.br/aferraz/Enzimologia/enzfig46.htm
http://www.dkv-korn.de/fakten/index.php3
http://www.scotchwhisky.com/
165
CAPÍTULO 14 - INDUSTRIA LÁCTEA
Leche natural significa el producto entero, sin adulterar y sin calostro,

ordeñado higiénicamente, de precedencia regular, completa e ininterrumpida de
hembras mamíferas, domésticas, sanas y bien alimentadas. La leche, al ser
considerada un alimento completo en nutrientes (fácilmente asimilable), es
excelente para el hombre, y también para los microorganismos, como medio de
cultivo.
La leche se compone de proteínas, grasas, lactosa, vitaminas y minerales.
La principal proteína de la leche es la caseína, que representa del 77 al 82% de sus
proteínas totales. Mediante la acción del cuajo, o ácidos orgánicos, es posible
producir una masa coagulada, denominada cuajada, que además de caseína tiene
grasa, agua y algunos minerales. Esta masa cuajada es la misma que una vez
prensada, salada y madurada, se transformará en queso, que es uno de los
productos lácteos más antiguos e importantes.
Otras proteínas de la leche son la albúmina y la globulina, que son solubles
en agua y precipitadas por la acción del calor (temperatura de 90 a 100ºC). Como
albúmina de la leche se encuentran: lactoalbúmina y seroalbúmina. La Tabla 1
muestra la comparación de la composición de la leche de varios mamíferos en
relación con los porcentajes p / v de proteína, grasa, lactosa, cenizas y agua
presentes.
Tabla 1 - Composición centesimal de la leche de diversas especies animales
Especie Proteína (%) Gordo (%) Lactosa (%) Cenizas Agua (%)
s (%)
Humano 1,5 3,5 7.0 0,2 87,8
Bovino 3,5 3.8 5,0 0,7 87,0
Caprina 4.0 3,0 4.8 0,8 87,4
Oveja 5.4 8.2 4.8 0,9 80,7
Equino 2.6 1,6 6.1 0.4 89,3
Búfalo 4.1 7.7 4.8 0,7 82,7
La elaboración de queso siempre ha requerido el uso de enzimas. Ya en el

año 800 a. C., la Ilíada de Homero habla del uso del estómago de los niños en la
elaboración del queso. En 1874, una de las primeras enzimas producidas
industrialmente fue una preparación de cuajo de ternera para la coagulación de la
leche. Hoy en día, la coagulación de la leche y la hidrólisis de lactosa son las dos
áreas principales de aplicación de las enzimas en la industria láctea.
14.1 - FABRICACIÓN DE QUESOS

El queso es un producto sólido derivado de la leche, obtenido de su
coagulación con enzima o ácido láctico, seguida de la separación del suero. Así, la
materia prima utilizada en la elaboración del queso es la leche, siendo la de vaca la
más utilizada.
166
Para algunos tipos específicos de queso, se utilizan otras leches como la
leche de oveja (queso Roquefort), la leche de búfala (queso mozzarella), la leche de
cabra (queso Sainte-Maure y Chabichou) o el suero (ricotta).
El método de elaboración del queso consiste en transformar parte de los
componentes de la leche en un producto de fácil mantenimiento, menor volumen,
alto valor nutricional, agradable sabor y buena digestibilidad. A pesar de la gran
cantidad de tipos de queso, dependiendo de las diferentes composiciones de los
distintos tipos de leche, los principios básicos de elaboración son los mismos para
todos ellos y comprenden las etapas de coagulación, escurrimiento y maduración,
como se muestra en la Figura 1.
Figura 1 - Pasos de la elaboración del queso
14.1.1 - Coagulación de la leche

La primera etapa de la elaboración del queso es la coagulación de la leche.
Éste, en su constitución, contiene una serie de enzimas como peroxidasas,
proteasas, fosfatasas ácidas y oxidasas que son parcialmente térmicamente
estables y resisten la pasteurización. La pasteurización (calentamiento a 71,7ºC
durante 15 segundos HTST - High Temperature Short Time) es necesaria para
destruir la flora microbiana patógena (Mycobacterium tubeculosis, Brucella abortus,
Salmonella typhi, Clostridium perfringens y Bacillus cereus) que puede estar
presente de forma natural en la leche. antes de la elaboración del queso,
especialmente aquellos que se someterán a un período de maduración superior a
60 días.
Una sustancia activa en el estómago de los rumiantes jóvenes (terneros,
corderos, cabritos), la enzima renina o quimosina, es la principal responsable de la
coagulación de la leche. Durante mucho tiempo, se utilizaron estómagos sanos de
cabras para hacer queso; luego se pasó a utilizar extractos obtenidos en solución
salina, donde la filtración del extracto puede ser utilizada o no para purificar la
solución final de renina. La renina obtenida del estómago de cerdo también tiene
acción coagulante, pero es más sensible a la variación del pH, por lo que se
prefieren las obtenidas de terneros.
167
Industrialmente, la renina consiste en una mezcla de quimosina y pepsina. La
relación quimosina: pepsina varía considerablemente con la edad del animal, que
cuanto más joven, mayor es la proporción de quimosina, que es la más deseable
por su especificidad en la hidrólisis del enlace formado entre los aminoácidos
fenilalanina y caseína metionina. Esta hidrólisis favorece la coagulación (floculación
de las micelas de caseína en presencia de ácido láctico y cuajo) formando un gel
que retiene el suero.
La ventaja de la renina es que combina una excelente capacidad de
coagulación de la caseína con una pobre capacidad de hidrólisis de la caseína
después de la coagulación. La mayoría de las otras enzimas proteolíticas también
son capaces de cuajar la leche, pero su efecto continúa después de la coagulación
de la caseína (lo mismo ocurre con la coagulación ácida). El resultado tiende a ser
una maduración excesiva del queso y la formación de productos con sabor amargo
debido a la hidrólisis de la caseína.
La limitación de la fuente de quimosina pura alentó la búsqueda de fuentes
alternativas de proteasas que actúen de manera similar a la quimosina en la leche.
También se han probado proteasas extraídas de vegetales para reemplazar la
renina: papaya papaya, higos verdes y bromelina de piña, pero sin mucho éxito
porque el grado de hidrólisis es muy intenso e inespecífico.
Las flores de algunos cardos contienen enzimas con actividad coagulante de
la leche y se han utilizado en la elaboración artesanal de queso de Serra da Estrela
en Portugal. El cardo, especialmente Cynara cardunculus y Centaurea calcitrapa,
tiene proteasas coagulantes en las semillas, flores y hojas.
El desarrollo del cuajo microbiano.
A principios de los años sesenta y setenta, un aumento en el consumo de
queso provocó un aumento correspondiente en la demanda de cuajo. Al mismo
tiempo, aumentó el consumo de carne de vacuno y la matanza de terneros jóvenes
se volvió menos atractiva en términos comerciales. Estas tendencias han provocado
una escasez de cuajo animal y los precios han subido.
Así, se inició el desarrollo de sustitutos adecuados del cuajo de origen
animal, donde la investigación se centró en microorganismos capaces de producir
una enzima como la renina. Las enzimas microbianas que han ido reemplazando
gradualmente al cuajo animal son producidas por Mucor miehei, Mucor pusillus,
Bacillus subtilis y Parasitic endothia (utilizado en quesos suizos e italianos). En
general, son menos específicos, sin embargo, los costos de obtener la enzima
animal y la enzima microbiana son comparables.
Las reninas microbianas tienen mayor termorresistencia que los animales,
permanecen activas durante más tiempo en el queso y producen aromas
desagradables. El tratamiento químico con agentes oxidantes aplicado a la renina
de Mucor miehei proporciona una enzima con propiedades similares al cuajo animal
en términos de rendimiento y calidad del producto final. Existen muchos estudios
dedicados a la producción de quimosina mediante técnicas de ingeniería genética
en bacterias y hongos.
168
Es importante señalar que el tiempo y el grado de coagulación en la
producción de queso se ven afectados por varios factores:
• Composición de la leche: el contenido de caseína influye en el tiempo de
coagulación, la firmeza del cuajo y el rendimiento del queso;
• Acidez: el aumento de la acidez disminuye el tiempo necesario para obtener un
cuajo firme. El efecto varía con la enzima. Esto es más bajo para la renina animal
(pH óptimo entre 5 y 6) y más alto para las proteasas microbianas;
• Nivel de calcio: el aumento del contenido de calcio disminuye el tiempo de
coagulación y la producción de cuajo firme. Sin embargo, la adición de cloruro de
calcio puede provocar la pérdida de frescura del producto.
• Temperatura de solidificación: la temperatura óptima varía entre 87 y 93 ° C,
según el tipo de queso. El tiempo de formación del cuajo disminuye al aumentar
la temperatura. Las variaciones de temperatura también afectan la retención del
queso y la composición resultante.
Además de estos factores, varios otros pueden afectar la actividad de la
renina, como el agua con contenido alcalino o el exceso de cloruro que puede
inactivar las enzimas; y la disminución de la actividad enzimática en condiciones de
almacenamiento en refrigeración (1% mensual, en promedio, a 6 - 7ºC). En el caso
de la renina, una pequeña cantidad permanece activa durante la etapa de curado o
maduración, lo que lleva a la hidrólisis continua de la caseína. El grado y la
naturaleza de los compuestos creados contribuyen al sabor y la textura
desarrollados en el producto final.
14.1.2 - Maduración del queso

Después de cuajar, la cuajada se corta y se cuece. Se contrae y el suero se
separa. A continuación, se sala, se prensa y se madura la cuajada seca. Las
enzimas también juegan un papel decisivo en la maduración de los quesos,
especialmente las enzimas que hidrolizan proteínas y grasas (proteasas y lipasas).
Durante los meses de maduración de los quesos, las enzimas producidas por los
cultivos iniciales y / o añadidos son importantes para el desarrollo del sabor.
Uno de los pasos más costosos en el proceso de elaboración del queso es
su almacenamiento. Añadiendo proteasas a los quesos frescos, es posible
reproducir el sabor de los quesos maduros en un período de tiempo más corto, por
ejemplo, un mes en lugar de 4 meses. Además de acelerar el proceso de
maduración, las enzimas también permiten la elaboración de productos lácteos con
sabores intensos y únicos.
Estos quesos “modificados enzimáticamente” se suministran en forma de
pasta o polvo seco, mediante atomización, y su elaboración suele tardar 2
semanas. Se pueden incluir en muchos alimentos donde se desea un sabor a
queso: queso fundido, sopas, salsas, condimentos, etc.
Los quesos también se pueden clasificar según la naturaleza y el grado de
maduración:
169
• Quesos de maduración predominantemente lácticos - es el que se da en la
mayoría de los quesos frescos (holandés, Port-Salut, Cheddar);
• Quesos de maduración propiónica - es la que se da en quesos que presentan
“huecos” por fermentación propiónica (Gruyere, Ermental);
• Maduración de quesos de Penicillium - se refieren a quesos en los que los
mohos actúan externamente (Camembert) y aquellos en los que la acción se
desarrolla íntegramente (Gorgonzola, Roquefort);
• Maduración de quesos por oidia, micodermos y otros microorganismos - el
resultado es el desdoblamiento de la proteína casi hasta el final de su
degradación, proporcionando un producto con un olor muy fuerte.
El sabor característico de los quesos azules (Gorgonzola, Roquefort) se
produce por la conversión parcial de la grasa láctea en ácidos grasos libres. Esto
normalmente se logra mediante las lipasas naturales del queso, pero los complejos
de lipasa industriales pueden realizar la misma conversión mucho más rápido. Las
lipasas también se pueden utilizar para acentuar el sabor picante de los quesos de
tipo italiano y los quesos especiales.
Aunque las lipasas tienen una gran diversidad de acción, con amplias
posibilidades para aplicaciones industriales, su uso hoy en día todavía está limitado
por varios factores: los procesos de producción de lipasas siguen siendo costosos;
la heterogeneidad de las preparaciones enzimáticas disponibles y la falta de lipasas
con características exactamente iguales a las requeridas por algunos procesos.
Las lipasas hidrolizan los lípidos de la leche para producir ácidos grasos, y el
tipo y la concentración de estos ácidos le dan al queso diferentes perfiles de sabor y
sabor. En general, la cantidad agregada de lipasa comercial es solo para
reemplazar parte de la enzima destruida en el proceso de pasteurización, con
lipasas de origen animal generalmente utilizadas - material glandular pre-gástrico
(ternero, cabrito, cordero) o de origen microbiano producido por proceso.
fermentativo con Mucor miehei.
Sin duda, tanto las lipasas como las proteasas son productos que
probablemente se producirán utilizando las técnicas recientes de ingeniería
genética y biología molecular que han sido desarrolladas por la ciencia. Se podrían
obtener enzimas con sitios activos diferenciados para diferentes aplicaciones, como
por ejemplo, aumentar su resistencia a la temperatura, pH y disminuir su tiempo de
proceso. Por otro lado, también existe una clara tendencia a buscar nuevos
microorganismos productores de enzimas con características específicas como
estabilidad térmica, pH óptimo, etc.
14.2 - LECHE DEFECTADA

La lactosa, un disacárido reductor, compuesto por galactosa y glucosa, es
prácticamente el único azúcar de la leche (de 37 a 54 g / L), aunque hay
polisacáridos y glicidos combinados en una pequeña proporción. La lactosa se
sintetiza principalmente a partir de glucosa, la parte de la cual se isomeriza a
galactosa, que, con el resto de glucosa, produce lactosa.
170
La solubilidad de la lactosa aumenta con el calor, por lo tanto, cristaliza con
el enfriamiento de las soluciones concentradas, propiedad que se utiliza para la
preparación del azúcar de la leche a partir del suero. La lactosa tiene un sabor
dulce suave en comparación con otros azúcares, lo que la convierte en una
cualidad desde el punto de vista dietético.
Mediante la acción de ácidos o enzimas diluidos, bajo calor, la lactosa se
hidroliza en glucosa y galactosa (Figura 2).
Figura 2 - Hidrólisis de lactosa a galactosa y glucosa, respectivamente.
Más de 2/3 de la población adulta del mundo, especialmente la gente de los

países en desarrollo, no puede beber leche corriente. Esto se debe a la deficiencia
de lactasa, la enzima esencial para la digestión de la lactosa. Al pretratar la leche
con esta enzima, todos los adultos con restricción de lactosa pueden beber leche y
una variedad de otros productos lácteos sin lactosa, como helado y yogur.
Lactasa (o -galactosidasa) tiene valores de pH óptimos que varían
considerablemente, dependiendo del microorganismo productor. Enzimas de
Saccharomyces sp. o Kluyveromyces sp. tienen un pH óptimo cercano a la
neutralidad mientras que las enzimas de diferentes cepas de Aspergillus sp. trabajar
en pH ácido (Tabla 2).
Tabla 2 - Propiedades de -galactosidasa
Fuente pH Temperatura óptima
óptimo (oC)
Aspergillus niger 3-4 55
Aspergillus oryzae 4.8 46
Escherichia coli 6,9 - 7,5 45
Saccharomyces fragilis 6.5 50
En la producción de helado, la hidrólisis de lactosa también se puede utilizar

para mejorar ciertas propiedades, como la cremosidad, dulzura y tendencia a
cristalizar. Por esta razón, la leche se vuelve más dulce y este aumento de dulzor
es ventajoso en la producción de leche aromatizada porque no hay necesidad de
agregar tanta azúcar.
El suero tratado con lactasa se puede utilizar como edulcorante en diversos
alimentos, como productos de panadería, refrescos y confitería. Este tratamiento
evita el desperdicio de grandes cantidades de suero que podrían representar un
potencial riesgo de contaminación, si se desechara, debido a la alta concentración
de materia orgánica.
171
14.3 - OTRAS APLICACIONES DE ENZIMAS EN PRODUCTOS LÁCTEOS
14.3.1 - Eliminación de peróxido de hidrógeno

El peróxido de hidrógeno se utiliza como esterilizador o conservante de la
leche y el suero, ya que destruye los microorganismos dañinos de la leche, y en
ocasiones se utiliza en el proceso de pasteurización como en la fabricación de
ciertos quesos como el suizo. La ventaja es que este proceso conserva las enzimas
naturales de la leche que se destruyen al calentar durante la pasteurización y que
contribuirán al desarrollo del sabor en el producto final.
Sin embargo, cuando se trata con peróxido de hidrógeno, queda un residuo
en la leche que puede inhibir o destruir el cultivo de leche requerido en la
producción de queso. Cualquier cantidad excesiva de peróxido de hidrógeno que
quede en la leche después del tratamiento puede descomponerse en agua y
oxígeno, mediante la aplicación de una enzima, catalasa, que puede derivarse de
una fuente animal (bovina) o microbiana (Micrococcus lysodeikticus).
14.3.2 - Sabor a leche caliente

El sabor característico de la leche caliente se atribuye a los compuestos
sulfhidrilados. Estos compuestos se liberan por calentamiento cuando la sulfhidril
oxidasa contenida en la leche se desnaturaliza simultáneamente. Esta enzima
puede oxidar los compuestos sulfhidrilados y eliminar el sabor desagradable
(presencia de mercaptanos) asociado con la leche caliente.
14.3.3 - Calidad de la leche refrigerada

La calidad de la leche cruda está estrechamente relacionada con el grado de
contaminación inicial y el binomio tiempo / temperatura en el que permanece la
leche desde el ordeño hasta el procesamiento.
La carga microbiológica de la leche cruda es de suma importancia en la
calidad final de los productos lácteos. Una leche de baja calidad microbiológica no
se conserva durante largos periodos, incluso bajo refrigeración, debido a su
contaminación principalmente por las bacterias psicrófilas que forman o no esporas,
que a pesar de su lento crecimiento, producen grandes cantidades de enzimas
(lipasas y proteasas), que alteran rápidamente el producto, en cuyo caso estas
enzimas son resistentes a los procedimientos de pasteurización, permaneciendo en
la leche durante el enfriamiento.
Lisozima
La lisozima es una enzima que se encuentra de forma natural en la mayoría de los
organismos, siendo más abundante en las claras de huevo de gallina, correspondiente al
0,3% p / p. Actúa como bactericida, lisando las paredes celulares bacterianas. En la
elaboración de queso, la lisozima combate la contaminación de las esporas de Clostridium
tyrobutyricum, que promueven la fermentación butírica, y se utiliza como sustituto de los
nitratos.
172
14.4 - REFERENCIAS
― FOX, PF; KELLY, AL; Enzimas indígenas en la leche: descripción general y aspectos históricos - Parte 1.
Revista láctea internacional, 16, 500-516, 2006.
― FOX, PF; KELLY, AL; Enzimas indígenas en la leche: descripción general y aspectos históricos - Parte 2.
1990.
1996.
― KELLY, AL; FOX, PF; Enzimas indígenas en la leche: una sinopsis de los requisitos de investigación futuros.
― MACEDO, AC; MALCATA, FX; Optimización tecnológica de la fabricación de queso Serra.
― FIESTA, AM; BARBOSA, M.; VILAS BOAS, L.; Ácidos grasos libres, triglicéridos y compuestos
volátiles en el queso Serra da Estrela - Cambios a lo largo de la maduración. International Dairy
Journal, 8, 873-881, 1998.
― PELLEGRINO, L.; TIRELLI, A.; Un método de HPLC sensible para detectar la clara de huevo de
gallina, la lisozimaína, la leche y los productos lácteos. International Dairy Journal, 10, 435-442, 2000.
― SALVADOR, SM; NOVO, C. DOMINGOS, A.; Evaluación de la presencia de proteasas aspárticas de
Centaurea calcitrapa durante la germinación de la semilla. Tecnología enzimática y microbiana, 38, 893-898,
2006.
― SILVEIRA, IA; CARVALHO, EP; TEIXEIRA, D.; Influencia de los microorganismos psicotróficos
en la calidad de la leche refrigerada. Higiene alimentaria, v. 12, 21-27, 1998.
173
CAPÍTULO 15 - MODIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
15.1 - PROTEASAS Y SUS APLICACIONES

La hidrólisis enzimática de proteínas se utiliza en un gran número de
industrias que procesan materias primas que contienen proteínas de origen vegetal
o animal en productos alimenticios o piensos.
Hay dos razones principales para utilizar la hidrólisis enzimática de proteínas:
• Solubilización de proteínas insolubles.
• Mejora de las propiedades funcionales de las proteínas., tales como
hidratación, emulsificación, gelificación, textura y formación de espuma.
El sustrato proteico puede tener los más variados orígenes, tales como: soja
(en la producción de leche de soja e hidrolizado altamente funcional), leche (en la
producción de hidrolizado de caseína y quesos y derivados), suero de leche,
extracto de levadura, huesos (obtención de gelatinas). y colágenos, y ayuda en la
eliminación de la carne adherida al hueso para reutilizar las sobras), sangre animal
y desechos de pescado.
Las proteasas actúan escindiendo proteínas por hidrólisis, pudiendo
clasificarse según la posición de ataque de la cadena proteica en endopeptidasa y
exopeptidasa, que pueden subclasificarse en carboxipeptidasa y aminopeptidasa,
es decir, actuando en los extremos con grupos carboxilo y amina, respectivamente.
También se pueden clasificar por la estrategia de catálisis de sus sitios
activos, como:
15.1.1 - Cisteína proteasas

La estrategia utilizada por estas enzimas es la activación del radical cisteína
por una histidina, actuando como nucleófilo que ataca el enlace peptídico. Puede
ser inhibido por agentes oxidantes, como H2O2, y metales pesados, como Hg2 +,
Fe3 + y Cu2 +.
Las principales fuentes de este tipo de proteasa son la piña (Ananas sativa),
de la que se obtiene la bromelina por precipitación en alcohol, la papaya (Carica
papaya), de la que se obtiene el látex de frutos verdes, que contiene un 20% de
papaína y quimopapaína. , y el higo (Fícus carica), del que se extrae la ficina del
látex.
La aplicación industrial de esta clase de proteasas está relacionada con el
ablandamiento de la carne, la estabilización de la cerveza y el vino, la fabricación
de cuero, las ayudas digestivas y la producción de hidrolizados de proteínas.
174
15.1.2 - Serina proteasas
Este tipo de proteasa escinde selectivamente enlaces peptídicos en el lado
carboxílico de aminoácidos, como triptófano, tirosina, fenilalanina y metionina,
donde el centro activo está formado por radicales de serina, histidina y aspartato, lo
que conduce a una alta reactividad del radical. serina, debido al ion alcóxido
formado y promueve el ataque nucleofílico sobre el sustrato carbonilo. Pueden ser
inhibidos por agentes alquilantes, como DFP (fluorofosfonato de diisopropilo) y
PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) o por inhibidores presentes en la soja y los
cereales.
Las fuentes de esta clase de proteasas son variadas, provenientes tanto de
animales, como quimotripsina, tripsina y elastasa (páncreas de ternero), como de
microorganismos, como la subtilisina (Bacillus licheniformis) y otras proteasas
fúngicas (Aspergillus flavus, A. candidus). , A. oryzae, A. melleus).
Las aplicaciones también varían, ya que la quimotripsina y la tripsina se usan
en diagnósticos y análisis clínicos, la subtilisina se usa en formulaciones de
detergentes y otras proteasas fúngicas se aplican para la hidrólisis de proteínas en
general, principalmente para mejorar el sabor de los alimentos.
15.1.3 - Proteasas aspárticas

La característica principal de estos centros activos es un par de radicales de
ácido aspártico que actúan juntos, lo que permite que una molécula de agua ataque
el enlace peptídico. Pueden ser inhibidos por macroglobulinas y pepstatina A (figura
1)
O H OH O H OH O
n norte
n n OH
o
O o O rt o O
rt rt
e
e e
HFigura 1 - Pepstatina
H A
También se conocen como proteasas ácidas, y sus fuentes son el estómago

de terneros y cabras (pepsina y quimosina o renina) y hongos (Aspergillus niger, A.
oryzae, A. saitoi, Mucor pusillus, M. miehei, Endothia parasitic, Rhizopus sp.).
Estas enzimas se utilizan principalmente en la elaboración de quesos, y
también en la clarificación de cervezas y vinos.
15.1.4 - Metaloproteasas
El centro activo de una de estas proteínas contiene un ión metálico unido
(zinc), que activa una molécula de agua para que actúe como nucleófilo para atacar
el péptido carbonilo. Puede ser inhibido por metales pesados, EDTA y fosfatos.
Este tipo de proteasa tiene solo origen microbiano, siendo las principales
fuentes Bacillus amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, Aspergillus niger y A.
oryzae, y se utilizan en la hidrólisis proteica generalizada, teniendo la ventaja de
actuar en pH neutro y ser insensibles a inhibidores de origen vegetal. fuentes de
proteasa.
175
15.2 - PROTEÍNAS VEGETALES
El uso de proteínas vegetales en la industria alimentaria ha aumentado
considerablemente en las últimas décadas. Este incremento se debe, en parte, al
ahorro obtenido al reemplazar la proteína animal por proteína vegetal de bajo costo.
Las principales fuentes vegetales de proteínas son las semillas oleaginosas, siendo
la soja la que tiene la mayor variedad de productos.
La aplicación de proteasas y celulasas en el proceso de producción de
concentrados y aislados de proteínas genera un producto final con propiedades
funcionales mejoradas. Esto se debe a que las semillas son como matrices
interconectadas de polisacáridos, como celulosa y hemicelulosa, y proteínas, que
pueden generar, en grandes cantidades, mala digestión; con el uso de celulasas,
esta red se escinde, lo que facilita la actuación de las proteasas.
Algunas proteasas fúngicas de Aspergillus oryzae promueven un aumento de
la capacidad emulsionante y espumante en los aislados de proteína de soja,
denominándose proteína de soja isoeléctrica soluble (ISSPH), conocida como
sustituto de la clara de huevo.
Con el aumento de la capacidad emulsionante de los hidrolizados de
proteína de soja, estos ya se están utilizando en la formulación de mayonesas,
salsas, carnes y embutidos.
Las proteínas vegetales deben procesarse antes de la hidrólisis enzimática.
El alto contenido proteico y el bajo nivel de polifenoles, azúcares e inhibidores de
proteasas facilitan el control del proceso enzimático, aumentando la eficacia de las
proteasas y el rendimiento del proceso. La principal desventaja de los hidrolizados
de proteínas vegetales en relación con la caseína y el suero es el bajo nivel de
aminoácidos esenciales (por ejemplo, aminoácidos azufrados en hidrolizados de
origen vegetal), que deben agregarse a la formulación para lograr el perfil de
aminoácidos estándar requerido .
15.3 - PROTEÍNAS CARNE
15.3.1 - Sangre
El plasma sanguíneo se usa ampliamente en productos cárnicos, pero la
fracción oscura del glóbulo rojo (parte que contiene hemoglobina), que concentra el
75% de la proteína sanguínea total, no se usa como tal. Debido a su color oscuro,
no es adecuado para casi todos los alimentos. Pero, con la ayuda de un proceso
enzimático, los glóbulos rojos se pueden convertir en hidrolizados de glóbulos
(HCS), obteniendo un líquido claro y transparente que, al secarse, se convierte en
un polvo blanco.
El HCS puede incorporarse en muchos productos cárnicos, como en el caso
del jamón y los trozos de carne enteros, ya que es soluble en salmuera; como
sustituto de las sales de polifosfato, cuyo uso ha sido prohibido en muchos países,
como agente nutritivo que une el agua en los productos de carne picada; o en
pequeñas concentraciones, el HCS se puede utilizar como potenciador del sabor de
la carne en el caso de la carne picada, a menudo en combinación con plasma
sanguíneo.
176
15.3.2 - huesos
El uso de sobras de limpieza de carnes y huesos se puede realizar de forma
más eficiente que la carnicería en un matadero mediante un tratamiento enzimático
con proteasas alcalinas. El hidrolizado, similar a una salsa, se puede utilizar en
productos cárnicos enlatados, como patés y embutidos, o en sopas.
Para evitar la producción de hidrolizados desagradables, se puede agregar
gelatina al material a procesar.
15.3.3 - Procesamiento de carne

El ablandamiento de la carne para uso humano también puede llevarse a
cabo mediante proteasas, como la bromelina, la papaína y la ficina, comenzando a
realizarse a gran escala a partir de 1940.
Las proteasas se pueden aplicar como una dispersión en polvo sobre la
carne; sumergir la carne en la solución que contiene la enzima; rociar, en forma de
aerosol, la enzima sobre el material; inyección directa de la enzima en varias partes
del material; tratamiento post mortem (inyección de la solución de proteasa en el
músculo de la canal del animal antes del establecimiento del rigor mortis) o
tratamiento previo a la muerte (inyección de la solución enzimática de papaína en la
vena yugular del animal, 10 a 20 minutos antes del sacrificio), esto siendo el método
más aceptado, ya que se distribuye por todos los músculos del cuerpo, pero solo
actúa cuando la carne se somete a cocción.
Varias enzimas endógenas participan en el proceso de muerte del animal,
incluidas las proteinasas, en particular las catepsinas. Estas enzimas modifican la
proteína muscular durante la maduración y envejecimiento de la carne.
La maduración lenta de las canales o trozos de carne tiene la ventaja de
producir una carne muy tierna, pero promueve la pérdida de humedad y el
consiguiente encogimiento. La maduración óptima de la carne, que se da en
ambientes fríos (1 - 2oC, 83 - 86% de humedad), promueve la pérdida de
aproximadamente un 7% de agua en 3 a 4 semanas.
Si las preparaciones enzimáticas se rocían solo sobre la superficie de la
carne (como se recomienda para cocinar) o si se sumergen trozos de carne en la
solución enzimática, solo se ablanda la superficie y el interior permanece duro. En
la cocina, después de la aplicación de enzimas (por ejemplo: NaCl al 2% con
bromelina al 0,002%), la carne se voltea repetidamente para permitir una
penetración más fácil de la enzima. El mayor efecto del uso de proteinasas ocurre
solo durante la cocción.
La hidrólisis de carne picada o subproductos cárnicos a través de una
proteasa produce un alimento cárnico líquido o un lodo de viscosidad mucho menor,
siendo más fácil de manipular y transportar a la planta de procesamiento. Sin
embargo, existen otras ventajas de especial relevancia, como el sabor de la comida
para mascotas, producido por péptidos y aminoácidos generados en la hidrólisis
enzimática de la carne.
177
15.4 - PROTEÍNAS DE PESCADO
En la producción de harina de pescado, se cuece y se prensa para reducir su
contenido de agua antes de proceder con el procesamiento. Esta agua de
prensado, que contiene un bajo contenido en proteínas, se evapora tanto como sea
posible en evaporadores multietapa.
El límite de este proceso se alcanza cuando el producto es tan viscoso que
tiende a solidificarse en las paredes del evaporador, disminuyendo la eficiencia de
transferencia de calor y la capacidad del evaporador. Una alternativa a suspender
las actividades de la industria pesquera para limpiar las superficies de
calentamiento hirviéndolas con solución alcalina, es la adición de proteasas al agua
de prensado, haciéndola menos viscosa y se puede evaporar con un mayor
contenido de sólidos secos.
Una de las ventajas para los productores de harina de pescado es que los
evaporadores podrán duplicar o triplicar su tiempo de funcionamiento, antes de que
sea necesario limpiar los depósitos por ebullición.
La producción de caldo de pescado, muy apreciada en los países orientales,
se obtiene por fermentación natural, conservando el pescado con sal durante casi 1
año, tras lo cual el líquido se filtra y se comercializa. Para acelerar este proceso, se
puede agregar proteasa, como bromelina.
Los hidrolizados de proteína de pescado se pueden utilizar como nutrientes
para la formulación de medios de cultivo o para piensos para pollos.
15.5 - OTRAS APLICACIONES

La gelatina se produce a partir del colágeno que se encuentra en los huesos
y el cuero de los animales. Dependiendo del tratamiento que se le dé a la materia
prima, ya sea ácida o alcalina, existen, respectivamente, gelatinas tipo A y tipo B. El
tratamiento alcalino del colágeno del cuero animal implica sumergirlo y mantenerlo
a pH elevado durante varios días. Sin embargo, usando una proteasa o una
colagenasa, el proceso dura 24 horas. El factor limitante para el uso de colagenasa
es la fuente microbiana patógena utilizada para obtenerla.
La gelatina hidrolizada se utiliza como ingrediente en alimentos dietéticos y
cosméticos. Se puede aplicar hidrólisis enzimática de gelatina para recuperar sales
de plata de películas fotográficas, así como azúcar de restos de confitería.
La hidrólisis de queratina, existente en cabello y plumas, por queratinasa es
de especial interés para las industrias cosméticas, ya que el proceso actual es un
tratamiento térmico realizado a alta presión. Pocas proteasas son capaces de
degradar esta proteína, debido a la gran cantidad de enlaces disulfuro, requiriendo
un pretratamiento con agentes reductores, como mercaptoetanol y ácido tioglicólico.
La queratinasa también se obtiene de una fuente microbiana patógena
(Streptomyces fradiae).
178
Plastein
La reacción plasteína se refiere a varias reacciones que involucran una proteólisis
inicial, que al alcanzar un contenido de sólidos totales del 30 al 35%, inicia una síntesis de
enlaces peptídicos por la proteasa (generalmente papaína, pepsina o quimotripsina),
formando un nuevo polipéptido, diferente de la proteína original, con distintas
propiedades funcionales, como mayor viscosidad y poder gelificante, resulta interesante
como espesante en los alimentos.
15.6 - REFERENCIAS
― AHAMED, A.; SINGH, A.; WARD, OP; Incorporación de pepstatina en medios de cultivo para la
reducción de la actividad proteasa en filtrados de Aspergillus niger NRRL-3, Process Biochemistry,
41, 789-793, 2006.
― ALUKO, RE; McINTOSH, T.; La proteólisis enzimática limitada aumenta el nivel de incorporación de
proteínas de canola a la mayonesa. Ciencia de los alimentos innovadores y tecnologías emergentes, 6,
195-202, 2005.
Janeiro, 2004.
― CLEMENTE, A.; Hidrolizados de proteínas enzimáticas en la nutrición humana; Trends in Food
― DOUCET, D.; GAUTHIER, SF; NUTRIA, DE; FOEGEDING, EA; Gelificación inducida por enzimas
de proteínas de suero de leche ampliamente hidrolizadas por Alcalasa: comparación con la reacción de
plasteína y caracterización de interacciones. Revista de química agrícola y alimentaria, 51, 6036 -6042,
2003.
1990.
1996.
― KUMAR, R.; CHOUDHARY, V.; MISHRA, S.; VARMA, IK; MATTIASON, B.; Adhesivos y
plásticos a base de productos de proteína de soja. Cultivos y productos industriales, 16, 155-172, 2002.
― NOVOZYMES; Hidrólisis de proteínas y más, Biotimes, diciembre de 2001.
― NOVOZYMES; Más sabor en salchichas chinas, Biotimes, marzo de 2003.
― THOGERSEN, IB; HAMMES, SR; RUBENSTEIN, BS; PIZZO, SV; VALNICKOVA, Z.;
ENGHILD, JJ; Un nuevo miembro de la familia de proteínas del factor trébol es un-inhibidor de la
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― WILLIAMS, RJH; BROWNSELL, VL; ANDREWS, AT; Aplicación de la reacción de plasteína a la

micoproteína: I. Síntesis de Plastein. Química de los alimentos, 72, 329-335, 2001.
179
CAPÍTULO 16 - ALIMENTOS ANIMALES
La alimentación animal se compone principalmente de plantas y materiales
vegetales. El número de materiales adecuados como componentes del pienso suele
estar limitado por la capacidad de los animales para digerirlos. Muchos cereales
tienen un alto contenido energético, pero parte de esa energía puede “inmovilizarse”
en forma de polisacáridos, como celulosa, hemicelulosas, xilanos y -glucanos,
llamados no almidonados, que no pueden ser metabolizados por ciertos animales.
El pastel procedente del prensado de semillas oleaginosas es un ejemplo de
componente de dietas con poco contenido de hidratos de carbono utilizados.
La adición de enzimas a las dietas permite aumentar su digestibilidad y
reducir la carga contaminante producida, debido a la menor excreción de nitrógeno
y fósforo por parte de los animales. Las enzimas sirven para degradar estas fibras
con efectos antinutricionales o para complementar la capacidad de digestión de los
animales, particularmente en sus primeras etapas de desarrollo. Estas enzimas
exógenas pueden derivarse de fuentes microbianas, animales y vegetales, la
mayoría de las cuales provienen de la fermentación de bacterias (Bacillus sp.) Y
hongos (Aspergilus sp.).
Además, las enzimas también se pueden utilizar para aumentar la
disponibilidad de nutrientes, ya que, en un principio, la mala digestibilidad de las
materias primas es el resultado de la insuficiencia de enzimas endógenas (enzimas
en el tracto digestivo) para extraer los nutrientes de los alimentos. La
suplementación de enzimas en las dietas puede mejorar la acción sobre los
ingredientes tradicionales de las enzimas endógenas, mejorando su valor nutricional
y el rendimiento de los animales.
La digestibilidad de un alimento se mide por la capacidad del cuerpo para
digerirlo y se obtiene comparando el alimento ingerido y lo que se excreta en las
heces.
16.1 - SUSTITUTOS DE LA LECHE

Cuanto antes se pueda destetar a un lechón o ternero de la leche materna,
mejor desde el punto de vista del criador, ya que aumenta la posibilidad de que la
madre vuelva a reproducirse.
Las dietas a base de cereales y proteínas vegetales no se utilizan
normalmente como alimento para los lechones, ya que sus tractos digestivos están
adaptados a la leche. Pero la adición de enzimas industriales, como proteasas y
amilasas, permite que estas proteínas sean digeridas, por lo que el productor
porcino puede utilizar una mezcla más económica. En algunos casos, es posible
reemplazar completamente la leche desnatada normalmente utilizada en las dietas
de crecimiento inicial, sin pérdida de rendimiento.
180
16.2 - NUTRICIÓN DE AVES
En la mayoría de los países industrializados, la cría de pollos parece una
operación de cadena de montaje. Las aves se crían en ambientes controlados y su
dieta se selecciona cuidadosamente para optimizar el equilibrio de nutrientes. En el
caso de los pollos, el objetivo es conseguir que alcancen el peso ideal de sacrificio
lo antes posible y al menor coste posible. La vida de un pollo es corta, de 4 a 8
semanas; las gallinas ponedoras tienen una vida más larga, de 12 a 13 meses.
El mayor costo variable de la cría de pollos y ponedoras es el alimento.
Aproximadamente el 65% del pienso está compuesto por cereales. El maíz tiene un
bajo contenido de polisacáridos solubles no almidonados y se considera el cereal
ideal.
En la figura 1, la variación de la energía disponible en los cereales se
observa por el contenido de polisacáridos contenidos en ellos, donde AME
representa la energía aparentemente metabolizable y GE, la energía bruta, y cuanto
más cerca de 1.0 es la relación AME / GE, más energía de se puede utilizar el
cereal.
AME / GE
1.0
arroz
0,9
sorgo maíz
0,8
trigo
triticale
0,7
ce vada
0,6 centen
024681012
o
Polisacáridos (% peso seco)
Figura 1 - Variación de energía disponible en cereales
Las enzimas pueden aumentar las opciones de uso de cereales. La cebada

es un buen ejemplo de esto. Tradicionalmente, los piensos para pollos contenían
como máximo un 10% de cebada. Más que esto causó dos problemas: la tasa de
crecimiento de los pollos se redujo y los excrementos estaban húmedos y
pegajosos y podían propagar infecciones.
Estos efectos negativos se deben a los polisacáridos de alta viscosidad,
llamados -glucanos y arabinosas, ubicados en las paredes celulares del cereal,
que tienen un efecto antinutricional en las aves. Cuando estos componentes están
en forma soluble, aumentan la viscosidad de la ingestión, interfiriendo con la
motilidad y absorción de otros nutrientes y favoreciendo la aparición de heces
húmedas y pegajosas. El pollo no es capaz de digerir estos -glucanos, que forman
una especie de capa alrededor del grano de cebada, impidiendo que el pollo
aproveche el valor nutricional total de los gránulos de almidón y la proteína que
contiene. Sin embargo, añadiendo -glucanasas y celulasas al pienso, es posible
hidrolizar los -glucanos, promoviendo una mejor conversión y asimilación de los
componentes.
181
De hecho, las enzimas industriales hacen su trabajo en los intestinos del
pollo. Mediante esta técnica, es posible sustituir el trigo por cebada como
componente alimenticio, con un ahorro de alrededor del 15% en costos, y el pienso
para pollos puede tener hasta un 70% de cebada hidrolizada en su composición.
Tampoco hay problema con los excrementos pegajosos y la tasa de crecimiento de
los pollos es tan buena como la observada con el uso de dietas a base de trigo.
Con esta técnica se pueden mejorar otros cereales, como el centeno, el
sorgo e incluso el trigo. En el caso de este último, se llevó a cabo un experimento
en Grecia, comparando la dieta del maíz con una dieta que utilizaba trigo duro de
origen local con la adición de xilanasa. La tasa de conversión de la ración de la
dieta a base de trigo (70%) con enzima fue un 7% mejor que la dieta a base de
maíz. En otras palabras, los pollos podrían alcanzar el mismo peso consumiendo un
7% menos de alimento.
Además de la mejor conversión, se observó que una dieta de trigo
complementada con enzimas hace que los pollos sean más sabrosos. Los
rendimientos de carne aumentaron un 1,5% en comparación con la dieta a base de
maíz.
16.3 - NUTRICIÓN DEL CERDO

El sistema digestivo de los lechones de engorde y sacrificio (30-100 kg) está
plenamente desarrollado. La inclusión de enzimas en su pienso sirve principalmente
para asegurar la plena utilización del pienso o para minimizar la inclusión de fósforo.
Las plantas son ricas en fósforo. A pesar de este hecho, es necesario añadir
fosfatos inorgánicos al pienso para evitar que los cerdos sufran deficiencia de
fósforo, ya que no todas las formas de fósforo son digeribles. En la mayoría de las
semillas y granos que ingieren los animales, del 80 al 90% del fósforo total está
ligado al ácido fítico, una molécula con seis grupos fosfato (figura 2).
POLVO3Hdos
O
HdosO3P PO H
O 32
OLVO
O
PO H
HOPO
dos 3 O 32
POLVO3Hdos
Figura 2 - Ácido fítico
Se requieren fitasas para hidrolizar el ácido fítico, pero hay poca o ninguna
fitasa en el tracto digestivo de los animales monogástricos. El resultado es que muy
poco fósforo unido al ácido fítico está biológicamente disponible y pasa sin ser
digerido por los intestinos de los animales monogástricos. Solo alrededor de un
tercio del fósforo total en estos alimentos está disponible para aves y cerdos.
182
Gran parte del fósforo emitido al medio ambiente proviene del estiércol. En la
actualidad, se intenta limitar los efluentes que contienen fósforo y nitrógeno porque
pueden provocar un crecimiento excesivo de algas en los cuerpos de agua. Esta
eutrofización compromete el equilibrio natural, amenazando la vida acuática. La
lixiviación de fósforo de las excretas de aves y otros animales domésticos al agua y
al agua subterránea es un problema grave de contaminación ambiental, que puede
minimizarse con el uso de una enzima fitasa exógena.
Por tanto, el uso de una fitasa microbiana permite hidrolizar el ácido fítico
durante la digestión. De esta forma, se necesita agregar menos o ningún fósforo
inorgánico al alimento, disminuyendo el nivel de fósforo expulsado y disminuyendo
la contaminación ambiental con estos residuos, además de aumentar la
disponibilidad de otros nutrientes, como minerales (calcio, zinc y cobre)., proteínas,
aminoácidos y energía.
Es bueno recordar que el trigo y la cebada, por ejemplo, tienen una alta
actividad de fitasa. Sin embargo, estas fitasas vegetales se destruyen rápidamente
por las altas temperaturas a las que normalmente se someten los procedimientos
de molienda y pastoreo.
16.4 - FACTORES IMPORTANTES EN EL USO DE ENZIMAS

Para un buen uso de las enzimas, su actividad biológica debe sobrevivir a los
rigores de la fabricación y almacenamiento del pienso, resistir el pH bajo y las
enzimas proteolíticas del tracto digestivo. Cuando el alimento es sometido a altas
temperaturas, como por ejemplo en los procesos de peletización y extrusión, puede
ocurrir la desnaturalización de las enzimas, eliminando el beneficio de su inclusión
en la dieta de los animales, por lo que se recomienda que las enzimas sean
rociadas. después de obtener los pellets.
Otros factores que pueden conducir a grandes variaciones en los resultados
obtenidos con el uso de las enzimas son: la forma, la cantidad y el momento de
aplicación de las enzimas; la distribución uniforme en el alimento, el vehículo
utilizado y la composición del complejo enzimático.
Los factores intrínsecos al animal, como la edad, el estado fisiológico, el
estrés y las patologías también pueden afectar en gran medida los resultados de la
adición de enzimas a la dieta. Se debe realizar un mayor número de investigaciones
con ingredientes producidos y utilizados en Brasil, ya que la mayoría de los
resultados disponibles provienen de la literatura internacional, con alimentos
producidos en diferentes condiciones climáticas y edafológicas, que pueden influir
en la composición de nutrientes y de factores antinutricionales.
Ensilaje
El ensilado es una técnica muy antigua de conservación de forrajes, pastos, maíz o
alfalfa, donde se almacena y compacta en silos, realizándose la fermentación láctica a
través de una microflora, que consiste en bacterias aerobias, parcial o totalmente, siendo
una de las más importantes el Lactobacillus plantarum.
183
La adición de enzimas, como celulasas, hemicelulasas, amilasas y proteasas,
promueve la hidrólisis de polisacáridos y proteínas de las células vegetales, y genera los
nutrientes necesarios para los lactobacilos para una fermentación más rápida, y con esto,
el producto ensilado se conserva por más tiempo.
16.5 - REFERENCIAS
― BEAUCHEMIN, KA; RODE, LM; MAEKAWA, M.; MORGAVI, DP; KAMPEN, R.; Evaluación
de una enzima alimenticia polisacaridasa sin almidón en dietas para vacas lecheras. Revista de ciencia
láctea, 83 (3), 543-553, 2000.
― BOROS, D.; MARQUARDT, RR; GUENTER, W.; BRUFAU, J.; Adaptación de los pollitos a dietas
basadas en la molienda de fracciones de centeno que varían en contenido de arabinoxilanos. Ciencia y
tecnología de la alimentación animal, 101, 135-149, 2002.
― CASEY, A.; WALSH, G.; Identificación y caracterización de una fitasa de interés comercial.
Revista de biotecnología110, 313-322, 2004.
― CASTAÑÓN, JIR; FLORES, MP; PETERSSON, D.; Modo de degradación de polisacáridos distintos
del almidón mediante preparaciones de enzimas alimentarias. Ciencia y tecnología de la alimentación
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1996.
― LINDBERG, JE; ARVIDSSON, A.; WANG, J.; Influencia de la variedad de cebada desnuda con
almidón normal, rico en amilosa o rico en amilopectina y suplementos de enzimas sobre la
digestibilidad y el rendimiento de los lechones. Ciencia y tecnología de la alimentación animal, 104,
121-131, 2003.
― MORGAVI, DP; BEAUCHEMIN, KA; NSEREKO, VL; RODE, LM; McALLISTER, TA;
IWAASA, AD; WANG, Y.; YANG, WZ; Resistencia de las enzimas alimentarias a la inactivación
proteolítica por microorganismos del rumen y proteasas gastrointestinales. Revista de ciencia animal,
79, 1621-1630, 2001.
― RAMACHANDRAN, S.; ROOPESH, K.; NAMPOOTHIRI, KM; SZAKACS, G.; PANDEY, A.;
Fermentación de sustrato mixto para la producción de fitasa por Rhizopus sp. utilizando tortas oleaginosas
como sustratos.
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― WALLACE, RJ; WALLACE, SJA; McKAIN, N.; NSEREKO, VL; HARTNELL, GF; Influencia
de enzimas fibrolíticas suplementarias sobre la fermentación de ensilados de maíz y pasto por microorganismos
ruminales mixtos in vitro. Revista de ciencia animal, 79, 1905-1916, 2001.
http://www.animalworld.com.br/
184
CAPÍTULO 17 - ACEITES Y GRASAS
Los lípidos existen en tres formas: aceites (o aceite fijo), grasas y ceras,
definiéndose como ésteres de ácidos grasos y glicerol, en el caso de aceites y
grasas, y ésteres de ácidos grasos y alcoholes de alto peso molecular, como el
alcohol. cetil, en el caso de ceras.
Los ácidos grasos varían en número de insaturación (i) y tamaño de cadena
(n), y se describen generalmente como (n: i), como los ejemplos que se muestran
en la tabla 1.
Tabla 1 - Ejemplos de ácidos grasos
(n: Ácidos (n: i) Ácidos
i)
12: Láurico 18: 2 Linoleico
0
14: Mirístico 18: 3 Linolénico
0
16: Palmítico 20: 0 Arachid
0
16: Palmitoleico 20: 4 Araquidónico
1
18: Esteárico 22: 0 Behenic
0
18: Oleico 22: 1 Erúcico
1
Los aceites son muy heterogéneos, pues además de ácidos grasos y
triglicéridos, existe la presencia de fosfolípidos, esteroles, vitaminas y también
productos de su oxidación. El color y el olor son poco pronunciados, debido a la
ausencia de volatilización, excepto cuando están asociados a carotenoides o
cuando se forman impurezas; su consistencia es semi-viscosa; y la densidad es, en
general, menor que la del agua.
Los aceites vegetales son la mayor fuente de lípidos comestibles y
representan más del 75% del total de grasas consumidas en el mundo. Entre estos,
casi el 75% se extrae del endospermo de semillas oleaginosas, como la soja y la
canola, mientras que el resto se extrae del pericarpio de frutos, como el olivo y la
palma.
La función del aceite en la mayoría de los vegetales superiores es de reserva
de energía primaria en las semillas para ayudar a la germinación y crecimiento
durante el desarrollo de la planta. La presencia de aceite en el pericarpio del fruto
tiene la función de proteger contra la pérdida de agua por la formación de ceras y
contra las lesiones en la superficie del fruto.
Los principales usos económicos en la industria son:
• Petróleo crudo utilizado en la producción de jabón, pinturas, barnices y lubricantes.
• Aceite refinado utilizado en la industria alimentaria como: aceite de maíz, aceite
de girasol, aceite de oliva, aceite de soja, grasa de coco, grasa de cacao.
También existen usos medicinales y cosméticos.
185
17.1 - EXTRACCIÓN DE ACEITE VEGETAL
La producción de aceite consiste, en la mayoría de los casos, en la
separación del aceite de la oleaginosa de su parte sólida, mediante procesos de
prensado y / o extracción por solventes. En el caso de los aceites derivados de
frutas, como es el caso del aceite de oliva, los aceites de palma y coco o el aceite
de maíz, los procedimientos ya son diferentes, variando también entre ellos.
La historia de los aceites vegetales en Brasil estuvo marcada por diferentes
épocas en las que se destacaron diferentes tipos de materias primas:
1- Aceite de algodón - Década de 1950
2- Aceite de maní - Años 60
3- Aceite de soja - De los años 70
17.1.1 - Métodos mecánicos
Hace miles de años el aceite se obtenía mediante métodos mecánicos
caseros, siendo productos de fabricación casera. A principios del siglo XIX se
empezó a obtener mediante prensas hidráulicas, (figura 1), lo que supuso un fuerte
aumento del rendimiento de extracción de aceite.
Figura 1 - Prensa hidraulica
A finales del siglo XIX, los aceites comenzaron a obtenerse por métodos
mecánicos utilizando una prensa continua. En 1904, Anderson construyó el
"expulsor" que todavía se utiliza hoy para extraer aceites vegetales. (Figura 2).
(L (B)
a)
Figura 2 - Prensa continua y expulsor.
186
Así, la metodología adecuada para la extracción de aceites vegetales por
métodos de prensado mecánico es:
• Limpieza y clasificación de semillas;
• Decorticación o filmación, según las características
da semilla, que se utiliza para quitar fibras y cáscaras;
• Molienda, laminación o extrusión, utilizada para reducir el tamaño de grano,
facilitando así la extracción de aceite;
• Cocinar, es decir, hervir el grano en agua por un tiempo adecuado, aplicándose
en el caso del uso de prensas hidráulicas;
• Prensado de granos.
En estos pasos, se consideran algunas variables cuantitativas como
elementos para determinar la eficiencia del método de extracción como: masa de
grano procesado (kg), cantidad de aceite extraído (kg), masa de torta residual (kg) y
contenido de aceite de la muestra, medido a través de la relación entre la masa de
aceite extraído y la masa de grano procesado por lotes.
17.1.2 - Métodos de extracción mixtos

Actualmente se utiliza un método de extracción mixta, que consiste en
prensar la semilla con un "expeller" seguido de un paso de extracción, con solvente
orgánico, del aceite presente en el residuo denominado "pie".
El solvente más utilizado en la industria es el hexano, un derivado del
petróleo, que permite extraer casi todo el aceite dejando un residuo desgrasado
llamado salvado. La recuperación de solventes es el paso más crucial en el
procesamiento de aceite comestible debido a problemas económicos, ambientales y
de seguridad.
Se han investigado varias técnicas en las últimas dos décadas para sustituir
el uso del hexano, entre ellas podemos mencionar:
• Extracción enzimática
• Extracción de CO2 supercrítico
• Reemplazo de hexano con etanol
17.1.3 - Métodos de extracción con aplicación de enzimas

La aplicación de enzimas hidrolíticas en la extracción de aceites vegetales se
analiza desde la década de 1950. En la década de 1970, algunas plantas piloto y
comerciales probaron el proceso enzimático para aumentar el rendimiento de la
extracción de aceite de oliva. Desde entonces, la investigación se ha extendido a
todas las semillas oleaginosas de importancia comercial.
El uso de enzimas en aceites y grasas industriales se encuentra todavía en
una etapa temprana, pero algunas enzimas comerciales están comenzando a
aceptarse.
187
La tecnología enzimática puede aportar muchas soluciones a los problemas
de la industria al minimizar, por ejemplo, los subproductos indeseables. Las
enzimas también pueden ser la clave para la producción de nuevos tipos de aceites
y grasas.
Considerando que la pared celular está compuesta por diferentes
polisacáridos ligados a una proteína estructural, el extracto enzimático debe
contener enzimas con diferentes actividades, como celulasas, hemicelulasas,
pectinasas, amilasas y proteasas.
La aplicación de la tecnología enzimática en la industria petrolera se puede
realizar de dos formas: extracción enzimática combinada y extracción enzimática
acuosa.
17.1.3.1 - Extracción enzimática combinada
En este caso, el extracto enzimático se añade durante la etapa de
maceración, antes del prensado del grano o pulpa, proporcionando una pre-rotura
del tejido celular y aumentando el rendimiento del prensado. Preferiblemente, este
paso debe realizarse a la temperatura máxima de actividad de las enzimas (35 ° C
a 55 ° C).
Los parámetros que influyen en el proceso de extracción combinada son el
tiempo de operación y la concentración del extracto.
Las ventajas de la extracción enzimática combinada son:
• No altera ninguna etapa del procesamiento convencional;
• Aumenta el rendimiento de la etapa de extracción;
• Reduce la viscosidad de la mezcla mejorando el flujo de productos durante la
etapa de separación.
17.1.3.2 - Extracción enzimática acuosa

La materia prima se somete a un preprocesamiento que consiste en diluir y
triturar en caliente para inactivar las enzimas naturales y preparar una emulsión
homogénea. Luego, la mezcla se transfiere a un reactor con control de temperatura
y agitación. La enzima se agrega en este paso y el sustrato se mantiene en
incubación.
Los parámetros que influyen en el proceso de extracción acuosa son la
dilución realizada, el tiempo de operación y la concentración del extracto enzimático
aplicado.
Las ventajas de la extracción enzimática acuosa son:
• Sencillez del recipiente de incubación;
• Permite la separación de material en tanques de decantación;
• Menor impacto ambiental, que cuando se utilizan solventes en la extracción;
• Reducción del consumo de energía en comparación con otros métodos de extracción;
• Permite la instalación de unidades de tamaño medio junto a las áreas de
producción, debido a la mayor simplicidad de las instalaciones.
188
17.1.3.3 - Ejemplos de métodos enzimáticos en la extracción de aceite de semillas oleaginosas
EMBRAPA - Empresa Agrícola Brasileña han venido realizando
investigaciones a lo largo de los años utilizando métodos de extracción enzimática
acuosa de diversas oleaginosas extruidas (algodón, maní, canola, girasol, sésamo y
otras), buscando obtener un mayor aporte a la extracción de estos aceites,
especialmente en lo que se refiere a:
• Introducción de la etapa de extrusión en el pretratamiento del grano, con el
objetivo de facilitar la extracción del aceite.
• Eliminación parcial y / o total del uso de solvente orgánico en el proceso de
extracción.
• Obtención de un aceite de mejor calidad para refinar.
• Obtención de un salvado de mayor valor comercial y un hidrolizado proteico con
buenas cualidades nutricionales.
Tabla 3 - Rendimiento del método enzimático realizado en semillas oleaginosas
Semillas Enzima Actuación (%)
oleaginosas
Palta Pectinasas 90
Maní Celulasa y proteasa 78
Coco Poligalacturonasa, -amilasa y 80
proteasa
Colza Pectinasa 90
Canola Pectinasa, hemicelulasa y celulasa 92
Sésamo Celulasa y pectinasa 74
Germen de Pectinasa 74
trigo
Girasol Celulasa y pectinasa 52
Maíz Celulasa 85
Palma Celulasa y pectinasa 10 - 15 *
Soja Celulasa y proteasa 90
Aceituna Celulasa y pectinasa 5 - 10 *
* Incremento de la eficiencia del proceso de extracción combinada.
Palma
El uso de palma o aceite de palma se remonta a la época de
los egipcios. En África, la palma aceitera aparece en las cuentas de
los primeros visitantes europeos, como parte integrante del paisaje,
las costumbres y la cultura popular, desde el siglo XV. La palma
aceitera fue introducida en el continente americano por la trata de
esclavos, llegando a Brasil en el siglo XVII.
El aceite de palma produce dos tipos de aceites, extraídos por procesos
físicos: presión y calor, sin ningún uso de solventes químicos:
• aceite de palma, conocido como aceite de palma en el mercado internacional,
que se extrae del exterior de la fruta. Este aceite representa en promedio 22-24%
del peso de los racimos. Actualmente se obtienen rendimientos de hasta 8
toneladas de aceite / ha / año en excelentes condiciones de clima y suelo. En las
condiciones de la Amazonía brasileña, se obtienen con frecuencia producciones
de 4 a 5 toneladas de aceite / ha / año.
189
• aceite de semilla de palma, similar al aceite de copra / coco o babasú, se
obtiene de la semilla del fruto. Se utiliza normalmente en la industria de la
cosmética y el jabón fino. Anualmente se producen de 0,4 a 0,6 toneladas de
este aceite, por hectárea de plantación de palma aceitera.
El aceite de palma o de palma contiene 50% de ácidos grasos saturados y
50% de ácidos grasos insaturados. Su producción mundial asciende a 17 millones
de toneladas al año, siendo los mayores productores Malasia con el 50,6% e
Indonesia con el 29,6%.
En Brasil, su producción comenzó en 1982 por el Grupo Agropalma, que
inició sus actividades de producción y extracción de aceite de palma, convirtiéndose
en el mayor productor de aceite de palma de América Latina y el séptimo productor
mundial con 95.000 toneladas / año, dominando todo el ciclo de producción, desde
semilla a aceite refinado, grasas vegetales y margarina. La calidad del aceite de
palma producido es reconocida mundialmente. Para el mercado internacional, el
estándar es un crudo con una acidez de hasta el 5%. El aceite producido por el
Grupo Agropalma tiene una acidez en torno al 2%. El proceso de refinación es
completamente físico y genera una producción de 320 ton / día de aceite refinado.
Además, es el primer aceite vegetal en volumen vendido en el mercado
mundial, gracias a su bajo costo de producción, buena calidad, amplio uso y alta
productividad en áreas de producción, que no compiten con otros cultivos
alimentarios.
El aceite de palma y sus derivados tienen varias aplicaciones en el mercado
de aceites y grasas incluyendo una demanda de 450.000 toneladas de aceite / año,
son: alimentos (80% de las aplicaciones): fritura industrial, aspersión de extruidos,
chocolates, pastas, margarina, cremas de verduras, galletas, helados; y otros (20%
de aplicaciones): cosméticos, detergentes, jabones y jabones, farmacéuticos (fuente
de vitaminas A y E), sustituto del gasoil (biodiesel).
Con los resultados del tratamiento enzimático de la fibra durante el prensado
de los frutos para obtener aceite de palma, es posible observar:
• Tras el tratamiento enzimático del fruto, la fibra resultante del paso de prensado
es menos rica en aceite (alrededor del 35%) que la obtenida en el proceso
convencional;
• La mezcla obtenida después del prensado de la fruta, compuesta por aceite,
agua y fibras, tiene una viscosidad menor que en el procesamiento convencional;
• Aumenta la cantidad de aceite extraído;
• Reducción de la cantidad de agua en el proceso con la consecuente reducción
de efluentes;
• Reducción de temperaturas de 90 a 60 C en las etapas de digestión y prensado
del aceite.
190
Soja
La soja es una leguminosa domesticada por los chinos
desde hace unos 5.000 años. Hace tres mil años, la soja se
extendió por Asia, donde comenzó a utilizarse como alimento.
Fue a principios del siglo XX cuando comenzó a cultivarse
comercialmente en Estados Unidos. Desde entonces, ha habido
un rápido crecimiento en la producción, con el desarrollo de los
primeros cultivares comerciales.
En Brasil, el grano llegó con los primeros inmigrantes
japoneses en 1908, pero fue introducido oficialmente en Río.
Grande do Sul en 1914. Sin embargo, la expansión de la soja en Brasil tuvo lugar
en la década de 1970, con el creciente interés de la industria petrolera y la
demanda del mercado internacional.
En Brasil, el segundo mayor productor de soja del mundo, se producen 27
millones de toneladas de granos al año. El aceite de soja tiene importancia
asociada a su contenido en proteínas, siendo el aceite comestible más consumido
en el mundo. El contenido de aceite en la soja varía del 21 al 23%.
Tradicionalmente, la soja se utiliza para la producción de aceite y salvado
para la alimentación animal, y está presente en diversos productos de la vida diaria
de la población, como la lecitina, que actúa como conservante y se encuentra en la
mayoría de los productos alimenticios; el grano también se utiliza como fuente de
proteínas para alimentos incorporados, como salchichas; y proteína hidrolizada, es
utilizada en cosmética por empresas como Natura. El aceite de soja también puede
tener otras aplicaciones, como la producción de biodiésel, productos para el hogar y
producción de pinturas.
Los resultados obtenidos durante la extracción acuosa de aceite de soja
mostraron la viabilidad de la extracción enzimática de aceite de soja sin la
aplicación de disolventes orgánicos. Los productos resultantes de la hidrólisis son
potencialmente interesantes desde un punto de vista comercial:
• El aceite crudo de color amarillo claro, de baja acidez, de calidad superior al
obtenido con la extracción utilizando hexano como solvente, dispensando
algunos pasos de refinado;
• El extracto insoluble que contiene proteínas, aceites y fibras;
• El hidrolizado de proteínas que se puede utilizar en la preparación de alimentos y
bebidas infantiles para deportistas, ya que contiene proteínas de bajo peso
molecular y fibras solubles, siendo por tanto un alimento nutracéutico.
Coco
El coco es una semilla de una palmera que crece
en la costa de las zonas tropicales. El aceite extraído del
coco es rico en aceites saturados, especialmente ácido
láurico y mirístico y contiene un gran porcentaje de
glicerol.
191
El glicerol es importante para el organismo, porque con él el organismo
produce ácidos grasos saturados o insaturados, según sus necesidades. El glicerol
también es un emulsionante excepcional, por lo que se utiliza en la producción de
cremas y ungüentos. Además de esto, el aceite de coco tiene un mayor "grado de
digestibilidad" que cualquier grasa, incluida la mantequilla, y esto se debe a su alto
porcentaje de glicéridos asimilables (91%). El aceite de coco refinado es muy
apreciado, debido al contenido de ácido láurico que contiene, que reduce la
rancidez, aumenta la facilidad de fusión y la capacidad de formar emulsiones y
espuma estables.
Además, de todos los aceites vegetales para uso industrial, el coco tiene el
índice de saponificación más alto y el índice de yodo y refracción más bajo, lo que
significa que el aceite de coco es excelente para la preparación de ungüentos
cremosos. Por tanto, el aceite de coco se utiliza en:
• Lubricante y combustible;
• Perfumería, en la fabricación de jabones, lociones hidratantes para la piel,
champús y como sustituto de la manteca de cacao;
• Alimentos como sustituto de la manteca de cerdo y el aceite de oliva, y la grasa
de la leche en margarinas, galletas, pasteles, helados y cremas para pasteles.
Los métodos para preparar aceite de coco implican:
• Extracción acuosa convencional - implica la separación del aceite de la leche
de coco fresca, que luego se extrae y se cuela. Este proceso convencional de
extracción acuosa conduce a la recuperación del 30 al 40% del aceite, sin
embargo el aceite obtenido es de calidad inferior debido a la formación de
espuma y la corta vida útil del producto.
• Proceso hidráulico con adición de disolventes químicos..
En este proceso de extracción de aceite de coco, la torta resultante es rica
en 18-25% de proteína y fibra. Sin embargo, debido al proceso de industrialización,
que utiliza altas temperaturas (extracción acuosa), la proteína se desnaturaliza, que
no es apta para uso humano, y se utiliza para alimentar a los rumiantes. El bagazo
resultante de la extracción casera de leche o aceite de coco, al no utilizar el proceso
industrial, se puede utilizar en la elaboración de tortas, panes, etc., ya que es rico
en proteínas y fibras.
La sustitución del proceso industrial de obtención por el proceso enzimático
en medios acuosos conduce a la estabilización de los enlaces lipoproteicos
implicando un mejor aprovechamiento del aceite y producción simultánea de aceite
y proteína hidrolizada en forma de péptidos (pastel).
El diagrama de flujo, figura 3, muestra el procedimiento para la extracción
enzimática del aceite de coco.
192
figura 3 - Pasos de extracción enzimática del aceite de coco
Como resultado de este proceso, se obtiene la fibra resultante prácticamente
desgrasada. Sin embargo, como el contenido de proteína en el aceite obtenido es
alto, significa que la emulsión de lipoproteínas no se desestabilizó totalmente
durante la centrifugación y aún será necesario optimizar los parámetros del proceso
como la dilución y el pH.
Se probaron varios extractos enzimáticos, lo que dio como resultado un
mayor rendimiento de extracción de aceite fue el complejo de celulasas y
hemicelulasas combinado con proteasa, lo que corresponde al 90% de rendimiento,
con una diferencia significativa en el rendimiento del proceso dependiendo del
extracto de enzima utilizado.
Pupunha, Pequi y Tucumã
Figura 4 - Pupunha, pequi y tucumã, respectivamente.
El melocotonero, el pequi y el tucumã son frutas típicamente brasileñas de la

región norte-noreste, muy ricas en proteínas y cuyo aceite es rico en vitaminas.
Los experimentos realizados con extracción enzimática acuosa con pupunha
y pequi alcanzaron altos rendimientos y mostraron la viabilidad técnica de aplicar
esta tecnología en la obtención de aceites de frutas exóticas con pulpa oleaginosa
que se encuentran en el nor-noreste de Brasil, especialmente en la Amazonía.
193
También se ha realizado una amplia investigación con tucumã con extracción
enzimática, ya que esta fruta tiene un valor energético excepcional, además de un
alto contenido en vitaminas: cada 100 g de pulpa contiene 31000
         ()       
       −     
       
El aceite de Tucumã tiene características organolépticas que potencian su
uso en la industria alimentaria, pudiendo utilizarse como mezcla de aceite de oliva,
debido a la similitud de sus composiciones, como se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3 - Perfil de ácidos grasos de algunas semillas y frutos oleaginosos
Palma
% Ácidos grasos Soja Tucumã Aceitun Maíz
(Aceite
a
de
palma)
12: láurico 4.34 ---------- ---------- ---------- 1.04
0
14: mirístico 4.34 ---------- 0,67 0,1 - 1,7 1,33
0
16: palmítico 11 - 11,2 5.31 10 - 11,7 7,8 - 13 40,9 - 44
0
18: esteárico 2,41 9.13 2.15 2.5 - 3.6 4.28
0
20: araquidico ---------- 0,30 0,48 ---------- 0,47
0
16: palmitoleico ---------- 0,14 1,45 1,2 - 1,6 1,26
1
18: oleico 20,4 - 22 71.21 73,8 -78 30,1 - 48,8 40 - 42
1
18: linoleico 50,5 - 53 11.55 7 - 9,8 34 - 56,3 8,7 - 10
2
18: linolénico 6,9 - 8 1,30 ---------- ---------- 0,09
3
En la extracción de aceite de tucumã se probó un complejo enzimático

comercial que contiene poligalacturonasa (1547,6 U / ml) y celulasa (8,2 U / ml). En
la prueba se estudiaron los parámetros:
• concentración enzimática (0 a 0,5%),
• relación pulpa / agua (1: 1, 1: 2, 1: 3),
• rendimiento (g de aceite extraído / g de aceite teórico en la pulpa)
• tiempo de exposición (30, 60 y 90 minutos).
El diagrama de flujo, que se muestra en la figura 5, muestra los pasos de
extracción.
194
Figura 5 - Etapas de extracción enzimática del aceite de tucumã
195
Como resultado de la relación de dilución 1: 1 de tucumã, la extracción de
aceite fue proporcional al aumento en la concentración de enzima utilizada,
obteniendo un rendimiento máximo del 45% de la concentración de 0.5% (v / p).
Teórico, independiente del tiempo de reacción.
A las proporciones de dilución 1: 2, las tres concentraciones de enzima
empleadas (0.1, 0.3 y 0.5%) resultaron en extracciones crecientes con el tiempo de
reacción, donde el rendimiento máximo alcanzado fue 0.1% (v / p) de enzima con
90 minutos de incubación. .
En la relación 1: 3, los mejores resultados se lograron con 0.05% (v / p) de
enzima, en los períodos de 60 y 90 minutos.
Palta
Brasil es el segundo productor de aguacate del mundo
(500 millones / año), con un contenido de 20 a 25% de aceite,
utilizado en la industria de la perfumería.
Entre algunas de sus características, el aceite de aguacate
tiene en su composición vitaminas (complejo de vitaminas A y B,
vitaminas E y C - potentes antioxidantes que
ayudan a promover la salud de los dientes y las encías y protegen los tejidos
corporales del daño oxidativo). La mayor parte de la grasa del aguacate es
monoinsaturada, un tipo de grasa que no permite que los niveles de colesterol
aumenten en la sangre.
El uso de enzimas pectinolíticas en la extracción acuosa de aceite de
aguacate proporcionó:
• Incremento del rendimiento del proceso acuoso del 60% al 90%.
• Reducción de enzimas unas 20 veces
• Reducción de la viscosidad de la emulsión
• Reducción de la cantidad de agua de 5: 1 a 1: 1
• Mejor separación de las fases resultantes de la hidrólisis.
• Obtención de un aceite de mejor calidad que el obtenido por el proceso
convencional (secado y extracción del disolvente orgánico).
CONCLUSIONES SOBRE EL USO DE ENZIMAS PARA LA EXTRACCIÓN DE ACEITES

VEGETALES
• La aplicación de enzimas para extraer aceite de pulpa de frutas es técnica y
económicamente factible ya que la concentración de enzimas empleadas en el
proceso es igual o menor al 0,1% (p / v).
• En el caso de algunas semillas oleaginosas, la extracción enzimática acuosa
requiere, en la mayoría de los casos, una concentración muy alta de enzimas
(superior al 1% (p / v)) lo que compromete la viabilidad económica del proceso.
El costo de las enzimas, en algunos casos, es incluso mayor que el precio de la
materia prima.
196
• El alto costo de las enzimas hidrolíticas ha sido el principal obstáculo para su
aplicación en la obtención de aceites vegetales con fines comestibles. La
producción en Brasil de enzimas específicas para la extracción de aceites
vegetales puede habilitar la tecnología enzimática en este segmento tan
importante de la industria nacional.
• En algunos casos, dependiendo de la aplicación y valor comercial del aceite, es
ventajoso y factible aplicar el proceso de extracción enzimática (aceites usados
en cosméticos y medicamentos).
17.2 - REFINACIÓN DE PETRÓLEO
En la etapa de neutralización en el refino de aceites vegetales, se utiliza sosa
cáustica, resultando en 966 kg de aceite refinado por cada 1000 kg de aceite de
soja crudo. Alternativamente se puede refinar la misma cantidad de aceite crudo
mediante un proceso enzimático con un rendimiento de 978 Kg de aceite,
aumentando 12 Kg (1.2%) en el rendimiento de refinado, donde se realiza una
reacción de esterificación entre los ácidos grasos libres y el glicerol, que se agrega
junto con una lipasa. Esto para una escala de refinería que procesa toneladas de
petróleo por día sería altamente rentable.
La etapa de desgomado en el refino de petróleo tiene como objetivo principal
eliminar las impurezas, especialmente el contenido de fósforo, lo que reduce la
estabilidad del aceite en condiciones de almacenamiento. En este paso se utilizan
enzimas fosfolipasas que convierten los fosfolípidos hidratables y no hidratables en
lisofosfolípidos. El aceite de soja crudo con tampón de ácido cítrico / hidróxido de
sodio se mezcla con agua y enzimas por un período de 6 horas a 75 - 85 C, para
formar una emulsión en la que los lisofosfolípidos serán removidos por
centrifugación, obteniendo el aceite libre de fósforo. . De esta forma, el aceite tendrá
un contenido de fósforo entre 0 y 2 ppm (el contenido de fósforo en el aceite debe
ser inferior a 2 ppm), mientras que en el proceso de refinado químico se obtienen
de 2 a 5 ppm de fósforo.
Otra ventaja de utilizar este método es que permite la recuperación de los
denominados ácidos grasos utilizados en la alimentación animal o en algunos
alimentos, lo que no ocurre en el refinado con disolventes químicos, ya que una
gran cantidad de ácidos grasos libres son eliminados por un tratamiento inicial, que
utiliza grandes cantidades de hidróxido de sodio.
Así, el proceso de refinado enzimático garantiza menores pérdidas de aceite
con mayores rendimientos.
17.3 - MODIFICACIÓN DE ACEITES Y GRASAS

La gama de aplicaciones de la lipasa en la industria oleoquímica es enorme.
La aplicación de estas enzimas como biocatalizadores de proceso proporciona una
reducción en los costos de energía y minimiza la degradación térmica de los
productos, en comparación con las rutas químicas tradicionales. La hidrólisis
química de aceites y grasas utiliza presiones y temperaturas extremadamente altas.
El proceso es muy eficiente (conversiones de alrededor del 96%). El inconveniente
de este proceso es que las altas temperaturas empleadas provocan una pérdida de
calidad y rendimiento del producto. Además, existe la formación de subproductos
197
oscuros que posteriormente deben eliminarse.
198
Algunas grandes empresas han explorado la posibilidad de utilizar estos
biocatalizadores en la modificación de aceites y grasas como alternativa para
obtener productos de gran valor económico. Como ejemplos de biomodificaciones
de aceites y grasas, utilizando lipasas, podemos mencionar:
• Síntesis de aceites ricos en ácidos grasos insaturados, de gran valor para la
industria alimentaria.
• Producción de alcoholes grasos utilizados como emulsionantes por la industria
alimentaria.
• Interesterificación de mezclas de triacilgliceroles, utilizando 1,3 lipasas
regioespecíficas, para obtener aceites con puntos de fusión deseables para la
industria de la margarina.
• Modificación de las propiedades de los aceites y grasas naturales con el objetivo
de la síntesis de grasas y aceites con el mayor grado de insaturación posible.
Las lipasas se utilizan para modificar las grasas convirtiendo los ésteres en
ácidos grasos en el aceite de palma; mejorando el aroma del producto.
Además de las lipasas, las lecitinasas transforman la lecitina de la leche en
polvo en lisolecitina, reduciendo el contenido de humedad del producto, lo que es
muy favorable en este caso.
17.3.1 - Catálisis de lipasa

Las lipasas son enzimas (triacilglicerol acilhidrolasas) que catalizan
reversiblemente la hidrólisis de triacilgliceroles en condiciones naturales. A este
respecto, se diferencian de otras esterasas, ya que actúan de forma única sobre
sustratos insolubles en agua en la interfaz aceite-agua o agua-aceite de las
soluciones emulsionadas. Las lipasas son enzimas extremadamente versátiles que
pueden catalizar la transesterificación y la síntesis estereoespecífica de ésteres en
una gran cantidad de sustratos. Siempre con un rendimiento muy específico,
también actúan según el tipo de sustrato, tamaño de la cadena de ácidos grasos,
posición del ácido graso en el glicerol, etc. Se pueden obtener a gran escala de
diversas fuentes, pero las más utilizadas industrialmente son las extraídas del
páncreas del cerdo y por fermentación microbiana.
La literatura describe una serie de lipasas de Aspergillus niger o A. oryzae
con diferentes especificidades de ácidos grasos. Algunos actúan preferentemente
sobre ácidos grasos de cadena corta como la grasa de coco y otros sobre ácidos
grasos poliinsaturados de cadena media, como es el caso de la lipasa de
Geotrichum candidum y Candida lindracea, que actúan preferentemente sobre
aceite de oliva, rico en ácido oleico, con tasas de conversión del 48 al 93% a un pH
entre 4,5 y 6,5.
También existen lipasas regioselectivas, con acción hidrolítica y / o catalítica
específica de las posiciones 1,3 del glicerol y generalmente actúan entre pH 5,0 -
7,0, de 30 a 45oC. Las lipasas más conocidas con esta propiedad son Rhizopus
arrhizus, R. javanicus, R. niveus y R. delamar. La literatura también describe lipasas
de Mucor sp. como específico para la síntesis en las posiciones 1,3 del glicerol a
través de la reacción de transesterificación.
199
La molécula de lipasa forma un complejo con la molécula de lípidos; si hay
un exceso de agua en el sistema, parte del ácido graso recibe la molécula de agua
y se libera. Este proceso se denomina hidrólisis, que puede ser parcial o completa,
según el tipo de lipasa y las condiciones de reacción. Por otro lado, si hay un
exceso de ácidos grasos con una cantidad limitada de agua, parte de estos ácidos
proporcionará intercambio con otros ácidos (interesterificación).
Dado que la reacción de hidrólisis es una reacción de equilibrio, las lipasas
tendrán una acción hidrolítica o esterificante dependiendo de las condiciones de
reacción.
17.3.2 - Interesterificación
Las propiedades de una grasa dependen de los ácidos grasos que contiene y
su valor comercial se basa en la estructura de estos ácidos. Tradicionalmente, los
mejoradores de aceites y grasas han modificado la estructura de los ácidos grasos
en sus materias primas, mezclando diferentes combinaciones de triglicéridos,
mediante la modificación química (como la hidrogenación) de los ácidos grasos
correspondientes, o mediante una reorganización de los ácidos grasos en la
estructura glicerídica de grasa - un proceso llamado interesterificación, que
predomina cuando la concentración de agua en el medio de reacción disminuye.
Se pueden usar catalizadores enzimáticos específicos para la
interesterificación. En comparación con otros agentes catalíticos que no distinguen
entre las posiciones 1, 2 o 3 en la molécula de triglicéridos, ciertas enzimas pueden
seleccionar algunos ácidos grasos y dejar otros intactos. Utilizando una iipasa 1, 3
específica, es posible incorporar un determinado ácido graso en las posiciones
terminales de la estructura de triglicéridos sin modificar el residuo presente en la
posición central.
Otro ejemplo de modificación es la sustitución de las grasas de la manteca
de cacao, utilizada en la producción de chocolate, por aceite de palma
interesterificado enzimáticamente con ácido esteárico, ya que la manteca de cacao
tiene variaciones en la oferta, generando fluctuaciones en los precios, y el aceite de
palma tiene una oferta abundante. de bajo costo y se puede utilizar en diversas
aplicaciones.
En la producción de margarina, el punto de fusión, el esparcimiento y la vida
útil o las propiedades nutricionales de un aceite o grasa natural pueden modificarse
mediante reacciones enzimáticas de interesterificación.
17.3.3 - Síntesis de ésteres

Tradicionalmente, la producción de ésteres grasos se ha realizado mediante
catálisis química. En ciertos casos, se producen efectos secundarios que se
consideran indeseables, ya sea por el bajo rendimiento del producto o por la
naturaleza ofensiva de los subproductos.
Las enzimas tienen la ventaja de promover la catálisis en condiciones
suaves. Esto es especialmente importante porque tales condiciones minimizan las
reacciones secundarias y la formación resultante de subproductos, como se ve en
la figura 6.
200
Figura 6 - Síntesis de triglicéridos
Además de utilizarse en la producción de esencias y fragancias, los ésteres
también se utilizan como tensioactivos en productos cosméticos, como humectantes
y champús. En el caso de estos productos finales, la pureza es de vital importancia.
La especificidad de la reacción de la enzima lipasa produce ésteres prácticamente
sin subproductos no deseados.
17.3.4 - Producción de lisolecitina

La lecitina es un subproducto del refinamiento de semillas oleaginosas, que
se puede utilizar como emulsionante. Se utiliza una fosfolipasa para producir
lisolecitina, que tiene mejores propiedades emulsionantes que la lecitina normal. La
lisolecitina se utiliza en la producción de margarina y cosméticos.
El uso de enzimas en aceites y grasas industriales se encuentra todavía en
una etapa temprana, pero algunas enzimas comerciales están comenzando a
aceptarse. La tecnología enzimática puede aportar muchas soluciones a los
problemas de la industria al minimizar, por ejemplo, los subproductos indeseables.
Las enzimas también pueden ser la clave para la producción de nuevos tipos de
aceites y grasas.
Biodiesel
El biodiésel se genera mediante una reacción de transesterificación entre un
triglicérido o un ácido graso y un alcohol, que suele ser metanol o etanol, y puede ser
catalizado por vías ácidas, alcalinas o enzimáticas.
La catálisis ácida utiliza catalizadores sólidos de zirconia, tungsteno y alúmina o
ácidos sulfúrico y sulfónico, y genera altos rendimientos de biodiésel, pero con tiempos
de reacción más largos que la catálisis alcalina, que utiliza hidróxido de sodio o potasio
como catalizadores.
El costo de las enzimas y el tiempo de reacción aún hacen inviable la producción
de biodiésel a través de lipasas, pero se están realizando más estudios para optimizar las
condiciones de reacción.
17.4 - REFERENCIAS
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http://www.manaus.am.gov.br/secretarias/fundacaoMunicipalDeTurismo/rgcomidasderua.html
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http://www.tinytechindia.com/oil.htm
http://www.wegmans.com/kitchen/ingredients/produce/fruit/coconut.asp
203
CAPÍTULO 18 - ENZIMAS EN ANÁLISIS
18.1 - ANALISIS CLINICO

En la medicina moderna, el análisis de diferentes muestras fisiológicas tiene
un papel clave, siendo el uso de enzimas (tanto libres como inmovilizadas) un factor
relevante para la especificidad y precisión de los análisis. Los métodos químicos
convencionales son difíciles de usar para determinar muchos compuestos
fisiológicos debido a su falta de sensibilidad, selectividad o dificultad de operación.
Por otro lado, algunos compuestos, como las hormonas, se encuentran en
concentraciones muy bajas (10-12 mol / L), que no son medibles por ningún método
que permita medir una característica física o química.
Los tipos de aplicación de enzimas en el análisis se pueden dividir en dos
grandes grupos: el primero de ellos abarca métodos que miden directamente un
compuesto, mientras que el segundo emplea aquellos que usan una enzima para
amplificar otra respuesta (por ejemplo, inmunoensayos con enzimas acopladas) . La
tabla 1 muestra algunos ejemplos de enzimas utilizadas en el diagnóstico.
Tabla 1 - Enzimas utilizadas para el diagnóstico

Enzima Fuente Sustrato Medido
Alcohol Levadura Deshidrogenasa Etanol, alcoholes y aldehídos Colesterol
Colesterol (colesterol)
Esterasa de hígado Triglicéridos de cerdo
Glucosa 6- Glucosa de levadura
fosfato
deshidrogenasa
Glucosa Oxidasa Glucosa Fungica
Glicerol deshidrogenasa Bacteriana Glicerol Hexoquinasa Levadura ATP,
glucosa
Nitrato ReductasaFúngicoNitrato
Ureato Oxidasa Bacteriana
Ureatos Ureasa Frijoles De Cerdo (Frijol
Jack)Urea
18.1.1 - Análisis directo de metabolitos

La especificidad de las enzimas las convierte en herramientas ideales para el
análisis de un solo compuesto contenido en un fluido fisiológico complejo. Los
ensayos enzimáticos más importantes son los que se aplican al análisis de glucosa
y colesterol. Ambos compuestos son difíciles de medir utilizando métodos químicos
tradicionales en fluidos biológicos, como la sangre.
La determinación cuantitativa de glucosa se realiza utilizando glucosa
oxidasa (obtenida de Aspergillus niger) y peroxidasa de rábano picante (Raphanus
sativus var. Acanthiformis). La glucosa oxidasa es casi completamente específica
para la D-glucosa en los fluidos fisiológicos. La reacción catalizada por glucosa
oxidasa emplea la
193
D-glucosa + H2O + O2 glucosa oxidasa H2O2 + D-
gluconolactona
oxígeno molecular para oxidar la D-glucosa, dando lugar a la producción de
peróxido de hidrógeno, como se ve en la reacción a continuación.
El peróxido de hidrógeno liberado se determina posteriormente mediante la
acción combinada de la enzima peroxidasa y un tinte redox apropiado,
espectrofotométricamente siguiendo la formación del producto coloreado (reacción
a continuación).
H2O2 + colorante reducido (incoloro) peroxidasa tinte oxidado (coloreado) + H2O + ½

O2
La medición del colesterol libre se realiza mediante un método similar al

descrito para la glucosa. La colesterol oxidasa (obtenida de Niocardia sp.) Se utiliza
para oxidar el colesterol y dar lugar al peróxido de hidrógeno, que se determina
mediante el mismo método indicado anteriormente.
colesterol + H2O + O2 colesterol oxidasa H2O2 + colest-4-en-3-uno
Cuando se desee cuantificar el colesterol total y esterificado, se puede

someter previamente a la muestra la acción de la enzima colesterol esterasa:
éster de colesterol colesterol esterasa colesterol + ácido graso
Los métodos basados en el uso de enzimas están disponibles

comercialmente en forma de kits, adaptándose a sistemas con autoanalizador.
18.1.2 - Ensayos indirectos acoplados a enzimas

Actualmente, la introducción de técnicas inmunológicas ha revolucionado los
métodos utilizados para la determinación de muchos compuestos de interés médico
y farmacéutico. La notable especificidad que representa la reacción antígeno-
anticuerpo se proporciona para el desarrollo de métodos analíticos sensibles y
precisos. Para mejorar el método de ensayo, es necesario modificar la molécula de
anticuerpo para que sea posible cuantificar la unión de este al antígeno. Una forma
de lograr este objetivo es marcar los anticuerpos con yodo (emisor de radiación y
) y medir la radiactividad incorporada. Esta técnica (radioinmunoensayo), aunque
bastante eficaz, requiere equipos de medición costosos y la adopción de estrictas
medidas de seguridad.
Un avance reciente consiste en unir covalentemente el anticuerpo a una
enzima hidrolítica y utilizar la reacción catalizada para cuantificar el sistema. Dado
que la enzima es un catalizador, su presencia amplifica el efecto y esto permite
desarrollar pruebas sensibles, seguras y sencillas. Por razones técnicas, es más
ventajoso acoplar la enzima con un segundo anticuerpo específico de especie y
utilizar un sistema de ensayo multicapa (sándwich).
Convencionalmente, el sistema de ensayo inmunoabsorbente enzimático
acoplado (ELISA) utiliza enzimas que tienen sustratos cromogénicos (peroxidasa,
fosfatasa alcalina, -galactosidasa, luciferasa y ureasa) y mide la
194
desarrollo de la reacción mediante una técnica espectrofotométrica, y
Es descrito en la figura 1.
Antígeno
Anticuerp
o
Enzima
Sustrato
Product
o
Figura 1 - Método ELISA
Una idea reciente es utilizar ureasa acoplada al anticuerpo; en este sistema

la hidrólisis de la urea produce un cambio en el valor de pH (forma NH3 y CO2) que
se puede monitorear con la ayuda de un indicador apropiado.
Aunque se trata de un método analítico relativamente nuevo, su uso ha
tenido tanto éxito que todos los laboratorios de análisis y bioquímica confían en esta
técnica. La versatilidad del sistema es prácticamente ilimitada debido a la existencia
de un número casi infinito de posibles interacciones antígeno-anticuerpo.
18.2 - ANÁLISIS DE ALIMENTOS

El uso de la actividad catalítica enzimática para la determinación analítica se
remonta a mediados del siglo XIX. Sin embargo, el uso de enzimas para el análisis
de alimentos en la forma actual se estableció hace solo 20-25 años. Los factores
responsables de este desarrollo son la preparación a gran escala de enzimas puras,
la disponibilidad de fotómetros adecuados y económicos y el desarrollo de
procedimientos enzimáticos y métodos de preparación de muestras.
En la investigación alimentaria, se determinan las cantidades de varios
componentes alimentarios y se controlan los cambios que se producen durante el
procesamiento tecnológico y el almacenamiento posterior. Debido a la alta
especificidad que presentan las enzimas, se utilizan métodos enzimáticos para
estos fines.
En la industria se verifican las materias primas, se realiza el control del
proceso y se analizan tanto los productos finales como los de la competencia. Tú
195
Los métodos enzimáticos fueron fácilmente aceptados por las industrias debido a
las facilidades inherentes a los métodos de análisis altamente específicos, fáciles y
rápidos.
Las inspecciones oficiales implican el análisis regular de muestras y el
cumplimiento de las normativas legales. En estos casos se utilizan métodos
enzimáticos debido a la gran flexibilidad y aplicabilidad a diferentes tipos de
muestras.
Carbohidratos
Se determinan de forma rutinaria en el análisis de alimentos. Los azúcares
constituyen una gran parte del valor calórico de los alimentos. La presencia de
lactosa, por ejemplo, indica el uso de leche. El almidón, por otro lado, sirve como
agente de aumento en los productos cárnicos y como agente espesante.
La glucosa, fructosa y sacarosa se determinan en productos vegetales y
derivados de frutas (vinos, zumos, mermeladas, puré de tomate, etc.), en galletas y
panes, helados, productos dietéticos y bebidas. A continuación, se muestra un
ejemplo de determinación de fructosa por reacción enzimática acoplada.
fructosa + ATPhexokinaseADP + fructosa-6P
fructosa-6Pglucosa fosfato
isomerasa glucosa-6P
glucosa-6P + NADP + glucosa-6P deshidrogenasa gluconato-6P + NADPH +
La galactosa se determina en los productos lácteos (yogur y queso), mientras

que la lactosa también se mide en galletas, panes, alimentos para bebés, helados,
chocolate, salchichas y salchichas.
Ácidos orgánicos
Estos compuestos y sus sales a menudo aparecen en el metabolismo
microbiano y su presencia en los alimentos tiene un efecto considerable sobre el
sabor y puede indicar la aparición de un proceso de fermentación.
El acetato se determina en vinos, productos vegetales y de frutas, quesos y
vinagre. El ácido ascórbico se utiliza como aditivo en la industria alimentaria
(vitamina) y se detecta en productos vegetales, carne, leche, cerveza y vino.
El ácido aspártico se estima principalmente en los jugos de manzana. Otros
ácidos analizados enzimáticamente son: cítrico, fórmico, glucónico, glutámico,
butírico, isocítrico, láctico, málico, oxálico, succínico y pirúvico (reacción a
continuación).
piruvato + NADH + lactato lactato de deshidrogenasa NAD +
Alcohol
Las enzimas se utilizan en la determinación analítica de etanol (índice de
calidad en bebidas alcohólicas, indica la presencia de levaduras y el uso de
materiales en mal estado en productos derivados de frutas), como se muestra en la
reacción a continuación; glicerol
e
t
anol + NAD + acetaldehído deshidrogenasaacetaldehído +
NADH + 196
(determina la adulteración en los vinos; las cervezas y los mazapanes también se
analizan para este compuesto); sorbitol y xilitol (alimentos dietéticos, galletas,
chicle, helado).
Otros compuestos analizados en alimentos:

• Colesterol - esteroide importante con varias funciones metabólicas; el depósito
excesivo en los tejidos vasculares provoca arteriosclerosis. Se utiliza como
indicador del contenido de huevo en los alimentos.
• Triglicéridos - son lípidos que contienen glicerol; deben hidrolizarse con
esterasas o lipasas para proporcionar ácidos grasos y glicerol.
• Acetaldehído - sustancia aromática en cervezas, yogures y puede estar ligada al
SO2 en los vinos.
• Urea - analizado en carne y productos lácteos (sirve como índice de proteínas en
la dieta de la vaca); su contenido de agua de la piscina indica la concentración de
orina.
• Nitrato - precursor de nitritos y nitrosaminas, considerado peligroso; los
fertilizantes son básicamente los responsables del nitrato presente en los
alimentos y también deben analizarse, así como el agua, la cerveza, la carne, la
leche, las frutas, las verduras y los alimentos para bebés.
Nitrato + NADPH + nitrato redutasenitrito + NADP +
• Sulfito, creatina, creatinina y lecitina son compuestos también analizados en la

industria alimentaria.
Enzimología clínica
En la enzimología clínica lo que se busca es, a través de la medición de las
actividades enzimáticas de los fluidos biológicos, diagnosticar cualquier alteración
fisiológica provocada por posibles enfermedades ligadas a determinados órganos. Como
ejemplos:
• Amilasas: un aumento en los niveles normales de suero u orina puede indicar
pancreatitis aguda, carcinoma de páncreas o úlcera perforada; y una disminución
puede indicar mongol o neumonía.
• Fosfatasa ácida: un nivel alto puede indicar cáncer de próstata;
• Fosfatasa alcalina: en este caso, puede indicar raquitismo y osteomalacia.
• Lactato deshidrogenasa: en niveles altos puede indicar infarto de miocardio y
distrofia muscular.
• Aminotranferasa: puede indicar infección por hepatitis
18.3 - REFERENCIAS
197
― FANJUL-BOLADO, P.; GONZÁLEZ-GARCÍA, MB; COSTA-GARCÍA, A.; Detección de leucoíndigo
en ensayos basados en fosfatasa alcalina y peroxidasa utilizando fosfato de 3-indoxilo como sustrato.
Analytica Chimica Acta. 534, 231-238, 2005.
1990.
1996.
― GOLDBERG, DM; Enzimología clínica: una historia autobiográfica. Clínica Chimica Acta, 357, 93-
112, 2005.
― REED, G.; NAGODAWITHANA, TW; Biotecnología: un tratado completo de varios volúmenes; Vol.
9: Enzimas, biomasa, alimentos y piensos, 2a ed., VCH, Weinheim, 1995.
― ZHENG, Z.; HUMPHREY, CW; REY, RS; RICHARD, JL; Validación de un kit de prueba ELISA
para la detección de aflatoxinas totales en cereales y productos de cereales en comparación con HPLC.
Micopatología, 159, 255-263, 2005.
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/E/Elisa.html
198
CAPÍTULO 19 - PRODUCCIÓN DE DETERGENTES
El uso de enzimas en detergentes se origina, en 1914, cuando Röhm produjo
el primer detergente compacto (en tabletas), llamado Burnus (figura 1), que utilizaba
proteasas del páncreas de cerdo. Sin embargo, fue solo en la década de 1960 que
el uso de enzimas se volvió efectivo.
Figura 1 - Detergente Burnus
Desafortunadamente, las amas de casa alemanas estaban acostumbradas a

los jabones en polvo potentes que formaban mucha espuma, por lo que miraron con
sospecha las tabletas, sin creer que una tableta pequeña pudiera funcionar. Rohm
se vio obligado a reformular el producto como detergente en polvo y venderlo en
cajas de 50 g.
Para la mayoría de las personas, esta es la aplicación más conocida de
enzimas en la fabricación de agentes de lavado enzimáticos (detergentes
"biológicos"). Hay dos razones principales para esto: primero, desde mediados de la
década de 1960, el uso de enzimas (al principio con alcalasa - proteasa) en
detergentes ha sido una de las aplicaciones más importantes de las enzimas; en
segundo lugar, los consumidores de detergente son usuarios de un producto
enzimático.
En la gran mayoría de las aplicaciones, las enzimas se utilizan como agentes
auxiliares en algún momento del proceso de fabricación y, por regla general, las
enzimas se encuentran en el producto final en su forma inactiva. Cuando se trata de
detergentes, entran en la categoría de enzimas que no se activan durante el
proceso industrial, actuando únicamente cuando el producto llega al consumidor
final.
Los detergentes industriales a los que se añaden enzimas se pueden dividir
en 3 categorías:
 Detergentes para lavar ropa en casa.
 Detergentes para uso en el lavado de
ropa industrial e institucional
 Detergentes utilizados para lavar
platos y cubiertos en los hogares.
199
El uso de detergentes para ropa en los hogares es, con mucho, el segmento
más importante de los tres y ronda los 13.000 millones de toneladas anuales. En
países como EE.UU., Europa y Japón, el uso de detergentes que contienen
enzimas ya alcanza el 90% del total vendido.
A principios de la década de 1970, la aparición de procesos alérgicos en
trabajadores durante el manejo de preparados enzimáticos en la fabricación de
detergentes, provocó una disminución en el crecimiento del uso de enzimas en sus
formulaciones. Las medidas de seguridad que se incorporaron en la manipulación,
combinadas con nuevas formulaciones de enzimas como las formas recubiertas
(dragadas), llevaron a que se reanudara la aplicación de enzimas en los
detergentes, y en 1985, el 70% de los detergentes para ropa de uso doméstico, en
Europa, comenzó a contener enzimas en sus fórmulas.
Como las enzimas son parte de una formulación detergente compleja que
incluye tensioactivos (no iónicos y / o aniónicos), fosfatos, alcalinizantes (de NaOH
a NaCO3 y otros), otras sales, perfumes y pigmentos, estos catalizadores deben
actuar en condiciones generalmente drásticas. del medio de reacción (pH elevado,
presencia de tensioactivo y, en general, temperaturas elevadas).
Los detergentes líquidos están en pleno crecimiento en el mercado, debido a
su practicidad y fácil incorporación de tensioactivos y otros componentes en el
agua. Sin embargo, el uso de enzimas en estas formulaciones está restringido
debido a la alta actividad del agua que afecta la estabilidad de las enzimas; esto
plantea un nuevo reto para los fabricantes de enzimas detergentes: su
incorporación a formulaciones líquidas, para su uso en prelavado o "manchado", sin
perjuicio de la actividad y estabilidad.
El primer detergente con enzimas, comercializado en Brasil, fue Organon en
1968. Poco después apareció Biopresto de Unilever. Entre 1978 y 1984 Henkel
comercializó Viva. A partir de 1989, Gessy Lever lanzó Omo que contiene enzimas
y actualmente es el líder del mercado que anima a otras industrias a lanzar también
productos con enzimas. Una limitación de estos productos es la temperatura del
agua de lavado, que en Brasil suele estar a temperatura ambiente (a 25 ° C). Como
estas enzimas tienen una temperatura óptima de acción entre 40 y 50 ° C, se
recomienda cuando se trabaja a temperaturas más bajas, para dejar un mayor
tiempo de remojo.
19.1 - TIPOS DE ENZIMAS UTILIZADAS EN DETERGENTES
19.1.1 - Proteasas
Las proteasas son las enzimas más utilizadas en la industria de los
detergentes. Eliminan las manchas de proteínas como las que dejan la hierba, la
sangre, los huevos y el sudor humano. De hecho, son capaces de hidrolizar
parcialmente las proteínas, aumentando su solubilidad en agua.
La gran mayoría de las proteasas comerciales son producidas actualmente
por especies del género Bacillus sp en procesos de fermentación sumergidos.
200
En el mercado se comercializan con nombres de fantasía como: savinase,
alcalasa, nueva subtilisina, entre otros.
Figura 2 - Primeros detergentes que contienen alcalasa
Los pequeños fabricantes de jabón en Suiza y los Países Bajos fueron

pioneros en el uso comercial de alcalasa (Figura 2). En 1963, la empresa holandesa
Kortmann & Schulte comercializó Biotex con alcalasa. Los grandes fabricantes de
jabón (Procter & Gamble, Unilever, Colgate y Henkel) comenzaron a usar alcalasa
entre 1965-1966.
En 1959, Gebrüder Schnyder AG vendió el primer detergente en polvo con la
proteasa producida a partir de una cepa de Bacillus sp bajo el nombre de Bio
40. Schweizerische Ferment AG de Basel suministró proteasa. Novozymes compró
esta empresa en 1967.
La ineficacia de los detergentes no enzimáticos para eliminar las proteínas
puede resultar en manchas permanentes debido a la oxidación y alteración causada
por el blanqueo y el secado. La sangre, por ejemplo, deja una mancha de color
óxido si no se quita antes de blanquear.
Por este motivo, se ha intentado utilizar enzimas proteolíticas en la
formulación del producto. Al igual que las enzimas, la mayoría de ellas no son
compatibles con su uso como aditivos, debido a las limitaciones de pH y
temperatura, se desarrolló la producción de proteasas alcalinas, las cuales resisten
temperaturas superiores al medio ambiente (utilizadas en Europa) y valores de pH
superiores. Se desarrollaron otras proteasas con el fin de lavar a temperaturas más
bajas (utilizadas en EE. UU. Y Japón), con el objetivo de ahorrar energía.
Las proteasas actúan sinérgicamente con el detergente: la hidrólisis limitada
es suficiente para hacer que las manchas sean "accesibles" para ser eliminadas por
los componentes del detergente, ya que las proteínas actúan como un pegamento,
evitando que otros vehículos detergentes eliminen los componentes de las
manchas. La hidrólisis de proteínas a partir de endoproteasas de origen microbiano
proporciona polipéptidos o aminoácidos libres más solubles. El efecto combinado
de tensioactivos y enzimas da como resultado la eliminación de manchas de fibra
más difíciles.
Las proteasas para uso comercial en detergentes tienen un pH óptimo de
acción alcalina y generalmente resisten altas temperaturas, lo que permite el uso de
detergentes en sistemas de lavado en caliente. En general, son proteasas con una
masa molar entre 20 y 30 KDa y acción basada en sitios activos que contienen
serina.
201
19.1.2 - Lipasas
Aunque las manchas de proteínas son fácilmente digeridas por las enzimas,
las manchas de aceite y grasa han sido más difíciles de eliminar. La tendencia a
lavar la ropa a temperaturas más bajas ha hecho que eliminar las manchas de
grasa sea un problema aún mayor. Esto es especialmente cierto para las telas
fabricadas con una mezcla de algodón y poliéster.
La primera lipasa introducida en los detergentes comerciales (en 1988) se
originó a partir de la fermentación sumergida y fue producida por Humicola
lanuginosa. Posteriormente, el ADNc responsable de codificar la enzima se
introdujo en Aspergillus orizae y desde entonces ha sido producido por ese
organismo.
Durante muchos años, la industria de los detergentes ha solicitado el
desarrollo de una lipasa adecuada. Novo Nordisk, en 1988, lanzó LIPOLASE, la
primera enzima desintegradora de grasas para detergentes, incorporada a un gran
número de importantes marcas de este producto. LIPOLASE fue la primera enzima
producida por ingeniería genética aplicada en la formulación de detergentes a nivel
mundial. Esta enzima puede eliminar manchas de grasa como lápiz labial, alimentos
fritos, mantequilla, aceite, salsas y las manchas difíciles en cuellos y puños.
Los materiales grasos que manchan la ropa son en su mayoría triglicéridos,
que por la acción de las lipasas se convierten en ácidos grasos libres, di-,
monoglicéridos y glicerol. Estos triglicéridos tienen ácidos grasos de cadena larga
(generalmente C16 o C18) que son poco solubles en agua y difíciles de eliminar. La
acción de las lipasas libera ácidos que a pH alcalino forman los carboxilatos que
son solubles en agua mediante la formación de micelas.
Las lipasas utilizadas en los detergentes también son estables a pH alcalino
y tienen un interesante efecto post-lavado. Se ha descubierto que un segundo
lavado después de un período de secado al aire de la ropa manchada con grasa
proporciona resultados aditivos en el efecto de eliminación de manchas. Este hecho
se ha explicado en base a la acción continuada de la lipasa durante el secado, que
aporta un beneficio adicional en un segundo paso de lavado (figura 3).
En 1995, esta misma empresa (Novo Nordisk) desarrolló, con la ayuda de la
ingeniería de proteínas, una nueva lipasa - LIPOLASE ULTRA - con mejores
prestaciones que la anterior en lavados a baja temperatura. Fue posible, a 10o C,
lograr el nivel deseado de eliminación de grasa utilizando una cuarta parte de la
dosis requerida con lipolasa.
Esta ventaja se debe a un pequeño cambio en la molécula de la enzima, que
consta de 269 aminoácidos. La única diferencia es un aminoácido en una posición
cercana al centro activo. El objetivo era mejorar el rendimiento de la enzima en
términos de efecto de lavado por miligramo, cambiando la fuerza iónica de la zona
de contacto de lípidos.
202
Para ello, el objetivo era eliminar las cargas negativas cercanas al centro
activo, reemplazando la asparagina cargada negativamente, en la posición 96, por
leucina, un aminoácido neutro. Por tanto, la molécula se volvió más hidrófoba,
siendo menos susceptible a flotar en la solución de lavado. En cambio, tiende a
migrar más rápido a las manchas de grasa en la ropa sucia.
Figura 3 - Acción de la lipasa en un proceso de secado de ropa lavada con detergente que contiene la
enzima. Se determinó que a los 90 min de secado, la humedad del tejido fue de 20-30%, donde se
encuentra la máxima acción de la lipasa.
19.1.3 - Amilasas
Las amilasas se utilizan para eliminar los residuos de alimentos que
contienen almidón, como puré de patatas, pasta, avena, budines, carnes y salsas
de chocolate. El almidón contenido en estos materiales suele actuar como un
pegamento que incluso retiene manchas de origen proteico y lipídico.
Las amilasas actualmente comercializadas son producidas por Bacilus
licheniformis y B. amyloliquefaciens mediante fermentación sumergida. Estas
enzimas hidrolizan el almidón transformándolo en oligómeros de cadena corta
solubles en agua (gelatinización). Como otras enzimas utilizadas en detergentes,
tienen una resistencia moderada al pH alcalino y actúan a temperaturas elevadas.
Las amilasas desarrolladas se pueden utilizar en detergentes para ropa, así
como en detergentes sin cloro, para lavavajillas automáticos.
19.1.4 - Celulasas
Las celulasas se pueden utilizar en la formulación de detergentes, con el fin
de modificar la estructura de las fibrillas celulósicas como las que se encuentran en
el algodón, y generalmente son producidas por especies del género Bacillus o por
hongos del género Humicola. Estas celulasas tienen un pH de acción óptimo
cercano a 7,0, a pesar de tener cierta tolerancia a valores de pH superiores.
Las celulasas son hidrolasas que degradan los enlaces glicosídicos de la
celulosa y se dividen en endocelulasas que degradan el polímero al azar,
generando oligómeros más pequeños y exocelulasas que degradan estos
oligómeros en los extremos de la cadena de celulosa, generando celobiosis.
203
A diferencia de las enzimas mencionadas anteriormente, las celulasas
degradan la tela de la ropa que contiene algodón. El efecto en este caso es la
eliminación de las fibrillas de celulosa que, con el tiempo, aparecen como una
pluma en el exterior de la fibra principal. El efecto de las celulasas sobre los tejidos
es mejorar la apariencia en términos de brillo, suavidad y facilitar la eliminación de
partículas sólidas del tejido (a menudo partículas del propio algodón que componen
el tejido).
De esta forma, producen los siguientes efectos:
Intensificación del color: la
decoloración del color de las telas
de algodón se debe a la formación
de microfibrillas que se separan en
parte de las fibras principales. La
luz que incide sobre la ropa se
refleja con más intensidad, dando la
impresión de que el color es más
apagado. Estas fibrillas pueden ser
desplegadas por la enzima celulasa,
devolviendo la fibra a la fibra y
restaurando el color original de la
ropa.
 Ablandamiento: la enzima también
tiene un efecto de ablandamiento
significativo en el tejido, debido a
la eliminación de microfibrillas.
 Eliminando partículas de suciedad - Algunas partículas de suciedad
quedan atrapadas en la malla de microfibrillas y se desprenden cuando la
enzima las elimina.
19.2 - TIPOS DE DETERGENTES INDUSTRIALES
19.2.1 - Detergentes en polvo

En la década de 1960, se agregaron enzimas en polvo a los detergentes. En
circunstancias desfavorables, se produjo la formación de un polvo que, en continuo
contacto con las manos del usuario, generó fuertes reacciones alérgicas, ya que, al
ser las proteasas alcalinas proteínas heterólogas, estimulan la producción de
anticuerpos. Así, una publicación, en 1969, que contraindicaba el uso de estos
detergentes interrumpió la aplicación enzimática en estas formulaciones.
Así, en 1970 se introdujo una técnica denominada "priling", mediante la cual
se eliminaba virtualmente el polvo. Las técnicas de fabricación de enzimas se han
perfeccionado a lo largo de los años y el tipo más reciente se llama T - gránulos. La
enzima está recubierta con una sustancia inerte y, como resultado, se vuelve
altamente resistente tanto a la abrasión como al impacto, y tiene una tendencia
mínima a formar polvo.
Para su uso en detergentes en polvo, las enzimas se formulan como cargas
o agentes aglutinantes en pequeños gránulos y, a menudo, se recubren con una
capa de cera u otro material inerte. Para evitar la segregación de las partículas
204
enzimáticas en el detergente en polvo durante el transporte, por ejemplo, el tamaño
de la partícula de gránulos de enzima debe ser similar en tamaño a las partículas de
detergente. Estas partículas deben disolverse rápidamente cuando se prepara el
líquido de lavado.
205
19.2.2 - Detergentes liquidos
En muchos países ha aumentado el interés por los detergentes domésticos
líquidos. En comparación con los jabones en polvo, es más difícil conservar la
estabilidad de la enzima en estos detergentes líquidos. Este hecho se debe a la alta
actividad del agua combinada con el pH alcalino y la presencia de compuestos
iónicos desnaturalizantes que proporcionan condiciones favorables para la
autodigestión de las proteasas (excepto si el pH se lleva a un rango entre 7-8).
La composición del líquido de lavado y las prácticas de lavado difieren de un
país a otro. En Europa se utilizan concentraciones de detergente entre 4 y 10 g / L.
La formulación de estos productos contiene lejía y el proceso de lavado se
caracteriza por una fase de calentamiento seguida de una fase de temperatura
constante. En EE. UU. Y Japón, las concentraciones de detergente son más bajas,
y los blanqueadores se agregan por separado en una cantidad menor que la que se
usa en Europa (Tabla 1).
tabla 1. Composición media de detergentes en polvo y líquidos utilizados en Europa.
Ingredientes Polvo,% Neto,% (p / p)
(p / p)
Tensioactivos aniónicos 8 - 10
2 - 10
Tensioactivos no aniónicos 0,5 - 6 18 - 20
Jabón 15 7 - 12
Secuestradores 30 - 50
Ácido etilendiamino tetraacético 1
Lejía 20 - 30
Tri-etanolamina 7 - 13
Etanol 4-6
Propilenglicol 4-6
Enzimas 0,5 1
perfume 0,2 0.4
Blanqueadores ópticos 0,4 - 0,8 0,2
Sulfato de sodio para completar 100%
Agua para completar el
100%
19.2.3 - Detergentes para lavavajillas automáticos

Las formulaciones tienden a diferir ampliamente entre los detergentes para
ropa y los lavavajillas. Las formulaciones de detergentes tradicionales para
lavavajillas automáticos en Europa y EE. UU. Contienen metasilicato, fosfatos y
blanqueador de cloro, pero no enzimas.
Sin embargo, desde hace algunos años, particularmente en Europa, se viene
dando el uso de enzimas en detergentes para estas máquinas. El meta-silicato fue
reemplazado por el disilicato, reduciendo así el pH.
206
Se han abandonado los blanqueadores clorados y los fosfatos,
principalmente por motivos medioambientales. Normalmente, si se eliminan los
fosfatos y el cloro y se reduce el pH, el rendimiento del lavado se ve afectado. Se
agregan enzimas para mantener el rendimiento a pesar de los cambios.
Los nuevos detergentes enzimáticos para lavavajillas suelen ser mejores
para eliminar las manchas de almidón y proteínas que los detergentes tradicionales.
Las películas de almidón pueden agrandarse y dar a los platos una apariencia
borrosa y pequeñas cantidades de proteína son un problema, particularmente en
cristalería y cubertería. Aunque la vajilla y la cristalería pueden parecer limpias a
simple vista, las concentraciones de proteínas a menudo aparecen en la superficie y
atraen depósitos blancos de cal (del agua mineralizada) si no se lleva a cabo
intercambio iónico. Se pueden utilizar enzimas para eliminar este tipo de suciedad
rebelde. Una de las mayores ventajas de las enzimas es que eliminan eficazmente
la suciedad incluso cuando la temperatura de lavado es baja.
19.3 - EVALUACIÓN DE LA EFICIENCIA ENZIMÁTICA EN LIMPIEZA
19.3.1 - Rendimiento de lavado

Cuantificar el efecto de las enzimas en las formulaciones de detergentes en
términos prácticos (resultado en ropa lavada) es extremadamente difícil, ya que a
menudo implica determinaciones subjetivas de cuán limpia está una tela.
La contribución de una enzima al rendimiento de lavado de un detergente se
determina mediante lavados de prueba en el laboratorio, utilizando lavadoras
especialmente desarrolladas (launder-ometer en Europa del Este; tergotometer en
los EE. UU.).
Para las pruebas de laboratorio se utilizan diferentes tipos de tintes
artificiales, como leche, sangre, cacao, hierba, huevo o grasa. Las manchas se
aplican a diferentes tejidos como el algodón o el poliéster. Las tinciones específicas
se desarrollan en el laboratorio y otras están disponibles comercialmente. Una
prueba muy conocida para el estudio de la eliminación de proteínas es la EMPA
116, que utiliza ropa de algodón teñida con leche, sangre y tinta (la tinta está
"pegada" a la tela por las proteínas presentes en la leche y la sangre). Por tanto, la
hidrólisis de proteínas es fundamental para una eliminación eficaz de la pintura. La
cantidad de tinta que queda en la prenda después del lavado se determina
midiendo la decoloración del color. Este es un indicador de la contribución
enzimática al rendimiento del lavado, sin lejía. (Figura 4)
207
remisión
Concentración de enzimas (UD / g)
Figura 4 - Contribución del aumento de la concentración de enzima en la eliminación de manchas de

proteínas. Proteasa, expresada en unidades de Delft (UD) por gramo de detergente, incubada durante 40
min a 40o C en un lauderómetro con el tejido de prueba EMPA 116 en presencia de un detergente típico
sin sistema blanqueador.
Uno de los métodos desarrollados para evaluar el rendimiento del lavado es

determinar la reflectancia de la superficie de una tela en longitudes de onda en la
región visible. Por lo general, la medición se realiza a 460 nm para tejidos blancos.
El método consiste en teñir un tejido limpio con una cantidad conocida de un agente
específico (sangre para acción proteasa, aceite para acción lipasa y salsas a base
de almidón rojo para amilasas) y lavarlos con detergente con y sin adición de una
enzima específica. Se determina la reflectancia de cada tejido después del lavado y
secado y el resultado se expresa como una diferencia de reflectancia (con enzima,
sin enzima). Un ejemplo de esta metodología se ilustra para la acción de una
proteasa en tejidos tratados con dosis variables de la enzima en el detergente
(figura 5).
Figura 5 - Acción de una proteasa (Savinase) sobre el lavado de un tejido en condiciones estandarizadas.
El método consiste en medir la reflectancia del tejido después del lavado y comparar el efecto con un
detergente similar, pero sin la adición de la enzima.
En el caso de Performance Quantification para detergentes lavavajillas, la
acción del mismo grupo de enzimas anteriormente mencionado puede facilitar la
eliminación de la suciedad adherida a platos y cubiertos durante el proceso de
lavado en máquinas automáticas.
208
Figura 6 - Acción de una lipasa (Lipolasa) sobre el lavado de un tejido teñido de grasa que contiene un
tinte (rojo) en condiciones estándar. El método consiste en medir la reflectancia del tejido después del
lavado.
La cuantificación del beneficio del uso de enzimas también es compleja y, en

este caso, se ha medido un patrón visual de resultados con fines comparativos. El
método consiste en ensuciar platos de acero inoxidable o platos de cerámica con
cantidades determinadas de leche, huevos, salsas u otros productos alimenticios,
secar los platos y luego lavarlos (tabla 2, figura 7)
Tabla 2. Cuantificación del rendimiento de detergentes para lavavajillas.
Resultado numérico Eliminación de la película de almidón
(Ranking)
Platos Cuchiller
ía
5 Limpio Limpio
4 Limpiado antes del control de yodo puntos aleatorios
3 Intermediario Intermediario
Figura 7 - Acción de una amilasa (termamyl) sobre el lavado de platos en una máquina automática. El
método consiste en cuantificar visualmente el nivel de limpieza de la vajilla después del lavado.
19.3.2 - Economía de energía

Al manipular parámetros como el tiempo de aplicación, la temperatura y la
concentración de enzimas, se puede lograr un efecto satisfactorio incluso a
temperaturas muy bajas.
209
Este efecto se puede obtener aumentando el tiempo de aplicación
(remojando la ropa antes del lavado) o aumentando la concentración de enzima
(tratamiento previo de las manchas). De hecho, se ha comprobado que al remojar la
ropa antes del lavado en un agente enzimático y luego lavar la ropa a baja
temperatura, los resultados pueden ser tan buenos o mejores que en un lavado
normal a alta temperatura, pero sin empapar la ropa. .
La incorporación de sistemas blanqueadores en detergentes requiere el
desarrollo de enzimas tolerantes a estos compuestos. Los sistemas de blanqueo
actuales no son estables en medios acuosos (detergentes líquidos) y los sistemas
de blanqueo biológicos (con enzimas) representan una alternativa, por ejemplo,
utilizando metanol oxidasa.
Otra consideración importante es que, en general, las industrias productoras
de enzimas como Novozymes presentan un formulario de solicitud donde describen,
para cada aplicación industrial, las enzimas o extractos de enzimas disponibles y lo
que pueden hacer. Proporcionan aspectos como la actividad enzimática, la forma
física de la enzima, las condiciones de aplicación, etc., incluyendo también la ficha
de datos de seguridad del material. Esto facilita la compra y aplicación de estos
productos.
19.4 - LIMPIEZA DE MEMBRANAS

Una de las ventajas de la ultrafiltración, por ejemplo, es que las membranas
se pueden limpiar automáticamente enjuagando el sistema con agentes de limpieza
químicos (sosa cáustica y / o ácidos). Es necesaria una limpieza regular porque una
capa de coloides se acumula gradualmente en la superficie de las membranas,
reduciendo su rendimiento. Los coloides consisten en partículas finas, demasiado
pequeñas para ser vistas. La membrana funciona a nivel molecular, filtrando las
moléculas más grandes.
En el procesamiento de frutas, la ultrafiltración es un paso clave y, sin ella, la
producción se detiene. Durante el prensado y maceración de la fruta, los coloides,
como los residuos de pectina y polisacáridos, se liberan de la pared celular al jugo.
A menos que estén completamente degradados antes de que comience la
ultrafiltración, tenderán a bloquear las delicadas membranas de ultrafiltración. Los
coloides consisten predominantemente en raminogalacturans y arabinogalactans.
La principal actividad del complejo enzimático utilizado para la limpieza de
membranas es pectinolítica, con actividades secundarias de amilasa, proteasa,
celulasa, hemicelulasa y raminogalacturonasa. Es capaz de hidrolizar la mayor
parte de la pectina, celulosa, proteína, hemicelulosa y almidón y así eliminar la capa
orgánica que bloquea la membrana. Se agregan ventajas, aumentando la
capacidad de la membrana, extendiendo su vida útil, utilizando condiciones suaves
y reduciendo la necesidad de sosa cáustica.
El tratamiento enzimático no sustituye por completo a los tratamientos
químicos, siendo habitual el uso de sosa cáustica. Algunas empresas utilizan
ambos tratamientos indistintamente (enzimático un día y químico al día siguiente).
210
La necesidad de utilizar tratamientos químicos proviene de material
inorgánico, por ejemplo, películas de cal, que no se verán afectadas por el
tratamiento enzimático. La sosa cáustica es un químico agresivo que ataca las
membranas. Al reducir el uso de esta sustancia se alarga la vida útil de las
membranas, ya que el tratamiento enzimático es suave.
Los complejos de enzimas para este propósito consisten en preparaciones
de grado alimenticio similares a las otras enzimas que ya se utilizan en el
procesamiento de jugos. Este complejo se puede utilizar para limpiar membranas
de ultrafiltración, microfiltración y equipos de ósmosis inversa.
La experiencia demuestra que la limpieza enzimática permite aumentar el
caudal de agua de menos de 150 L / m2 por hora a más de 500 L / m2 por hora en
ultrafiltración.
En el caso de los productos lácteos, las enzimas proteolíticas se utilizan para
descomponer las proteínas que se adhieren a las membranas, y se pueden utilizar
tanto endoproteasas vegetales como proteasas microbianas.
Cutinasas
La cutina es un polímero de poliéster natural, siendo una mezcla compleja de
ácidos grasos hidroxilados interesterificados con una cadena de 16 o 18 carbonos, y es
responsable de la protección contra patógenos y pérdida de agua en plantas superiores.
Las cutinasas son producidas por hongos fitopatógenos, como Fusarium solani
pisi, pero normalmente se sobreexpresan en Saccharomyces cerevisiae o Escherichia coli.
Estos hidrolizan los enlaces éster de la cutina, pero también son capaces de hidrolizar
varios otros ésteres, desde ésteres de p-nitrofenilo solubles hasta triglicéridos de cadena
larga insolubles o emulsionados. Éstos actúan tan eficazmente como las esterasas y
lipasas, considerándose un vínculo entre los dos.
Debido a estas propiedades, las cutinasas se vuelven interesantes para procesos
industriales, tanto en reacciones de hidrólisis como de síntesis. Los principales ejemplos
están en la hidrólisis de la crema de leche, en los detergentes, en la industria oleoquímica,
en la síntesis de tensioactivos, cosméticos, fármacos y agroquímicos.
19.6 - REFERENCIAS
― BANIK, RM; PRAKASH, M.; Compatibilidad detergente de ropa de la proteasa alcalina de Bacillus
cereus. Investigación microbiológica, 159, 135-140, 2004.
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2000.
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condiciones y caracterización de cutinasa producida por Saccharomyces cerevisiae recombinante.
Tecnología enzimática y microbiana, 31, 161-170, 2002.
211
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gelificación interna de microesferas de alginato para aplicación en formulación detergente. Tecnología
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― HAKAMADA, Y.; KOIKE, K.; YOSHIMATSU, T.; MORI, H.; KOBAYASHI, T.; ITO, S.;
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156, 1997.
― HEMACHANDER, C.; PUVANAKRISHNAN, R.; Lipasa de Ralstonia pickettii como aditivo en
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― MANNESSE, MLM; COX, RC; KOOPS, BC; VERHEIJ, HM; DE HAAS, GH; EGMOND,
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sustrato sobre la actividad y enantioselectividad. Biochemistry, 34, 6400-6407, 1995.
― MITIDIERI, S.; MARTINELLI, AHS; SCHRANK, A.; VAINSTEIN, MH; Detergente enzimático
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detergentes comerciales. Tecnología de fuentes biológicas, 97, 1217-1224, 2006.
― NOVOZYMES. La nueva amilasa hace que los detergentes líquidos sean más eficientes. Biotimes, págs. 1,
junio de 2002.
― NOVOZYMES. Elimina las manchas de grasa del primer lavado. Biotimes, págs. 1, conjunto. 2002.
― NOVOZYMES. Lava total más blanca con nueva celulasa. Biotimes, págs. 10-11, diez. 2002
― NOVOZYMES. Stainzyme®: un avance importante en el lavado de platos. Biotimes, págs. 6-7, marzo
de 2004.
― NOVOZYMES. La nueva enzima ofrece un mejor lavado a un costo reducido. Biotimes, págs. 8-9, enero.
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― NOVOZYMES. Las proteasas "ultra" resuelven el problema del ácido bórico en los detergentes líquidos.
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― NOVOZYMES. Más limpieza y más verde. Biotimes, pág.3, junio de 2005.
― RATHI, P.; SAXENA, RK; GUPTA, R.; Una nueva lipasa alcalina de Burkholderia cepacia para
formulación de detergente. Process Biochemistry, 37, 187-192, 2001.
― STONER, MR; DALE, DA; GUALFETTI, PJ; BECKER, T.; RANDOLPH, TW; Ca2 + -
Las interacciones de los tensioactivos afectan la estabilidad de las enzimas en las soluciones de
detergente. Progreso de la biotecnología, 21, 1716-1723, 2005.
212
CAPÍTULO 20 - SENSORES ENZIMÁTICOS
Una de las primeras áreas de aplicación de las enzimas fue el campo del
análisis. La prueba de un compuesto particular en el fluido biológico complejo, como
el plasma, se complica por la presencia de varias sustancias potencialmente
interferentes. Una forma de resolver este problema es utilizar una técnica de
separación adecuada en combinación con un detector sensible, aunque no
específico. El mejor ejemplo de esta estrategia es la cromatografía líquida de alta
resolución, que actualmente se aplica a una amplia gama de análisis biológicos y
farmacéuticos.
La alternativa es emplear un detector específico que no se vea afectado por
la presencia de contaminantes. La actividad biológica y la especificidad de las
enzimas las convierten en potenciales candidatos para este tipo de detectores. El
procedimiento más sencillo es realizar un ensayo enzimático utilizando una enzima
adecuada para convertir un compuesto, que no es fácilmente detectable, en un
producto o subproducto. Aunque hay muchos casos en los que estos productos
pueden obtenerse en una reacción, es posible encadenar una secuencia de
reacciones de tal manera que se pueda medir el producto de la última reacción. Por
conveniencia práctica, esto se logra comúnmente acoplando la reacción de interés
a la oxidación o reducción de la coenzima nicotinamida-adenina-dinucleótido
(NADH o NADPH).
1 ol mol de NAD + en NADH). A continuación se describen ejemplos de este tipo de
aplicación.
Amonio: 2 oxoglutarato + NH NADH glutamato
4+ +
deshidrogenasa glutamato + NAD + + H +
Glucosa: Glucosa + ATP hexoquinasa glucosa-6P + ADP

Glucosa-6P + NADP glucosa-6P 6-fosfogluconato +
+ deshidrogenasa NADPH
Este tipo de análisis enzimático se viene utilizando desde hace muchos años
y la tendencia es que aumente, como consecuencia de la mayor disponibilidad de
enzimas altamente purificadas. Los análisis de este tipo juegan un papel importante
en la química analítica, pero son costosos y lentos. En aplicaciones que requieren
análisis de rutina, se requiere alguna forma de automatización, incluida la
posibilidad de reutilizar la enzima.
Los avances en las técnicas de inmovilización de enzimas han hecho una
contribución significativa en el campo de los sensores de enzimas. Las ventajas de
utilizar enzimas inmovilizadas en los análisis se pueden resumir en:
 Mayor estabilidad;
 Reutilización del catalizador;
 La muestra se puede separar de la
enzima para su posterior análisis;
 Curvas de inactivación predecibles.
213
El uso de enzimas inmovilizadas en estos sistemas se puede dividir en dos
grupos. Primero, se puede construir un reactor enzimático que genere uno o más
productos detectables por métodos tradicionales (por ejemplo, variación de
absorbancia). En segundo lugar, la enzima puede inmovilizarse alrededor o sobre la
superficie de un transductor que sea capaz de detectar cambios físicos o químicos
en el entorno circundante.
20.1 - SISTEMAS DE ANÁLISIS APLICANDO ENZIMAS
20.1.1 - Sistemas de análisis de inyección de flujo (FIA - Análisis de

inyección de flujo)
La técnica FIA puede considerarse como una de las técnicas con mayor
potencial de aplicación para el seguimiento y control de procesos fermentativos,
análisis de sustancias, etc. debido a la rápida respuesta de este sistema de análisis
y la flexibilidad de incorporar nuevos sensores. Tienen numerosas ventajas como:
 Altas frecuencias de análisis;
 Utilizan pequeños volúmenes de muestra y tienen tiempos de
respuesta rápidos;
 Tienen líneas de muestreo integradas
y preparación de muestras;
 La calibración del sistema se puede
realizar en cualquier momento;
 Presenta pocas interferencias y permite la introducción de líneas de
dilución y tratamiento de muestras;
 Tienen confiabilidad, reproducibilidad, bajo costo y largos tiempos de
operación de los sensores;
 Son sistemas flexibles y versátiles
que permiten la incorporación de
nuevas técnicas analíticas;
 No es necesario alcanzar el equilibrio o (estado estacionario) y
estabilizar la línea de base;
 Permiten automatizar el pretratamiento de la muestra y ampliar el rango
de detección, permitiendo un fácil mantenimiento y la robustez que confiere
el uso de "software" y "hardware" inteligentes;
 Permiten el análisis simultáneo de
más de un analito presente en la muestra.
214
Figura 1 - Esquema básico de un sistema de análisis FIA
215
El sistema FIA (figura 1) consta de cuatro componentes principales:
 Sistema de propulsión - bomba peristáltica, sistema de presión de gas o
la simple fuerza de la gravedad para manipular y transportar la muestra -
establece el flujo del medio o de las especies portadoras lo más constante
posible en todo el conjunto;
 Sistema de inyección - válvula de
inyección - inserta un volumen fijo
de muestra con gran
reproducibilidad de funcionamiento
y sin interrumpirlo;
 Sistema de reacción - puede ser un tubo recto, en forma de serpentina o
espiral (“bobina”), lleno o no de partículas inertes, o tener una cámara de
mezcla llena de material inerte o químicamente activo. En estas áreas, el
transporte ocurre con su proceso de reacción adicional. Las enzimas se pueden
utilizar en este sistema libres (en solución), inmovilizadas en la pared de un
tubo (reactor) o inmovilizadas en esferas en el portador.
 Sistema de detección - detector
(colorímetro, fotómetro,
fluorímetro, potenciómetro,
amperímetro, etc.) que genera la
señal continua transmitida a un
registrador y un microprocesador.
El método FIA en general actúa de forma sencilla y automatizada, donde se
inserta en el flujo un pequeño volumen de muestra líquida, junto con un portador, y
la señal (respuesta como una variación de algún parámetro físico o químico)
producida por Se detecta algún tipo de reacción en un analizador. La Tabla 1
presenta ejemplos de la composición de algunos sistemas FIA.
Tabla 1 - Principales aplicaciones en determinación con sistemas FIA

Componente medido Sistema de detección Reacción enzimática
Sacarosa Termistor glucosa oxidasa y catalasa
Glucosa Fotómetro glucosa oxidasa
Galactosa Fotómetro GAL oxidasa
Etanol Colorimetro Alcohol oxidasa y peroxidasa
Fenol de 4-aminofenasona
20.1.2 - Sistemas de análisis de inyección secuencial (sistema SIA)

El sistema SIA se desarrolló como un sistema de análisis químico más
robusto, buscando superar las dificultades impuestas para el uso de los sistemas
FIA desde un punto de vista industrial, como el alto consumo de reactivos y la
necesidad de esquemas de flujo complicados. A diferencia del FIA que realiza la
interacción entre la muestra y el reactivo en un solo punto de confluencia
(inyección), en el sistema SIA un sistema de microprocesador que controla el flujo
permite que esta interacción ocurra a través de una zona de penetración.
Estos sistemas constan de una bomba de pistón, utilizada para succión y
bombeo, y una válvula selectora de múltiples posiciones simple conectada a
depósitos de reactivo-enzima, depósitos de muestra, reactores o zona de reacción
216
(“serpentín” o reactores serpentinos) y detectores. (Figura 2)
217
Descarte
Reactor 2
bomba
Reactor 1 Reactivo
de
Tubos de mezcla
muestra
Lavado
Válvula
Figura 2 - Esquema básico de un sistema SIA
Cada ciclo SIA inicialmente consiste en llenar el sistema con la solución

portadora y luego aspirar la muestra y el reactivo en una secuencia dada usando
una válvula selectora, y dirigirlos al tubo de reacción o zona de reacción. Los
reactivos y la muestra en el tubo de reacción (zona de reacción) comienzan a
superponerse dependiendo de la difusión, ocurriendo la reacción.
Después de un cierto tiempo de reacción y se ha obtenido un cierto grado de
conversión, la posición de la válvula selectora se avanza al canal que está
conectado al detector y el flujo de la bomba se dirige a flujo inverso, impulsando la
zona de muestra / reactivo. a través de la celda de flujo del detector.
Entre las ventajas de estos sistemas podemos mencionar:
 Los sistemas SIA son adecuados para
estudios de reacciones analíticas lentas;
 El contenido de reactivo utilizado es significativamente menor que en la
FIA, donde el flujo del reactivo es continuo;
 Todos los parámetros del
protocolo experimental: volúmenes
de muestra y reactivo, tiempo de
reacción y mezcla (“stop-flow”)
pueden seleccionarse y controlarse
e incluso modificarse durante los
análisis;
Los sistemas SIA se pueden utilizar
para cuantificar varias especies sin
tener que cambiar el diseño del
sistema. Pueden analizar diferentes
componentes cambiando solo la
configuración del software y el
reemplazo de reactivos;
 Permiten una frecuencia de
muestreo de 12 muestras / h, siendo
atractivos para la monitorización de
procesos industriales y han
mostrado un aumento en la
estabilidad del análisis al reducir su
218
complejidad mecánica.
En cuanto a sus inconvenientes, un posible inconveniente del principio SIA
es el aumento del tiempo de análisis, típicamente en el rango de 5 minutos, en
comparación con el sistema FIA tradicional, que en general es de 1 a 2 minutos.
La tabla 2 resume las principales aplicaciones del sistema
SIA.
219
Tabla 2 - Principales aplicaciones en determinación con sistemas SIA
Componente analizado Método de detección Area de aplicacion
Nitrato Electroquímico (enzimas Medio ambiente
nitrato
reductasa y nitrito reductasa)
Glicerol Amperométrico (enzima Industria alimentaria
glicerol deshidrogenasa) (bebidas alcohólicas)
Ácido láctico Amperométrico (enzima D- Industria de alimentos
lactato deshidrogenasa)
Glucosa Amperométrico (enzima Industria de bioprocesos
glucosa oxidasa)
Glucosa, ácido láctico y Amperométrico (enzimas Industria de bioprocesos
penicilina glucosa oxidasa, D-lactato
deshidrogenasa y penicilinasa)
Etanol Amperométrico (enzima Industria de bioprocesos
alcohólica
deshidrogenasa)
D- glucosa Quimioluminiscente (reactor Industria de bioprocesos
tubular enzimático) y comida
Amiloglucosidasa Colorimétrico Actividad enzimatica
20.1.3 - Sistemas FIIA - Inmunoanálisis de inyección de flujo

Sin embargo, los sistemas FIIA son similares a los sistemas FIA, basados en
reacciones inmunoquímicas y de bioafinidad. Estas reacciones están relacionadas
con la afinidad entre anticuerpo / antígeno formando una unión muy selectiva de
gran estabilidad termodinámica.
Los animales producen anticuerpos (Ab) e inmunoglobinas (Ig) en respuesta
a la presencia de sustancias extrañas llamadas inmunógenos o antígenos (Ag), y la
formación del complejo Ag-Ac se puede controlar de la siguiente manera:
 Directo - no requieren el uso de un marcador;
 Indirecto - necesitan marcadores radiactivos (radioisótopos) de uso
restringido, compuestos fluorescentes o enzimas - ELISA (ensayo
inmunsorbente ligado a enzimas).
En cuanto a la clasificación de los inmunoensayos indirectos, estos se
pueden clasificar en:
 Homogéneo - cuando para la detección no sea necesario la
separación, entre especies marcadas y libres;
 Heterogéneo: cuando se necesita
una cuantificación precisa, un paso
adicional para separar las fracciones
libre y unida de las especies
etiquetadas;
 Competitivo: cuando el antígeno
marcado con la enzima (Ag *) y el
antígeno libre (Ag), compiten por
unirse con el anticuerpo
inmovilizado que forma el
complejo AcAg * o AcAg;
220
 Tipo sándwich: se realiza
inmovilizando el Ac o Ag sobre una
superficie sólida y, después de la
reacción con el analito, se agrega un
sistema para monitorear la reacción
Ag-Ac, que comprende un
antianalito conjugado con una
enzima.
221
Como ejemplo de aplicación del sistema FIIA, se encuentra la determinación
de microorganismos patógenos en alimentos (Salmonella, E. coli, etc.), utilizando
anticuerpos, microorganismos y enzima glucosa oxidasa. El anticuerpo se
inmovilizó en las paredes interiores de un tubo Tygon a través del cual se bombean
soluciones de muestra y enzimas libres, sucesivamente. Finalmente, se bombea
una solución de glucosa a través del tubo y luego se determina
electroquímicamente el H2O2 formado por la reacción con la enzima unida al
complejo AgAc. (figura 3)
Figura 3 - FIIA - Determinación de Salmonella en alimentos preparados
20.2 - REACTORES ANALÍTICOS

Pueden considerarse ejemplos de análisis de inyección de flujo.
Básicamente, el sistema es similar a la cromatografía líquida sin el paso
de separación. El reactor puede ser de dos tipos:
20.2.1 - Reactor de lecho compacto

La enzima se inmoviliza sobre un soporte y se empaqueta en la columna. El
líquido que contiene la muestra pasa a través de la columna, lo que permite que se
produzca la reacción. La ventaja de este sistema reside en la gran superficie para el
envasado de la enzima inmovilizada y, dependiendo de la carga enzimática del
soporte obtenido en la inmovilización, se puede conseguir una alta carga por unidad
de superficie del reactor. Como el grado de conversión es función de la carga de
enzima, cuanto mayor sea este parámetro, mayor será la velocidad de paso de la
muestra.
Sin embargo, el paso del flujo a través de una columna puede ocasionar
problemas de dispersión de la muestra, provocando la dilución de la misma y, en
consecuencia, reduciendo la sensibilidad de la prueba. Si la salida del detector
considera la formación de un pico, la dispersión puede reducir la altura del pico y
ensanchar su base, empeorando la resolución y posiblemente provocando regiones
de intersección entre los análisis.
222
20.2.2 - Reactores tubulares abiertos
La enzima se inmoviliza dentro de una porción de tubo (típicamente con un
diámetro interior ( int) <1 mm). La muestra pasa por este tubo que sirve de reactor.
La desventaja es que hay un área relativamente pequeña para la inmovilización.
En la práctica, este reactor ha recibido un mayor interés analítico (clínico,
farmacéutico, etc.) Este tipo de reactor es especialmente adecuado para reacciones
que requieren largos tiempos de incubación combinados con alta precisión. En este
caso, la dispersión axial es limitada. Sin embargo, la escasa superficie es un
problema y, según los estudios, se compensa con la mayor tasa de transferencia de
masa.
20.3 - SENSORES ENZIMÁTICOS

20.3.1 - Autoanalizadores
Analizadores específicos que se utilizan para analizar sustancias como
glucosa, etanol, nitritos, nitratos. Hay autoanalizadores comercializados por YSI
(Yellow Spring Instruments). En este caso, son instrumentos que utilizan enzimas
en su composición, pero no permiten realizar análisis continuos.
20.3.2 - Biosensores
Los biosensores se pueden definir como instrumentos analíticos que utilizan
material biológico conectado a un sistema de transducción adecuado que convierte
una señal biológica en una señal eléctrica cuantificable y procesable.
El funcionamiento de los biosensores en general se basa inicialmente en el
reconocimiento de un sustrato dado por el componente biológico. La alta
especificidad y sensibilidad del componente biológico con el sustrato de interés son
de gran importancia para el correcto funcionamiento del biosensor. Luego, como
producto de la interacción entre la molécula biológica y el sustrato, se generan
variaciones de uno o más parámetros físico-químicos y estos producen iones,
electrones, calor, luz, masa, fluorescencia o gases, que se convierten en un señal
cuantificable y procesable mediante el uso de un transductor adecuado. (Figura 4)
Figura 4 - Esquema de funcionamiento de un biosensor.
223
La aplicación de un biosensor permite la detección cuantitativa de una
determinada especie, ya que responde de forma selectiva y reversible a la especie
química, produciendo una señal eléctrica cuya intensidad depende de la
concentración de esa especie.
Los biosensores tienen un amplio mercado potencial de aplicación, que
cubre las áreas de diagnóstico clínico y militar, control de procesos, industrias de
alimentos y bebidas, agricultura y monitoreo ambiental. Entre estas, las áreas que
más se han venido desarrollando en la creación y también en la comercialización de
estos instrumentos son las áreas médica y alimentaria.
Enzimas utilizadas como componentes biológicos en biosensores
Las enzimas se utilizan como componentes biológicos en biosensores
porque tienen la disponibilidad de un sitio reactivo que puede reaccionar /
interactuar con el analito, estabilidad en relación con el medio y las condiciones de
medición y la posibilidad de modificación / inmovilización sobre soportes por
métodos químicos sin afectar su desempeño.
La mayoría de los biosensores desarrollados utilizan enzimas, generalmente
inmovilizadas, como componentes biológicos. La ventaja de utilizar estos
componentes es que las enzimas son catalizadores biológicos altamente
específicos y selectivos.
Las mayores desventajas de aplicar estos componentes biológicos se deben
a su baja estabilidad; la necesidad de cofactores, en algunos casos; Sensibilidad a
cambios en las condiciones ambientales y alto costo. La Tabla 3 presenta algunos
ejemplos de biosensores enzimáticos y sus áreas de aplicación.
Tabla 3 - Ejemplos de biosensores enzimáticos

Componente Enzima Tipo de Rango Areas de aplicación
medido inmovilizada transductor de
medicio
n
Glucosa, Glucosa oxidasa, Amperométrico 10-6-10-4 M Industria
Sacarosa Invertase Alimentos, Agricultura
Etanol Alcohol Amperométrico Hasta 800 Analisis clinico
deshidrogenasa ppm
Ácido Ascorbato Amperométrico 62,5 - 500 Industria de alimentos
Ascórbico oxidasa METRO
Fenol Rodinasa Calorimétrico 0,01 - 1,0 M Medio ambiente
Peroxido de Peroxidasa Óptico 1 - 10 mM Bioprocesos, Análisis
hidrogeno clínico
Penicilina Penicilinasa Potenciométrico 10-4 - 10-2 Médico
M
20.3.2.1 - Enzimas vinculadas a transductores

Aunque se utilizan ampliamente, los analizadores basados en reactores
enzimáticos son dispositivos complejos y costosos. Una alternativa es combinar la
enzima con el detector para simplificar la operación. El objetivo es producir un
sensor robusto y económico, capaz de proporcionar una salida continua.
Idealmente, tales sensores no deberían requerir reactivos externos distintos de
sustratos y serían menos destructivos.
224
La forma más simple de un sensor transductor enzimático es el llamado
electrodo enzimático. En este caso, la enzima se une a partir de un procedimiento
de inmovilización a un electrodo selectivo de iones. Esto detectará la presencia del
sustrato o el producto de la reacción enzimática. Un ejemplo sería la asociación de
ureasa con un electrodo de amonio, de tal manera que la concentración de una
solución de urea se pueda determinar a partir del ión amonio liberado cuando se
hidroliza la urea.
Una gran cantidad de electrodos enzimáticos se han basado en un electrodo
de oxígeno combinado con reacciones redox enzimáticas. Un ejemplo es la
determinación de glucosa con la enzima glucosa oxidasa:
A medida que avanza la reacción, la concentración de oxígeno cae y esta
variación puede ser detectada continuamente por el electrodo. En la práctica, esta
respuesta puede verse modificada por algunos factores externos que inciden en el
tiempo necesario, es decir, cuando la velocidad de acceso del sustrato a la enzima
y la velocidad de consumo son iguales. En general, este punto se alcanza entre 30
segundos y 10 minutos.
Los transductores utilizados en los electrodos enzimáticos son de dos tipos:
potenciométricos y amperiométricos.
Potenciómetros
Transductores potenciométricos, por ejemplo, el electrodo de pH de vidrio,
determine el potencial entre un electrodo de referencia y un electrodo sensor. Dado
que el pH afecta la cinética de las enzimas, está claro que este no es un parámetro
de medición ideal. A medida que cambia el pH debido a la reacción enzimática, la
actividad catalítica de la enzima también variará, provocando así una respuesta no
lineal de la sonda con la concentración. Para evitar dicha interferencia, la
selectividad del electrodo contra los iones se modifica utilizando, por ejemplo, NH +
o K + que 4son más adecuados para su uso en una sonda enzimática. Las
consideraciones teóricas indican que la respuesta de un electrodo enzimático se
modificará con variaciones en la temperatura externa. La respuesta de un electrodo
de vidrio está bien caracterizada y la mayoría permite la compensación de
temperatura. Todavía,
Amperométrico
La segunda categoría de electrodos es del tipo amperométrico. El ejemplo
más común es el electrodo de oxígeno Clark. Se basa en un cátodo de platino (4H
+ + 4e- + O2 2H2O) y un ánodo de plata (4Ag + 4Cl- 4AgCl + 4e-) sumergidos
en la misma solución de cloruro de potasio, pero separados de la muestra por una
membrana. Al aplicar un potencial de 0,5 a 0,8 V entre los dos electrodos, la
corriente generada es proporcional a la concentración de sustrato en la muestra.
225
En el caso de los transductores potenciométricos, el potencial se mide
mediante un circuito de alta impedancia y, por tanto, no hay corriente y no se
consume sustrato o producto. En el caso del electrodo amperométrico de oxígeno,
el sustrato de la reacción enzimática debe ser cambiado por las reacciones redox
que ocurren en el electrodo.
Los procesos de transferencia que pueden modificar el comportamiento del
electrodo son:
[S] difusión en solución [S] superficie del electrodo
[S] superficie del electrodo difusión interna [S] enzima
Estos procesos describen el transporte del sustrato. El consumo del sustrato

se puede describir en términos de cinética enzimática y, en el caso de electrodos
amperométricos, de la reacción en su superficie.
Los efectos de la resistencia a la difusión se pueden considerar a través de la
transferencia de masa con reacción química, de manera similar a lo que ocurre en
los reactores con enzima inmovilizada. En la práctica, los factores que afectan la
aplicabilidad de la sonda son:
 Tiempo de respuesta: refleja el
tiempo necesario para equilibrar la
transferencia de masa mediante la
eliminación catalítica;
 Tiempo de lavado: es el tiempo
necesario para que la respuesta de
la sonda vuelva a su nivel basal en
una solución sin sustrato;
Rango de linealidad: viene dado
por la KM de la enzima. A
concentraciones significativamente
más bajas que el KM, la respuesta
de la sonda será de primer orden y,
por lo tanto, lineal. A medida que
aumenta la concentración y la
enzima se satura, la cinética se
vuelve de orden cero y aparece la
no linealidad.
Como la resistencia a la transferencia de masa es importante, entonces la
concentración de sustrato en la superficie de la enzima inmovilizada será menor
que en solución y aumentará el rango de linealidad efectiva. Sin embargo, aunque
los efectos de la transferencia de masa pueden extender este rango, la ventaja
obtenida se puede anular aumentando el tiempo de respuesta y el tiempo de lavado
requerido, lo que limitará la velocidad de determinación de la muestra.
20.3.2.2 - Termistores de enzimas

Esta técnica se ha desarrollado a partir de la investigación en
microcalorimetría. Los primeros sistemas eran análogos al reactor enzimático
discutido anteriormente. En este caso, una reacción exotérmica es catalizada por
226
una enzima inmovilizada y el calor desarrollado se determina midiendo la variación
de temperatura del fluido de reacción. Estos sensores eran muy sensibles pero
tenían una respuesta lenta. El desarrollo de termistores basados en materiales
semiconductores, que muestran un gran cambio de resistencia al variar la
temperatura, ha permitido la miniaturización de microcalorímetros basados en
enzimas y ha llevado al concepto de termistor enzimático.
227
En estos dispositivos, se construye una columna de enzima inmovilizada bien
aislada y se monta un termistor en el centro del material de empaque de la
columna. Este transductor es sensible a cambios de temperatura extremadamente
pequeños que se reflejan en variaciones de impedancia. Los estudios muestran que
aproximadamente la mitad del calor generado como resultado de una reacción
enzimática se puede registrar como un cambio de temperatura. Normalmente se
obtienen variaciones entre 0,004 y 1,0oC, que se encuentran dentro del rango de
sensibilidad del detector.
El mayor problema experimental asociado con el uso de termistores
enzimáticos es la necesidad de minimizar las fluctuaciones en la temperatura
externa. El uso de baños de agua y revestimientos aislantes suele ser suficiente.
Sin embargo, en algunos casos, el uso de un termistor de referencia permite una
mayor sensibilidad.
Los sistemas de termistor enzimático se han utilizado en una amplia gama de
ensayos, pero, obviamente, su aplicabilidad depende en cierta medida de la
variación de entalpía asociada con la reacción (Tabla 4).
Tabla 4 - Encefalias molares de algunas reacciones catalizadas por enzimas

Enzima Sustrato -H (KJ. Mol-
1)
Catalasa Peroxido de hidrogeno 100,4
Colesterol oxidasa Colesterol 52,9
Glucosa oxidasa Glucosa 80,0
Hexoquinasa Glucosa 27,6
Lactato Piruvato de sodio 62,1
deshidrogenasa
Tripsina Benzoil-L-arginina-amida 27,8
Ureasa Urea 6.6
Uricase Urato 49,1
20.3.2.3 - Biosensores colorimétricos

El principio de este biosensor es cambiar las propiedades ópticas de ciertas
sustancias mediante reacciones enzimáticas o microbiológicas, y la luz emitida por
estos componentes biológicos o su respuesta a la iluminación puede controlarse
convenientemente a través del elemento fotosensor. (Figura 5)
Unidad
detección Intensidad
Fuent óptica
e de
luz
Luz Ángulo
polarizado Luz
reflejad Signo de
Prisma o Resonancia
Sensor
Hora
Sensorgrama
Canal de flujo
Figura 5 - Biosensores ópticos de resonancia de plasma de superficie aplicados a inmunosensores

228
La Tabla 5 presenta las ventajas y desventajas obtenidas con este tipo de
sensores.
Tabla 5 - Ventajas y desventajas de los biosensores enzimáticos ópticos

Simple, fácil de fabricar y flexible Interferencia de la luz ambiental
No sufra interferencias eléctricas Rango dinámico limitado
La enzima no necesita estar en contacto Estabilidad del bioagente afectada por la
directo con el transductor. temperatura, la intensidad y la duración de la luz.
incidente
Más seguro cuando se usa "in vivo" En algunos casos, tiempo de respuesta lento
Estable y resistente a la corrosión.
Detección de armas químicas y biológicas

El uso de armas químicas a gran escala ocurrió durante la Primera y Segunda
Guerra Mundial. Durante muchos años, continuaron siendo producidos por los Estados
Unidos y la ex Unión Soviética, sirviendo en la Guerra de Vietnam, Yemen e Irán-Irak en
la década de 1980. Durante la Guerra del Golfo en 1991, se comenzaron a adoptar métodos
defensivos, como trajes de protección especiales, botas, guantes y respiradores.
En 1995, hubo un ataque terrorista con gas sarín en el metro de Tokio, y
recientemente, en 2001, se enviaron cartas con ántrax a varios lugares de Estados Unidos.
Esto demuestra lo importante que es desarrollar formas de tratamiento y métodos de
detección rápidos, para no amenazar la civilización humana.
Los métodos de detección de armas químicas utilizaron biosensores enzimáticos,
basados en la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa, un ejemplo es el NAIAD
(Detector y Alarma de Enzima Inmovilizada de Agente Nervioso Nivel 3), que es un
sistema de alarma automático que monitorea continuamente la atmósfera circundante, para
proporcionar Advertencias sonoras o visuales de la presencia de agentes nerviosos en
forma de aerosol o vapor. Algunas sustancias pueden actuar como interferentes: pesticidas,
humo de cigarrillo y altas concentraciones de Cl2, NO2 y SO2.
Otros, como el M256A1 y el RVD (Detector de Vapor Residual) utilizaron kits de
reactivos, tarjetas de papel y detectores con la enzima, que un cambio de color indica la
presencia o ausencia de agentes nerviosos. Los problemas, en el caso de M256A1, son el
tiempo de respuesta (20 minutos para dar como resultado la tinción) y la falta de
discriminación del agente nervioso; y en relación al RVD, es la interferencia (aceites
lubricantes e hidrocarburos aerosolizados), además de la determinación de agentes
nerviosos o gas mostaza, que debe hacerse de uno en uno.
El biosensor LLC (Agentasa) se basa en el acoplamiento de la actividad hidrolítica
de la acetilcolinesterasa con la hidrólisis biocatalítica de la urea, siendo resistente a
variaciones de pH, pero si se inhibe una de las enzimas se destruye el control del pH. Está
compuesto por acetilcolina, acetilcolinesterasa, urea y ureasa en un polímero con indicador
colorimétrico de pH. Sus ventajas son el desarrollo de señales rápidas; respuestas fuertes e
intuitivas; y alta resistencia a la interferencia de temperatura.
Para la detección de armas biológicas, se desarrollaron sensores de oro junto con
enzimas para monitorear el aire, o plantas que se vuelven fluorescentes con la presencia de
un agente biológico. 223
20.4 - REFERENCIAS
― AZEVEDO, AM; PRAZERES, DMF; CABRAL, JMS; FONSECA, LP; Biosensores de etanol
a base de alcohol oxidasa. Biosensores y bioeletrónica, 21, 235-247, 2005.
― BINDER, P.; ATTRE, O.; BOUTIN, JP; CAVALLO, JD; DEBORD, T.; JOUAN, A.; VIDAL, D.;
Gestión médica de la guerra biológica y el bioterrorismo: lugar de la inmunoprevención y la
inmunoterapia. Inmunología comparada, microbiología y enfermedades infecciosas, 26, 401-421,
2003.
― ECONOMOU, A.; Análisis de inyección secuencial (SIA): una herramienta útil para la manipulación y
el pretratamiento de muestras en línea. Tendencias en química analítica, 24 (5), 416-425, 2005.
― EVISON, D.; HINSLEY, D.; ARROZ, P.; Armas químicas. British Medical Journal, 324, 332-335,
2002.
― GIRELLI, AM; MATTEI, E.; Aplicación del reactor enzimático inmovilizado en cromatografía líquida
de alta resolución en línea: una revisión. Revista de cromatografía B, 819, 3-16, 2005.
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biotecnología. Revista de Ciencias de la Ingeniería y Educación, 41-48, febrero de 1994.
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997-1020, 2002.
― LIN, J.; JU, H.; Inmunosensores electroquímicos y quimioluminiscentes para marcadores tumorales.
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potencialidades y aplicaciones. Analytica Chimica Acta, 499, 29-40, 2003.
― McCARTHY, M.; El ejército estadounidense se prepara para que Irak utilice armas químicas y biológicas. La
lanceta,
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revisión. Tendencias en química analítica, 21 (2), 96-115, 2002.
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Anesthesia & Critical Care, 14, 149-154, 2003.
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biológica utilizando un instrumento que emplea un sensor potenciométrico direccionable de luz y un
sistema de ensayo de enzimas de inmunofiltración de flujo continuo. Biosensores y bioeletrónica, 14,
761-770, 2000.
― VO-DIHN, T.; CULLUM, B.; Biosensores y biochips: avances en el diagnóstico biológico y médico.
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http://www.afsni.ac.uk/images/CSBSlide7.jpg
http://www.flowinjection.com/Brochures/fialab3000.htm
http://www.sci.monash.edu.au/wsc/fia/developments.html
224
CAPÍTULO 21 - ENZIMAS EN INGENIERÍA GENÉTICA
21.1 - INGENIERÍA GENÉTICA O TECNOLOGIA DE ADN RECOMBINANTE
La Ingeniería Genética o Tecnología de ADN Recombinante es un conjunto de
técnicas que permite la identificación, aislamiento y multiplicación de genes de cualquier
organismo. Por tanto, incluye métodos que conducen a nuevas combinaciones de
material genético y a la reinserción y multiplicación de moléculas de ácido nucleico en un
nuevo entorno celular.
Moléculas de ADN están constituidos por dos cadenas de polinucleótidos
(secuencias repetitivas de nucleótidos o bases nitrogenadas) que adaptan una estructura
en doble hélice. Estas dos cadenas están asociadas mediante la formación de enlaces
de hidrógeno entre las bases nitrogenadas constituyentes: guanina (G) con citosina (C);
adenina (A) con timina (T). Este emparejamiento de bases forma la base de la
complementariedad del ADN - dos hebras orientadas en direcciones opuestas -
antiparalelo. (Figura 1)
Figura 1 - Moléculas de ADN: formación de pares de bases y estructura de doble hélice
La ingeniería genética tuvo su origen a finales de los 60 y principios de los 80

70. En experimentos con bacterias, virus y pequeñas moléculas circulares de ADN
presentes en bacterias (plásmidos), se identificó su "herramienta" primaria y fundamental.
Esto permite la identificación de genes o secuencias específicas, su aislamiento del
genoma de un organismo, su clonación para obtener un gran número de copias, el
análisis y modificación de esa copia y su reinserción en el genoma del organismo original
o en un organismo diferente. (Figura 2)
Un ejemplo de esta aplicación sería el aislamiento, extracción e injerto del gen
humano para la producción de insulina en bacterias de la especie Escherichia coli. Estas
bacterias, que contienen el gen humano, se multiplican cuando se cultivan en
laboratorios, produciendo insulina, que actualmente se lleva a cabo a gran escala.
Transferencia de
nuevos genes en Drogas
organismos anticáncer
animales
Cultivos de Diagnóstico
hortalizas
de una sola
celda
Cultivo Anticuerpos
de células monoclonicos
Biología
Resolució Molecular
n de
delitos Trazadores
Tecnología ADN Ingenieria
Genética
Bancos Síntesis de sondas
ADN, ARN Síntesis Clonació ADN
y proteinas de n específico
nuevos
proteinas
Mapa completo Producción Localizació
Nuevas especies masiva de n
del proteínas de trastornos
genoma animales genético
humano humanas
y
verdura
s
Nuevos
tipos de
comida Nuevo
Terapia de
antibioticos
genes
Figura 2 - Enfoques y aplicaciones de la ingeniería genética
Esta estrategia es factible dada la existencia de enzimas capaces de “escindir” el

ADN en puntos específicos, es decir, las enzimas reconocen lugares donde hay ciertas
secuencias de bases nitrogenadas y rompen los enlaces en lugares que siempre son los
mismos. Estas enzimas se denominan enzimas de restricción. Usando enzimas como
estas, puede cortar segmentos de ADN que contienen información para la síntesis de
una proteína en particular. Con esta técnica es posible aislar fragmentos de ADN con
genes elegidos, por ejemplo, el gen responsable de la síntesis de insulina.
No hace mucho, se sacrificó a más de 50 cerdos para que un diabético pudiera
sobrevivir durante un año. En la década de 1970, la OMS advirtió que la insulina derivada
de los cerdos no sería suficiente en poco tiempo. Desde 1982, ha surgido una alternativa:
la insulina humana producida por ingeniería genética. Hoy en día, más del 90% de los
diabéticos son tratados con él. Se tolera mejor, provoca menos efectos secundarios, se
puede producir en grandes cantidades y ya no provoca la muerte de los cerdos.
226
21.2 - TÉCNICAS DE CLONACIÓN MOLECULAR
Se injerta un fragmento extraño de ADN en un plásmido bacteriano. El gen a
injertar puede obtenerse de animales, plantas o prepararse en el laboratorio (obtenido
mediante el uso de enzimas de restricción).
Tanto el plásmido como la pieza de ADN a injertar deben someterse a la misma
enzima de restricción, que los cortará en regiones con la misma secuencia, para formar
cabos sueltos complementarios que se puedan soldar. En la soldadura, también se
utilizan enzimas de restricción de ADN ligasa. El resultado es ADN recombinante (una
molécula híbrida obtenida al unir ADN de fuentes biológicamente diferentes) compuesto
por el plásmido y el gen recién injertado.
El ADN obtenido debe producirse en grandes cantidades, de modo que esté
disponible para ser insertado en el plásmido. Un procedimiento habitual es la técnica de
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa = Reacción en Cadena de la Polimerasa),
donde a partir de muestras mínimas de ADN molde a copiar, extraídas de pequeñas
cantidades de material (sangre, piel, plantas, etc.), se utilizaron pequeños cebadores; Los
nucleótidos y la enzima ADN polimerasa emplean un mecanismo cíclico y automático,
que permite la producción de múltiples copias del segmento inicial. El propósito de la
PCR es obtener copias de un ADN determinado (figura 3).
EcoRI promueve la
formación de
extremidades cohesivas
Uniendo los fragmentos

con la ADN ligasa
Figura 3 - Ejemplo de ADN recombinante
227
Una vez que se preparan los plásmidos, la tarea es insertarlos en las células. Los
plásmidos y las células se ponen en contacto entre sí. Sin embargo, solo unas pocas
células pueden absorber el nuevo plásmido, por lo que ahora es necesario seleccionar de
la población celular aquellas que realmente incorporaron el plásmido con el nuevo gen.
Algunos plásmidos de bacterias portan naturalmente genes que confieren
resistencia a un determinado antibiótico. Los investigadores eligen plásmidos que ya
tienen el gen de resistencia a los antibióticos para la técnica del ADN recombinante.
Luego, estos plásmidos se abren y se incrustan los genes que se van a injertar.
Estos plásmidos se ponen en contacto con bacterias sensibles a los antibióticos, algunas
de las cuales los incorporan.
Para seleccionar las bacterias que ganaron el nuevo plásmido, se agrega el
antibiótico al medio de cultivo. Todas las bacterias sin el plásmido mueren porque no son
resistentes al antibiótico, quedando solo aquellas que tienen el plásmido con el nuevo
gen.
Figura 4 - Clonación molecular
228
La primera vez que una proteína humana fue sintetizada por una bacteria
transformada fue en 1977. Un segmento de ADN de 60 pares de bases, que contenía el
código para la síntesis de somatotropina (hormona del crecimiento), se ligó a un plásmido
y se introdujo en una bacteria, a partir de la cual se obtuvieron clones capaces de
producir somatotropina.
Otros genes que codifican proteínas de interés médico se han trasplantado a
bacterias. Ya es posible introducir genes humanos que codifican la insulina y la hormona
del crecimiento en bacterias, que comienzan a producir estas sustancias.
21.3 - PLASMIDA, OBTENCIÓN DE GENES Y ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
21.3.1 - Plásmido bacteriano

Las bacterias, en particular Escherichia coli, constituyen uno de los principales
materiales biológicos utilizados en la tecnología del ADN recombinante y también se
denominan vector. Esto se debe a varios factores:
 Ciclo de vida rápido en relación con organismos superiores (tiempo de
duplicación celular de aproximadamente 20 minutos);
 Cultivo de una gran cantidad de
individuos en un espacio reducido;
 Tiene un número menor de genes en
relación con los organismos superiores;
 División celular por fisión binaria.
Además del ADN cromosómico, la célula bacteriana contiene pequeñas moléculas
de ADN circular llamadas PLASMIDOS. Estos mantienen una existencia independiente
del cromosoma; sin embargo, su duplicación está sincronizada con la de la bacteria,
garantizando así su transmisión a la bacteria hija.
En ingeniería genética, los genes "extraños" a las bacterias pueden incorporarse a
sus plásmidos y, por lo tanto, estas bacterias comienzan a producir las proteínas que
estos genes codifican. Ciertos plásmidos tienen genes responsables de la síntesis de
enzimas que destruyen un antibiótico incluso antes de que dañe las bacterias. Los
plásmidos portadores de genes que confieren resistencia a los fármacos se denominan
PLASMIDOS R (R = Resistencia). También tienen genes que les permiten pasar de una
bacteria a otra (RTF = Factor de transferencia de resistencia).
Cuando dos o más tipos de plásmidos R están presentes en la misma bacteria, los
genes de uno de ellos pueden transmitirse al otro. Este mecanismo hace que aparezcan
plásmidos R muy complejos, portadores de varios genes de resistencia a diferentes
antibióticos. Esta propiedad de los genes para que la resistencia a los antibióticos pase
de una molécula de ADN a otra ha llevado a los científicos a clasificarlos como
transposones o genes saltarines. Además de los plásmidos, también son útiles otros
vectores en la tecnología del ADN recombinante, como los virus y los liposomas.
229
Figura 5 - Plásmido bacteriano
21.3.2 - Obtención de genes para injerto
En realidad, hay tres formas fundamentales de obtener genes para injertos:

 Uso de una "biblioteca" de genes:
una colección de una gran cantidad de
fragmentos de ADN del genoma
obtenidos con la aplicación de
enzimas de restricción. Cada
fragmento, que contiene solo un gen,
se inserta en un vector, que puede ser
un plásmido bacteriano o un fago
(figura 6a)
 Obtención del gen en el laboratorio a partir del ARN mensajero - el ARN
mensajero responsable de codificar una proteína determinada. Se utiliza para
producir un segmento de ADN con una secuencia complementaria. Este ADN, por
supuesto, tendrá una secuencia idéntica a la del gen que originalmente produjo el
ARN mensajero. Una de las ventajas de esta técnica es el uso de una enzima
llamada transcriptasa inversa, que permite la producción de ADN a partir de una
molécula de ARN. El ADN así producido se denomina ADNc o ADN complementario.
(figura 6b)
 Síntesis del gen, nucleótido a nucleótido, en la secuencia deseada. Eso es
normalmente se hace para genes que codifican polipéptidos o proteínas de pequeño
tamaño. Supongamos que conocemos la secuencia de aminoácidos de un pequeño
polipéptido. Cada aminoácido está codificado por una secuencia de tres nucleótidos
de ADN, denominada codón. Simplemente use la tabla de códigos correspondiente
para construir una secuencia de nucleótidos que coincida exactamente con la
secuencia de aminoácidos de la proteína.
230
El genoma que se
mantendrá en la
biblioteca se corta
con enzimas de
Plásmido restricción
recombinante O
ADN
fago
recombinante
Vector
Fagos
Clonado
Biblioteca de plásmidos Biblioteca de fagos
Figura 6 - (a) Biblioteca de genes y (b) síntesis de ADN a partir de ARN
21.3.3 - Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción fueron descubiertas por Hamilton Smith, Daniel
Nathans y Werner Arber, quienes recibieron el Premio Nobel de Medicina y Fisiología en
1978 por este descubrimiento. Son proteínas que se encuentran en muchos
microorganismos y se utilizan ampliamente en ingeniería genética para producir
fragmentos de ADN con extremos conocidos. Cada bacteria tiene sus propias enzimas
de restricción y cada enzima reconoce solo un tipo de secuencia, independientemente de
la fuente del ADN, y rompe la molécula cuando encuentra esa secuencia.
Estas enzimas se obtienen de bacterias que las producen de forma natural para
defenderse de la invasión de algunos virus. Esto es posible debido a la propiedad que
tienen estas enzimas de romper el ADN bicatenario (virus) del invasor en ciertos puntos
específicos. Por lo tanto, cada tipo de enzima de restricción corta una región específica
de ADN (figura 7). Esto puede verse como un sistema de defensa bacteriano que
degrada el material genético que le es extraño. Esto se llama "RESTRICCIÓN".
Las enzimas de restricción se dividen en varias clases, según la estructura, la
actividad y los sitios de reconocimiento y escisión. Actualmente, se han identificado más
de 1000 enzimas de restricción. La nomenclatura desarrollada se basó en la abreviatura
del nombre del microorganismo del que se aisló la enzima. La primera letra representa el
género y las otras dos la especie, seguida de un número romano (u otra letra) que indica
el orden del descubrimiento o el linaje del que se aisló.
Por ejemplo, la enzima de restricción llamada EcoRI se purifica a partir de una
Escherichia coli que porta un factor de transferencia de resistencia RI, mientras que Hind
III se aísla de Haemophilus influenzae, línea d III.
231
Figura 7 - Modo de acción de una enzima de restricción.
El interés por estas enzimas de restricción aumentó en 1973 cuando se dio cuenta
de que podían usarse para fragmentar el material genético dejando libres los extremos
de las hebras para poder conectarse, en tubos de ensayo, con material genético humano
o cualquier otra especie. abriendo un inmenso abanico de posibilidades.
Una consecuencia importante de la especificidad de estas enzimas de restricción
es que se define el número de escisiones que realiza cada una de ellas en el material
genético de cualquier organismo y permite el aislamiento de fragmentos de este material
genético. Por lo tanto, cada enzima de restricción genera una familia única de fragmentos
cuando escinde un material genético específico. Las enzimas de restricción se
denominan:
 Enzimas de restricción de tipo I, II y III - Las enzimas de restricción de tipo II
reconocen secuencias de nucleótidos de ADN específicas (palíndromos - secuencia
simétrica de letras - ejemplo usando el alfabeto SUBINOONIBUS) y actúan como
verdaderas tijeras moleculares. Pueden escindir el ADN produciendo: terminales
adhesivos, terminales abruptos o ciegos. Estas enzimas se denominan
endonucleasas de restricción (cortan moléculas de ADN en correspondencia con una
secuencia de bases especificadas por el reconocimiento de metilaciones a lo largo de
la cadena de ADN, lo que proporciona un aislamiento genético específico) (Figura 8).
 Enzimas de metilación, cuyo objetivo
son secuencias especiales de
nucleótidos de ADN (palíndromos)
que marcan la herencia genética
celular, también se denominan ligasas
de ADN y actúan en los extremos de
los ADN, uniendo piezas para la
construcción de una molécula de ADN
recombinante.
La disponibilidad de una amplia variedad de endonucleasas de restricción de clase
II (enzimas que se expresan como dos proteínas simples de dos genes diferentes, con
232
actividad dependiente de los iones Mg2 +) y ADN metiltransferasas, junto con diferentes
secuencias específicas, forman los requisitos previos para los recombinantes. Tecnología
de ADN.
233
Las aplicaciones analíticas de estas enzimas se pueden describir como:
1. Análisis molecular de la estructura del cromosoma y del genoma (mapeo, grado de
metilación);
Ejemplo: Uso de sondas (secuencias de ADN complementarias) que reconocen
pequeñas secuencias repetidas de nucleótidos distribuidas por todo el ADN de un
organismo. Llamados minisatélites, se encuentran fuera de los genes y tienen un patrón
característico de distribución en cada individuo, constituyendo una verdadera “huella” de
ADN (de ahí su nombre en inglés, DNA-fingerprint). A través de las sondas, que están
marcadas con compuestos radiactivos o tintes sensibles a la fluorescencia, se realizan
pruebas de paternidad o identificación delictivas de alta precisión.
2. Caracterización de la manifestación fenotípica o de los defectos genéticos heredados
latentes a nivel del ADN (análisis de la longitud del fragmento de restricción del
polimorfismo);
Ejemplo: Localización de genes asociados a enfermedades genéticas, mediante
secuencias de ADN marcadas complementarias que reconocen estos genes, permitiendo
la identificación de portadores de la enfermedad. Estas pruebas se pueden realizar en la
fase prenatal, para detectar enfermedades genéticas en el embrión.
Figura 8 - Papel de la enzima de restricción en la clonación de genes eucariotas en plásmidos bacterianos.
234
3. Evidencia de degeneración celular en las primeras etapas al alterar ciertos sitios de
restricción;
Ejemplo: Detección de genes relacionados con el desarrollo de ciertos tumores, como
el retinoblastoma (tumor ocular) y ciertos tipos de cáncer de mama.
4. Taxonomía de virus y otras enfermedades causadas por organismos mediante
correlación de los perfiles característicos de los fragmentos;
5. Relaciones filogenéticas mediante la comparación de sitios de restricción
seleccionados en genes esenciales, como el gen de la hemoglobina.
21.4 - ENZIMAS MODIFICADORAS DE ADN O ARN (PRODUCCIÓN HÍBRIDA)

Además, las enzimas modificadoras de ADN o ARN son herramientas esenciales
para la técnica de clonación. Esta técnica permite la multiplicación idéntica de genes y
fragmentos específicos en las células hospedadoras apropiadas para aumentar el
número de copias. A partir de estas células superproductoras, las secuencias
codificantes de ADN y las proteínas correspondientes obtenidas después de la expresión
pueden aislarse posteriormente en grandes cantidades y con alta pureza.
El aislamiento tanto de fragmentos genéticos específicos como de secuencias
reguladoras se logra fragmentando el ADN con endonucleasas de clase II con una
secuencia específica. Esto requiere que el gen estructural y los elementos reguladores se
puedan eliminar del cromosoma en posiciones específicas de los nucleótidos.
El cDNA (DNA complementario) o fragmentos del genoma obtenidos por la acción
de endonucleasas de restricción pueden ser modificados luego por enzimas que actúan
bajo la molécula de DNA, como exonucleasas, quinasas o fosfatasas. Los terminales de
los fragmentos también se pueden alterar en la especificidad de su secuencia mediante
la adhesión de oligonucleótidos sintéticos (ligandos o adaptadores).
Con la ayuda de la ADN ligasa T4, los fragmentos aislados obtenidos por las
endonucleasas de restricción se insertan en vehículos de clonación (vectores). Estos
vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos circulares extracromosómicos, derivados
apropiados de virus o bacteriófagos específicos (Figura 9).
Las moléculas quiméricas así obtenidas (ADN recombinante) se introducen en las
nuevas células hospedadoras, como procariotas (Escherichia coli) o eucariotas
(Saccharomyces cereviseae, Picchia Pastoris, etc.) de fácil cultivo. Todos los vectores
llevan el "elemento original", es decir, la secuencia de ADN para la replicación autónoma
del ADN híbrido. El crecimiento de las células huésped en condiciones selectivas (por
ejemplo, medios de cultivo que contienen antibióticos específicos) asegura que solo se
replicarán los microorganismos transformados. Las células que no han retenido las
moléculas de ADN recombinante mueren después de un corto tiempo en este ambiente
selectivo.
De esta forma, sólo crecen células modificadas y los vectores introducidos (en
consecuencia, los fragmentos de ADN insertados) se amplifican de forma idéntica de
forma selectiva para diferentes números de copias, dependiendo de la naturaleza del
vector utilizado. El fragmento de ADN que contiene el gen a amplificar se puede
caracterizar mediante secuenciación y mapeo físico.
235
Preparación que contiene fragmentos de vector clonables
genómica
Digestión con Endonucleasas Linealización con nucleasa

en restricción restricción
Fosfatasa alcalina (desfosforilación del vector)

Transferasa terminal (ajustar el contenido de G / C)
ADN ligasa T4 (adaptación de ligando)
ADN polimerasa T4
Nucleasa S1para y ordenar usted
Nucleasa Bal31terminals de fragmentos de
exonucleasa III
Unión de ADN al vector por

la ligasa de ADN T4
Figura 9 - Esquema simplificado de producción híbrida.
21.5 - APLICACIONES DE LA TÉCNICA DEL ADN RECOMBINANTE
21.5.1 - Terapia de genes

Los efectos de una enfermedad genética llamada inmunodeficiencia combinada
grave vinculada al cromosoma X (SCID) se han revertido mediante la terapia génica. Los
pacientes que padecen esta enfermedad, denominada SCID, se ven obligados a vivir en
ambientes completamente aislados (como en la película "El niño de la burbuja de
plástico"), porque el sistema inmunológico no defiende al organismo de las infecciones.
En el caso de los bebés de la investigación, la enfermedad impidió la producción de
glóbulos blancos por la médula ósea.
Metodología
Los investigadores extrajeron del
virus los genes que lo hacían capaz de
causar enfermedades. En su lugar se
insertó el gen de la medicina, es decir,
uno que produjera correctamente la
proteína defectuosa y que corrigiera el
problema en las células.
 El virus modificado se mezcló con células madre de médula ósea extraídas de
los bebés. El virus infecta células y transmite genes terapéuticos.
236
 Con el gen terapéutico, las células
madre comienzan a producir la
proteína responsable de la
estimulación de las células de defensa,
haciendo que se desarrollen, crezcan y
se extiendan por todo el cuerpo,
destruyendo a los invasores.
237
Otros ejemplos: En 1990, se realizó la primera terapia celular genéticamente
modificada en un niño de 4 años con deficiencia de adenosina desaminasa (ADA).
Utilizaron los propios linfocitos del paciente donde insertaron una copia funcional del gen
defectuoso.
La terapia génica se ha utilizado para corregir enfermedades genéticas
(introduciendo genes para corregir distorsiones existentes) o para tratar el cáncer
(utilizando genes que bloquean el crecimiento tumoral o incluso inducen la formación de
antígenos, estimulando el rechazo tumoral por parte del organismo) (figura 10).
Figura 10 - Terapia de genes
21.5.2 - Producción de medicamentos

Al pensar en los animales como posibles fábricas de proteínas, el ejemplo de la
insulina es el más conocido. Sin embargo, los científicos canadienses han logrado
transformar las vesículas seminales de las ratas en "biorreactores" (fábricas biológicas de
sustancias de interés). Para probar la viabilidad de la técnica, se eligió la proteína hGH
(hormona del crecimiento humano).
Metodología
 Para ensamblar el "gen artificial", además de la secuencia de bases que
contiene las instrucciones para producir hGH, también se utilizó un promotor (una
secuencia de ADN especial que indica en qué tipo de tejido u órgano debe actuar
el gen).
El ADN construido (transgén) se
microinyectó en varios embriones de
ratón. Luego, se produjeron animales
transgénicos que producían hGH en su
semen.
 El siguiente paso fue producir hormona del crecimiento (hGH) en el líquido
seminal del cerdo, dado que este animal eyacula el mayor volumen de líquido
seminal entre todos los animales domésticos.
Otros ejemplos: Producción de vacunas utilizando un virus inofensivo para el
hombre y otro portador de un gen responsable de la producción de un antígeno idéntico
238
al de un agente infeccioso. El antígeno no causa la enfermedad, pero estimula la
producción de anticuerpos específicos que inmunizan al cuerpo contra el agente.
239
Agentes antitumorales, reactivos de diagnóstico, nuevos fármacos, etc. también utilizan
los mismos mecanismos de contratación (Cuadro 1).
Tabla 1 - Tipos de fármacos producidos genéticamente

Producto Solicitud
Activador de plasminógeno tisular Disuelve los coágulos de sangre en caso de infarto u
obstrucción arterial. Previene la trombosis.
Eritropoyetina Estimula la producción de glóbulos rojos en el tratamiento
de la anemia.
Factor de crecimiento de la Acelera el proceso de cicatrización de heridas y
epidermis quemaduras utilizado también en el tratamiento de
úlceras gástricas
Factor natriurético auricular Vasodilatador y diurético
Factor VIII Promueve la coagulación de la sangre en el tratamiento
de la hemofilia.
Hormona del crecimiento humano Promueve el crecimiento óseo y muscular en el
enanismo hipofisario
Hormona de fertilización Tratamiento de infertilidad
(Estimulación folicular, luteína,
goanadotropina coriónica)
Inhibidor de renina Presión sanguínea baja
Insulina Permite la absorción de glucosa en el tratamiento de la
diabetes.
Interferón Destruye algunos tipos de células tumorales y virus.
Proteína tensioactiva pulmonar Ayuda a expandir los pulmones en niños con síndrome de
estrés respiratorio
Somatostatina Disminución del crecimiento muscular y óseo en el
gigantismo pituitario.
Superóxido dismutasa Evita las secuelas en el músculo cardíaco después de un
ataque cardíaco
21.5.3 - Agricultura y Ganadería

En la década de 1940, la Biotecnología clásica atrajo el espíritu emprendedor de
científicos de la Universidad de Viçosa, Minas Gerais, quienes fundaron una empresa
pionera, Sementes Agroceres, con el objetivo de producir semillas de maíz híbrido a
partir de material genético seleccionado en el país.
Brasil Sul Agropecuária, en los años 60, se dedicó a la producción y selección de
semillas forrajeras ya la investigación genética para obtener híbridos de sorgo granífero
forrajero y maíz dulce para consumo humano. Agroflora Reflorestamento e Agropecuária,
dedicada a la investigación y producción de semillas mejoradas y a la selección de
variedades vegetales adaptadas a diferentes condiciones estacionales.
Hoy en día ya se encuentra la producción por vía genética de bioinsecticidas
(bacterias recombinantes que producen toxinas contra los parásitos de las plantas);
bacterias modificadas para aumentar la resistencia de las plantas al frío; plantas
modificadas con gen de resistencia a herbicidas (permite que, cuando se disemina el
herbicida, solo se extermine la vegetación dañina y no la portadora del gen de
resistencia); mejora genética de las plantas con el fin de añadir características
nutricionales (que
240
de lo contrario, no serían producidos por la naturaleza); plantas más resistentes a ciertos
tipos de insectos, introduciéndoles el gen de una bacteria que produce una proteína
(protoxina) que en condiciones normales es inofensiva, pero una vez digerida por el
insecto se convierte en un veneno mortal.
Ejemplos:
Tabaco luciérnaga
Los científicos pudieron hacer copias del gen que guía la síntesis de la
enzima luciferasa, que se encuentra en las luciérnagas. Esta enzima actúa
sobre una sustancia llamada luciferina y, en presencia de oxígeno y ATP,
provoca la emisión de luz en estos insectos. El gen se insertó en células
embrionarias de plantas de tabaco. Después del crecimiento, el spray de
luciferina promovió un espectáculo maravilloso: las plantas de tabaco
emitían luz.
Patata resistente a hongos
Se produjo la papa transgénica (de genes de abejas y polillas) resistente al

hongo causante de la peste que diezmó las plantaciones de papa en
Irlanda en 1840. Pruebas preliminares, realizadas en ratas, demostraron
que las sustancias derivadas de estos genes son inocuas. Pero persiste la
preocupación por sus efectos ambientales.
El arroz dorado
Ingo Potrykus, investigador del Instituto Federal de Tecnología de
Suiza, produjo arroz transgénico, con betacaroteno (precursor de
la vitamina A) en el endospermo de las semillas, a partir de genes
de la planta narciso y la bacteria Erwinia. El “arroz dorado”
beneficia directamente al consumidor: es necesario recordar que
alrededor de 1 millón de niños mueren cada año por deficiencia
de vitamina A, y unos 350 mil quedan ciegos.
Soja transgénica
La soja transgénica Roundup-Ready, resistente al herbicida

Roundup, es producida por la multinacional Monsanto. La principal
ventaja es que el herbicida comenzaría a afectar solo las malezas
que dañan las plantaciones de soja, lo que implica una reducción
de los gastos de herbicidas y un aumento de la productividad. Los
riesgos para la salud humana estarían relacionados con los
efectos alergénicos generados por la variedad transgénica.
241
Maíz bt
El maíz transgénico Bt se llama así porque ha sido modificado a partir de la inserción de
genes de la bacteria Bacillus thuringiensis, que produce una sustancia insecticida.
En 1999, el científico de la Universidad de Cornell John Losey,

realizando experimentos en invernaderos, esparció polen de
maíz Bt en plantas que servían de alimento para las orugas de la
mariposa monarca. La mayoría de las orugas murieron.
Entonces, creció el temor de que lo mismo pudiera suceder en la
naturaleza, por el esparcimiento del polen del maíz modificado,
poniendo en riesgo la supervivencia de insectos útiles para el
medio ambiente. Sin embargo, los experimentos de Bruce
Tabashnik de la Universidad de Arizona y May Berenbaum de la
Universidad de Illinois en campos de maíz estadounidenses han
revelado que los riesgos para esta y otras especies de
mariposas son mínimos.
21.6 - PERSPECTIVAS FUTURAS

Hoy en día, el 99% del área transgénica mundial se concentra en solo tres
países: Estados Unidos (72%), Argentina (17%) y Canadá (10%).
En marzo de 2000, representantes de 138 países firmaron el Protocolo de
Bioseguridad en Montreal, que establece reglas internacionales para el comercio de
productos agrícolas genéticamente modificados. El acuerdo complació a los
ambientalistas y las empresas de biotecnología.
En Brasil, IDEC (Instituto de Protección al Consumidor) y Greenpeace concluyeron
que los OGM ya son parte de la dieta brasileña. Las pruebas realizadas por laboratorios
europeos mediante la técnica de PCR mostraron que 11 alimentos a la venta tienen
ingredientes modificados genéticamente.
A nivel nacional, las perspectivas de futuro implican:
 Combatir la bacteria que provoca el amarillamiento en las plantas de naranja, una
plaga que provoca una pérdida de US $ 100 millones al año. Un proyecto que
consiste en descifrar el genoma de la bacteria, crea una red virtual de intercambio de
información en la que los laboratorios involucrados podrían recibir y enviar las
secuencias de ADN descifradas a un solo centro informático. La red se denominó
Onsa (Organización para la secuenciación y análisis de nucleótidos).
Descubra la secuencia genética de
Xanthomonas citri, una bacteria que
causa el cancro de los cítricos, que
afecta a las plantas de naranja. (98%
de la secuenciación lista).
 Secuenciación de los 50 mil genes de la caña de azúcar. Los científicos
brasileños crearon una variedad de caña de azúcar resistente al ataque de
insectos, transfiriéndole genes de la soja, en lugar de genes de la bacteria
Bacillus thuringiensis.
242
Para intentar aumentar la producción
de celulosa en el país, investigadores
brasileños están desarrollando un
eucalipto transgénico que recibió un
gen de guisante llamado Cab. La
intención es utilizar este gen para
expandir el espacio interno de las
células y aumentar la cantidad de
cloroplastos en cada célula. Hasta
ahora, plantas
243
el humo transformado con el gen Cab confirmó estos resultados. El objetivo es
incrementar la productividad del eucalipto en Brasil, que, según datos del BNDES, en
1998 produjo 6,8 millones de toneladas de celulosa y 6,6 millones de toneladas de
papel, con ingresos de US $ 6,7 mil millones.
Ingeniería de proteínas
El principal objetivo de la ingeniería de proteínas es la síntesis de propiedades
nuevas y / o mejoradas, promoviendo cambios tanto en la estructura como en la función
asociada a una proteína determinada.
Los avances en la determinación de la estructura de las proteínas, la infografía, el
modelado macromolecular y la ingeniería genética han contribuido mucho a la ingeniería de
proteínas, siendo útiles para investigar la relación entre estructura y función, y también en
su aplicación a procesos industriales.
Las principales propiedades enzimáticas que pueden modificarse mediante la
ingeniería de proteínas son la estabilidad, la especificidad y la regulación.
Estabilidad
 Puentes disulfuro: estabilizan las
proteínas, evitando que se desenrollen;
 Interacciones iónicas: las proteínas termófilas tienen pares iónicos adicionales
en comparación con sus homólogas mesófilas;
Sustitución de aminoácidos: Cys,
Trp y Met (aumenta la estabilidad a
los agentes oxidantes); y Cys, Met
y ácidos carboxílicos superficiales
(aumenta la estabilidad a los
metales pesados);
 Técnicas de biología molecular:
aumentan la estabilidad térmica y
oxidativa.
Especificidad
En algunos casos, tales como proteasas y lipasas en detergentes, es necesaria la
escisión de varios sustratos diferentes, en las áreas farmacéutica o química, es deseable una
alta especificidad. Como ejemplo, la sustitución de un solo aminoácido por papaína lo
convierte en nitrilo hidratasa. Para otros casos, como la modificación de quimotripsina, la
trispina es más compleja.
Regulación
Una alternativa es la construcción de proteínas híbridas donde se incorporan
diferentes dominios catalíticos y / o reguladores. La introducción de sitios de unión de
metales a menudo permite la regulación de la actividad enzimática. Por ejemplo, la
introducción de un sitio de unión de Cu2 + fue suficiente para permitir la regulación de la
244
actividad de la tripsina.
Un aspecto importante en la producción industrial de proteínas recombinantes es la
posibilidad de obtenerlas en forma activa y pura. Su fusión con etiquetas, como glutatión-S-
transferasa, polihistidinas, poliargininas y triptófano, puede facilitar la purificación y
plegamiento de la proteína de interés.
245
21.7 - REFERENCIAS
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ciencia de las plantas,
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la Academia Nacional de Ciencias, 87, 9183-9187, 1990.
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genes para enzimas amilolíticas de la bacteria hipertermófila Thermotoga maritima. Cartas de microbiología
de FEMS, 158, 9-15, 1998.
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― GERHARTZ, W.; Enzimas en la industria: producción y aplicaciones; VCH Publishers, Nueva York, 1990.
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― WISNIEWSKI, JP; FRANGNE, N.; MASSONNEAU, A.; DUMAS, C.; Entre el mito y la realidad: el maíz
modificado genéticamente, un ejemplo de una polémica científica considerable. Biochimie, 84, 1095-1103,
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http://www.marcobueno.net/administracao/img/galeria_imagem/enzima_restricao_.jpg
http://shw.fotopages.com/6682543/Foto-2-Tabaco-transgnico.html
http://www.decisivo.com.br/elvira/biotemp/clonagem%20m.bmp
247
CAPÍTULO 22 - ENZIMAS EN MEDICINA
La gran eficacia de las enzimas unida a su especificidad las convierte, en principio,
en agentes de gran potencial de uso terapéutico. Por tanto, la posibilidad de utilizar las
enzimas en la medicina y en la industria farmacéutica es inmensa, pero el número
concreto de aplicaciones es relativamente pequeño. Esto se debe a que, para ello, la
enzima debe tener características adecuadas especialmente para uso interno, tales
como:
• Baja afinidad inmunológica, con afinidad dirigida al problema en cuestión.
• Provienen de organismos no patógenos, que contienen poca o ninguna toxina.
• Alta actividad y estabilidad en pH fisiológico, con retención de actividad y
estabilidad en suero animal.
• Alta afinidad de sustrato (baja KM)
• Poca inhibición por productos o componentes normales que se encuentran en los
fluidos corporales.
• No necesita cofactores exógenos
• Tener una irreversibilidad efectiva de la reacción enzimática en condiciones
fisiológicas.
Pocas enzimas cumplen con las características descritas anteriormente, y el uso
de enzimas en terapias se asocia con la administración de una determinada enzima a un
paciente, esperando que haya una mejora progresiva en su condición. En la industria
farmacéutica, algunas enzimas se utilizan en la fabricación de medicamentos y en
particular antibióticos, como la penicilina.
22.1 - APLICACIONES FARMACÉUTICAS
22.1.1 - Antibióticos semisintéticos

Las penicilinas semisintéticas son los principales productos farmacéuticos
obtenidos por tecnología enzimática. El método de fermentación tradicional permite
producir tanto bencilpenicilina (penicilina G) como fenoximetilpenicilina (penicilina V) y, en
el pasado, se han utilizado con gran éxito. Sin embargo, estos compuestos tienen
limitaciones en su efectividad contra ciertas bacterias patógenas, particularmente cepas
gramnegativas. Por otro lado, han surgido numerosas cepas bacterianas que son
resistentes a estas penicilinas, generalmente debido a la producción de una -lactamasa
(penicilinasa). Por consecuencia,
La vía sintética para la obtención de penicilinas semisintéticas es mediante la
eliminación del radical arilo, generando ácido 6-aminopenicilamico (6-APA). El
descubrimiento de la penicilina amidasa, y su posterior inmovilización, permitió una
síntesis más fácil de 6-APA, que posteriormente se somete químicamente a acilación y
proporciona una
248
gran número de derivados diferentes (por ejemplo, ampicilina), que se muestran en la figura
1, que han demostrado una eficacia especial.
Figura 1 - Producción enzimática de penicilina.

Las cefalosporinas (figura 2) son una clase de antibióticos que tienen una
estructura similar a la de las penicilinas. La cefalosporina C, el producto principal de la
fermentación, no es particularmente útil como antibiótico, pero el derivado semisintético
ha tenido un gran éxito. La molécula original (cefalosporina C) se convierte
enzimáticamente en ácido 7-aminocefalosporánico, que puede acilarse adicionalmente
mediante métodos químicos para dar lugar al grupo de antibióticos de cefalosporina, p.
ex. cefaloridina. La posibilidad de cambiar los sustituyentes en dos posiciones diferentes
en la molécula aumenta significativamente el número de posibles compuestos a obtener.
Figura 2 - Estructura básica de cefalosporina
22.1.2 - esteroides
Los esteroides se utilizan en una gran cantidad de preparaciones farmacéuticas
(como en las píldoras anticonceptivas y antiinflamatorias). La síntesis química de
esteroides está plagada de dificultades debido a su compleja estereoquímica: se
requieren muchos pasos para obtenerlos y los rendimientos generales son muy
pequeños.
Un avance más reciente en este campo proviene de las fermentaciones
microbianas de diosgenina y estigmasterol, que mejoraron notablemente los rendimientos
en la obtención de algunos esteroides de importancia farmacéutica en comparación con
los reportados por métodos químicos.
22.2 - TRATAMIENTOS TERAPÉUTICOS

La base de esta forma de terapia es simplemente el suministro de una enzima
correcta a un paciente, esperando una mejora progresiva de la misma. La respuesta
fisiológica a la incorporación de un material extraño (antígeno) en el cuerpo es la
producción de anticuerpos contra el compuesto. La capacidad de producir un anticuerpo
específico para un antígeno particular se conserva durante toda la vida del individuo; esta
es la base de la inmunidad adquirida.
249
Las proteínas tienen una vida media definida, independientemente de la respuesta
inmunitaria del individuo. Por ejemplo, la vida media de una enzima en la sangre
depende en gran medida de la naturaleza glucoproteica de la molécula. Una eliminación
completa de las unidades de oligosacáridos dará lugar a moléculas con valores
intermedios de vida media.
Por supuesto, una forma de reducir los problemas asociados con esta terapia es
encapsular las enzimas. El material utilizado para encapsular la enzima puede ser un
antígeno. Muchos materiales sintéticos pueden activar la coagulación sanguínea, con
resultados desastrosos (necesidad de anticoagulantes).
La estrategia adoptada para una aplicación terapéutica depende del problema a
resolver. Las enfermedades crónicas que requieren acciones a largo plazo incluyen
defectos enzimáticos hereditarios (heredados genéticamente), insuficiencia orgánica y el
tratamiento de ciertos tumores. Las enfermedades agudas, con acciones más
inmediatas, están relacionadas con el infarto de miocardio (lesiones cardíacas) y la
desintoxicación.
22.2.1 - Enzimas digestivas

Los síndromes de deficiencias de enzimas hidrolíticas pueden tratarse mediante
reemplazo oral con preparaciones enzimáticas. Estos preparados deben ser ajustados
para sobrevivir durante los cambios de pH que se producen en el paso por el sistema
digestivo y finalmente alcanzar, en su forma activa, el ambiente iónico adecuado para su
función.
La proteólisis gástrica puede tratarse con pepsina de cerdo y una dosis adecuada
de ácido clorhídrico para optimizar la acción enzimática.
Las insuficiencias pancreáticas requieren más atención, ya que la función del
páncreas incluye la descomposición de la proteína, el almidón y el aceite ingeridos. En
consecuencia, el sistema pancreático complejo no suele ser reemplazado por enzimas
aisladas, sino por pancreatina, un extracto enzimático que contiene, entre otras enzimas,
tripsina, quimotripsina, -amilasa y lipasa. La digestión de grasas neutras se promueve
comúnmente mediante la adición de bilis ácida. Dado que las enzimas pancreáticas se
desnaturalizan por el pH ácido del estómago y son activas en el pH alcalino del duodeno,
preferiblemente se administran recubiertas en las formulaciones.
Como ayudas digestivas, se utilizan bromelina, papaína y extractos enzimáticos
de Aspergillus oryzae que contienen celulasas, proteasas y - y -amilasas, donde a
menudo se combinan con pancreatina.
22.2.2 - Ayudas curativas

Se recomienda una variedad de proteasas, generalmente combinadas con un
amplio espectro de antibióticos en la pomada, el polvo o la solución para eliminar las
capas de fibrina de las heridas y mejorar la cicatrización. Los efectos beneficiosos
pueden atribuirse al proceso de curación en sí o a la mejora de la biodisponibilidad de los
antibióticos administrados simultáneamente.
250
Se sabe que el proceso de curación está asociado con la asepsia de la herida y
las enzimas actúan eliminando el tejido muerto. Actualmente, solo se utilizan proteínas
heterólogas, como plasmina bovina, tripsina o colagenasa (de Clostridium). Las proteínas
a utilizar deben encontrar su sustrato en las capas de tejido cutáneo muerto.
22.2.3 - Reología sanguínea

"Ancrod”, Una proteasa aislada del veneno de una víbora, Agkistrodon
rhodostoma, descompone el fibrinógeno de manera similar a la trombina, pero no reticula
el gel de fibrina resultante. Clínicamente, la degradación del fibrinógeno mejora el flujo
sanguíneo y, por lo tanto, se cree que aumenta el suministro de oxígeno a los tejidos
durante las enfermedades circulatorias. En pruebas controladas, la infusión de "ancrod"
durante varios días hasta 4 semanas produjo una desfibrinogenación sustancial asociada
con una mejora clínica notable en pacientes que padecían oclusión de la arteria
periférica.
Se ha informado de un modo de acción similar con los correspondientes
resultados clínicos utilizando “batroxobin”, una proteasa derivada del veneno de serpiente
de Bothrops atrox. Se observaron pérdidas de actividad tras tratamientos prolongados,
como resultado de la formación de anticuerpos, con ambas enzimas.
"Kallikreina”, Aislado del páncreas de los cerdos, también se recomienda para el
tratamiento de enfermedades de las arterias periféricas. Su efecto terapéutico se atribuye
a la proteólisis limitada de los quinógenos, que conduce a la formación de un
vasodilatador, la calidina.
22.2.4 - Trombólisis
Las principales indicaciones de la trombólisis son la oclusión de venas
inaccesibles quirúrgicamente, la embolia pulmonar y el infarto agudo de miocardio. La
lisis terapéutica de los coágulos sanguíneos está dominada por activadores del
plasminógeno. Los plasminógenos endógenos son activados fisiológicamente por serina
proteasas. La plasmina generada de esta manera degrada la fibrina, la principal proteína
constituyente de los coágulos sanguíneos.
Estreptoquinasa, el primer activador plasminógeno utilizado en los tratamientos,
no es exactamente una enzima, sino que activa directamente, de forma no proteolítica, el
plasminógeno mediante la formación de un complejo estequiométrico (1: 1) que, a su
vez, genera plasmina a partir de residuos plasminógenos. Debido a este complejo
mecanismo de acción, la estreptoquinasa está lejos de ser un fármaco ideal, actuando
como un antígeno fuerte en humanos. Los experimentos con estreptoquinasa revelaron,
sin embargo, que el mayor problema con el uso de enzimas proteolíticas en terapias es
inherente al principio de activación sistemática del plasminógeno: la plasmina ataca tanto
a la fribina como al fibrinógeno.
La uroquinasa se considera actualmente el fármaco más extendido en las terapias
trombolíticas. Esta es una enzima definida químicamente (así como su función), aislada
de la orina humana o del cultivo de tejidos. Si es puro, no causa ninguna complicación
inmunológica.
251
Esta enzima descompone preferiblemente el plasminógeno para formar plasmina
con una estrecha relación dosis-efecto, siendo más fácil de controlar que la
estreptoquinasa. La principal razón de las restricciones aún existentes sobre el uso de
uroquinasa radica en el elevado coste de obtención de esta enzima. Sin embargo,
recientemente se aisló una uroquinasa no glicosilada, derivada de la clonación del gen
humano, de cultivos de Escherichia coli recombinante y se ha demostrado que tiene una
función equivalente a la enzima glicosilada humana.
Un nuevo tratamiento enzimático es el uso de hialuronidasa para el infarto de
miocardio. Esta enzima degrada algunos de los polisacáridos que forman parte de los
tejidos conectivos (glucosaminoglucanos). Se cree que una degradación parcial de estos
polisacáridos conduce a una disminución del edema (retención de agua) y un mejor
acceso de nutrientes y oxígeno a los tejidos que están lesionados, pero son
recuperables. El tratamiento consiste en administrar una sola dosis, con efectos
secundarios prácticamente inexistentes.
22.2.5 - Control de neoplasias (tumores)

La administración intravenosa de L-asparaginasa para el tratamiento de
determinadas neoplasias que afectan a las células sanguíneas se ha utilizado con éxito,
especialmente en el caso de la leucemia linfocítica aguda.
El mecanismo para el uso de L-asparaginasa en la leucemia linfocítica aguda se
basa en la observación de que ciertas células tumorales tienen un requerimiento
nutricional de L-asparagina exógena mientras que las células normales son capaces de
sintetizar este aminoácido "in situ". Como resultado, la administración intravenosa de la
enzima reducirá los niveles sanguíneos de L-asparagina, privando a las células
anormales de un elemento nutritivo vital y provocando una regresión de la neoplasia.
También se sugiere que los niveles relativamente altos de L-aspartato producidos en la
reacción enzimática pueden ser tóxicos para las células tumorales.
Es fundamental que la enzima esté activa en la sangre, es decir, a pH 7,4 y 37oC.
Como la concentración sanguínea de la enzima debe ser baja, solo las enzimas con un
valor KM bajo (alta afinidad por el sustrato) tendrán aplicación terapéutica. Para producir
la regresión de la neoplasia se calculó que la concentración sérica de L-asparagina debe
ser menor de 10-5 M. En general, cuanto mayor sea la vida media de la enzima, más
eficaz será. La posibilidad de que la enzima se elimine de la circulación está asociada
con el punto isoeléctrico de la preparación enzimática y también depende de la estructura
glicoproteica de la enzima.
El uso terapéutico de la L-asparaginasa no carece de efectos secundarios, como
anorexia, náuseas, fiebre, diarrea y anafilaxia (hipersensibilidad inmunitaria de la
enzima). Una teoría sobre el origen de los efectos secundarios es que son consecuencia
de las concentraciones séricas más bajas de L-asparagina y L-glutamina (que también es
un sustrato de esta enzima), lo que da como resultado una menor capacidad de síntesis
de proteínas incluso en células normales.
La principal fuente de L-asparaginasa es Escherichia coli, pero existen otras
bacterias que producen esta enzima junto con la glutaminasa, como Achromobacter sp. y
Pseudomonas sp., que también muestran actividad antileucémica.
252
22.2.6 - Defectos genéticos
Hasta la fecha, más del 50% de los trastornos metabólicos se atribuyen a defectos
enzimáticos específicos. En muchos de ellos, el cambio se debe a una falta total de la
enzima, mientras que en otros la causa es su sustitución por una enzima relativamente
inactiva.
Aunque solo un pequeño número de enfermedades, como la fenilcetonuria
(defecto en el metabolismo de los aminoácidos aromáticos), pueden tratarse con dietas
controladas (por ejemplo, sin fenilalanina), muchos de estos errores congénitos del
metabolismo provocan lesiones físicas y mentales irreversibles. En teoría, una vez que
se conoce el defecto, debería ser posible administrar la enzima "faltante" al paciente y
aliviar o eliminar los síntomas del cambio.
Los intentos de tratar los trastornos metabólicos hereditarios mediante la
administración de enzimas exógenas solo han tenido un éxito parcial. El principal
problema es que la enzima incorporada al cuerpo tiende a acumularse en el hígado y el
bazo y puede que no llegue a otros órganos. Un ejemplo de este tipo de problemas es el
tratamiento de la glucogénesis tipo II (enfermedad de Pompe), un defecto en la
degradación del glucógeno que suele ser mortal en los primeros 12 meses de vida. La
enfermedad es causada por la ausencia de -1,4-glicosidasa activa y se manifiesta por
la acumulación de grandes cantidades de glucógeno en el hígado y los lisosomas
musculares. El tratamiento de un bebé de 7 meses con la administración intravenosa de
liposomas que contienen -1,4-glicosidasa produce cierta disminución del glucógeno
hepático. Aún,
Otra enfermedad, como la fenilcetonuria, también se puede tratar con
preparaciones enzimáticas de fenilalanina amoniaco liasa recubiertas con polietilenglicol,
donde el exceso de fenilalanina en la sangre se degrada en cinamato, que se excreta en
la orina, y amoniaco, en cantidades mínimas.
La fibrosis quística, que con frecuencia padece 1 de cada 1600 habitantes en el
norte de Europa, se presenta con insuficiencia pancreática. En estos casos, los
conductores pancreáticos se bloquean y las enzimas, que juegan un papel vital en la
digestión normal, no pueden llegar al intestino, lo que provoca síntomas clínicos de
desnutrición. Una administración oral de enzimas pancreáticas, debidamente protegidas
para evitar su desnaturalización por la acidez del estómago, ayuda a desarrollar una
digestión normal y, como resultado, una nutrición adecuada.
22.2.7 - Hernia de disco

La hernia de disco intervertebral es causada por la proyección o extrusión del
núcleo pulposo existente en el canal vertebral, con una presión dolorosa concomitante en
el tejido nervioso. El propósito de la quimionucleólisis es disolver el complejo
mucopolisacárido del núcleo pulposo que sobresale, reduciendo la presión sobre el
nervio sin afectar el colágeno y otras proteínas estructurales en el hueso o tejido nervioso
adyacente.
253
Chimopapaína, una proteasa vegetal aislada de Carica papaya, parece producir
el perfil deseable si se inyectan las dosis adecuadas directamente en el núcleo pulposo.
La enzima ataca la parte proteica insoluble del complejo de mucopolisacáridos, lo que
permite una mayor degradación de los polisacáridos. Las reacciones anafilácticas se
observan con frecuencia (en el 0,4% de los casos). Por tanto, los tratamientos con
quimopapaína están contraindicados en pacientes con antecedentes alérgicos y no
deben repetirse nunca.
22.2.8 - Tratamiento de la inflamación

Durante el proceso inflamatorio, los fagocitos liberan el radical superóxido junto
con otros mediadores. Este proceso, que representa una parte del mecanismo de
defensa, también se considera un contribuyente a la destrucción de tejidos (por ejemplo,
la despolimerización de ácidos hialurónicos, proteoglicanos y colágeno) y al proceso de
lisis de las membranas celulares.
La superóxido dismutasa elimina eficazmente el radical superóxido mediante
catálisis enzimática, formando oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno. Esta enzima,
aislada de tejido bovino, ha demostrado tener efectos terapéuticos efectivos en una serie
de ensayos controlados, si se inyecta intraarticular en pacientes que padecen
osteoartritis en las rodillas. En el caso de la cistitis, la enzima puede infiltrarse en la
mucosa de la vejiga.
La superóxido dismutasa sola no es tóxica. Sin embargo, debido al origen bovino,
se debe considerar el riesgo de reacciones alérgicas en humanos. Una incidencia del
0,8% de reacciones alérgicas y del 0,04% de reacciones anafilácticas indica un potencial
inmunológico bajo para esta enzima.
La aplicación intravascular de proteínas heterólogas todavía se considera muy
riesgosa. El reciente desarrollo de una superóxido dismutasa genuinamente humana a
partir de levaduras recombinantes ofrece la posibilidad de explorar esta técnica
terapéutica.
22.2.9 - Agente antifúngico

Las glicoproteinasas, esfingolipidasas, mucopolisacaridasas o enzimas
oligosacaridasas tienen actividad quitinolítica en la célula fúngica y pueden ser una
opción para su uso como agente antimicótico de amplio espectro.
Entre los diversos tipos de enzimas estudiadas, se han aislado y caracterizado
glicosaminoglicanasas (enzimas que actúan sobre carbohidratos complejos llamados
glicosaminoglicanos) de diferentes tejidos. Se aisló una ß-N-acetilhexosaminidasa ( -
NAHex) de un molusco marino Anadara notabilis, recolectado en el municipio de
Galinhos-RN. Este molusco participa en la degradación "in vitro" de los sulfatos de
condroitina y dermatano. Esta enzima actúa sobre la hexosamina, un monosacárido que
también se encuentra en la quitina, uno de los polisacáridos más abundantes del mundo
(solo superado por la celulosa), presente en el exoesqueleto de crustáceos, cutículas de
insectos y en la pared celular de hongos, entre muchos otros lugares. .
254
Incluso en los mamíferos, estas enzimas se liberan por alteración de las células o
por exocitosis y, debido a su alto peso molecular, no se filtran a través de la membrana
renal (glomerular). Así, en presencia de una lesión renal (glomerular o tubular), los
cambios en estas enzimas en la orina se aplican como diagnóstico de laboratorio de
enfermedades renales. Por estos motivos, la actividad de estas enzimas se está
utilizando para evaluar el desarrollo de determinadas patologías humanas (presentando
altas concentraciones en pacientes con hipertensión, diabetes mellitus y enfermedades
renales); en investigación con glicoproteínas (donde se puede utilizar para cuantificar
azúcares ligados a N y proteínas parcialmente desglicosiladas sin dañarlas); examinar
aspectos del tipo de proteína y la compartimentación de estos compuestos secretados en
las células.
La Tabla 1 resume las aplicaciones terapéuticas de algunas enzimas descritas en
este capítulo.
Tabla 1 - Resumen de aplicaciones terapéuticas enzimáticas
ENZINFONÍA EN OBTENER SOLICITUD
L-asparaginasa y Escherichia coli o Erwinia Tratamiento de la leucemia
L-glutaminasa carotovora; Achromobacter sp.
Estreptoquinasa y Pichia pastoris recombinado; Tratamiento de tromboembolias, incluido el
uroquinasa orina humana y fibroblastos infarto de miocardio, por vía intravenosa.
Proteasas como Páncreas bovino y porcino utilizado en combinación con analgésicos o
tripsina y antibióticos para el tratamiento de
quimotripsina enfermedades
Papaína y inflamatorias
Chimopapaína Extraído de látex papaya en el interrogatorio de heridas, escaras y
injerto de piel; Tratamiento de hernia discal
Colagenasa Clostridium sp. Utilizado en la cicatrización de heridas en forma de
ungüentos.
Amilasas; Páncreas bovino y Ayuda digestiva
Bromelina porcino; Piña
Arginasa Aspergilo fumigatus Tratamiento de la hiperargininemia.
Celulasa Trichoderma reesei Ayudas digestivas y desbridamiento de heridas
Superóxido -Antiinflamatorio
dismutasa
Hialuronidasa Testículos de Agente dispersante y para infecciones
Lisozima Clara de tratamiento de infecciones
Pancreatina Páncreas bovino o cerdo Insuficiencia pancreática
Carboxipeptidasa Páncreas Conversión de insulina porcina en humano.
A, tripsina
Rodanase - Envenenamiento por cianuro
Liasa de Rhodosporidium toruloides Tratamiento de la fenilcetonuria
fenilalanina
amónica
Uricase Aspergilo sp. Tratamiento de la gota
Heparinasa Flavobacterium heparinum Degradación de la heparina
-Galatosidasa Fibroblastos humanos, Tratamiento de la enfermedad de Fabry
células
CHO
Penicilina amidasa
255
Streptomy
ces
lavendula
e Responsable de la transformación de la penicilina
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a
.
256
Ancrod, kalikreína Venenos de Reología mejorada sangriento
y batroxobina
-1,4-glicosidasa Células CHOTtratamiento glucogénesis tipo II (enfermedad
de Pompe)
ß-N-acetilo Molusco Anadara notabilis Antifúngico
hexosaminidasa
Tratamiento de placa dental

La placa dental está formada por bacterias, como Streptococcus mutans,
S. sanguis y S. salivarius, y por -D-glucanos insolubles secretados por estos para
facilitar su adherencia sobre los dientes, provocando incluso caries.
Para solucionar este problema, además de mantener la higiene bucal con un
cepillo y hilo dental, se puede utilizar la enzima dextranasa para ayudar a eliminar y
prevenir la placa y controlar la gingivitis.
22.3 - REFERENCIAS
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258
CAPÍTULO 23 - ENZIMAS EN EL MEDIO AMBIENTE
En las últimas décadas, la búsqueda de nuevos procesos de tratamiento de

residuos ha propiciado el aumento del uso de enzimas. Las enzimas actúan
selectivamente sobre compuestos específicos y, mediante reacciones sencillas y
conocidas, pueden aumentar la biodegradabilidad de sustancias recalcitrantes y tóxicas o
ayudar a su eliminación por precipitación.
Las enzimas han encontrado aplicaciones potenciales en el tratamiento de varios
tipos de desechos: contaminantes fenólicos, desechos de la industria de la pulpa y el
papel, pesticidas, cianuros y desechos de la industria alimentaria. La tabla 1 resume las
enzimas más estudiadas y sus aplicaciones en el área ambiental.
Tabla 1 - Enzimas y sus aplicaciones ambientales

Enzima Fuente aplicaciones
Alquil sulfatasa Pseudomonas C12B Degradación de tensioactivos.
Enzimas Varias fuentes Hidrólisis de pulpa y lodos de pulpa de
celulolítico papel y residuos sólidos celulósicos
Cianidasa Alcaligenes denitrificans Descomposición de cianuro
Cianuro hidratasa Gloecercospora sorghi; Hidrólisis de cianuro
Stemphylium loti
Fosfatasa Citrobacter sp. Remoción de metales pesados
Lacase Rhizoctonia pratola; Eliminación de fenol, decoloración de
Fomrua annosus; efluentes Kraft, unión de fenoles y aminas
Tranvías Versicolor aromáticas en humus.
Lactasas Bacteriano Procesamiento de residuos lácteos y
valorización de algunos productos
Lignina-peroxidasa Phanerochaete chrysosporium Eliminación de fenoles y compuestos
aromáticos, decoloración de efluentes
"Kraft"
Lipasa Varias fuentes Mejora de la deshidratación de lodos y
pretratamiento de efluentes lácteos
Peroxidasa de Phanerochaete chrysosporium Oxidación de fenoles aromáticos y
manganeso colorantes aromáticos.
Hidrolasa de Pseudomonas sp; Hidrólisis de plaguicidas organofosforados
paratión Flavobacterium; Streptomyces
Pectina liasa Clostridium beijerinckii Degradación de pectina
Pectinesterasa Clostridium thermosulfurogenes Degradación de pectina
Peroxidasas Coprinus macrorhizus, Eliminación de fenoles y aminas aromáticas,
soja, nabo, rábano picante, decoloración de efluentes "Kraft",
jacinto de agua, tomates deshidratación de lodos
Proteasas Bacillus subtilis, Solubilización de restos de pescado y
Pseudomonas marinoglutinosa carne, mejora de la deshidratación de
lodos
Tirosinasa Hongos. Eliminación de fenol
259
23.1 - TRATAMIENTO BIOLÓGICO
Los tratamientos basados en el uso de microorganismos para eliminar compuestos
orgánicos dispuestos de forma natural han sido históricamente considerados un
tratamiento alternativo, frente a los tratamientos físicos y químicos, debido a su bajo
costo energético, ya que ocurren rápidamente a temperatura ambiente.
Tradicionalmente, los objetivos del tratamiento biológico de efluentes son:
 Reducción de la demanda bioquímica
de oxígeno (DBO) del efluente para
que pueda ser liberado al medio
ambiente con un impacto mínimo en
la ecología local;
 Eliminación de compuestos orgánicos
soluble, que ellos son degradado por
microorganismos para generar energía y nuevas células;
 Eliminación de materia orgánica
residual en suspensión por sedimentación.
En el tratamiento de efluentes, el tratamiento biológico representa un tratamiento
secundario, con otras etapas antes y después del mismo. La tabla 2 muestra un resumen
de los principales tipos de tratamiento y sus principios. En la figura 1, se presenta un
esquema general de los sistemas de tratamiento de aguas residuales.
Tabla 2 - Resumen de tratamientos de efluentes

Tratos Principio Tipos
Pretratamiento Eliminación de Barandilla, sedimentación
materiales gruesos y
flotantes
Primario Eliminación de sólidos y Flotación, sedimentación, tamizado,
aceite en suspensión coagulación-floculación
Secundario Eliminación de Filtros biológicos, lodos activados, lagunas
materia orgánico (aireadas, opcionales y anaeróbicas), filtros
biodegradable anaeróbicos, biodiscos
Terciario Eliminación de nitrógeno, Electrodiálisis, Tratamientos oxidativos (cloro y
fósforo, metales ozono), Adsorción en carbón activo, Ósmosis
pesados, compuestos inversa, Nitrificación y desnitrificación,
orgánicos no Intercambio iónico, Tratamiento con UV
biodegradables y (radiación ultravioleta), Tratamiento enzimático
organismos patógenos.
260
Figura 1 - Secuencia general de tratamiento de efluentes
261
23.2 - TRATAMIENTO ENZIMÁTICO
El uso de enzimas en el tratamiento de aguas residuales tiene algunas ventajas
potenciales sobre el uso de piscinas microbianas, con algunas desventajas descritas en
la tabla 3.
Tabla 3 - Ventajas y desventajas del tratamiento enzimático de efluentes

Pros Contras
Mayor sencillez en la operación y control del proceso Inestabilidad térmica
(reducción del número de especies involucradas)
No es necesario aclimatar las enzimas. Ataque de proteasa
El volumen de lodos generado es Inhibición de la actividad
menor (hay crecimiento de
biomasa)
Procesos con diferentes concentraciones de Alto costo de obtención
contaminantes
(límite de inhibición enzimática total)
Efectos de choque de carga disminuidos
A pesar del gran potencial, existen varias situaciones en las que el uso de enzimas
puede no ser una herramienta adecuada para el tratamiento de residuos. El tratamiento
biológico suele ser más económico y degrada adecuadamente los efluentes que
contienen compuestos orgánicos entre medio y alto, que se generan en grandes
volúmenes. En los casos en los que se desee eliminar varias sustancias con diferentes
características químicas, en los que sería necesario utilizar varias enzimas, el tratamiento
enzimático puede no ser factible. En algunas situaciones, la aplicación de enzimas puede
incluso ser perjudicial, como cuando la toxicidad del efluente aumenta después del
tratamiento enzimático.
Algunos criterios deben evaluarse de antemano para determinar cuándo se debe
utilizar el tratamiento enzimático de residuos:
 Los productos de reacción deben ser
menos tóxicos, más biodegradables o,
al menos, más fáciles de eliminar
mediante tratamientos posteriores que
los compuestos originales;
 La enzima debe ser capaz de catalizar
selectivamente la degradación del
compuesto objetivo en el efluente real,
estar disponible comercialmente y ser
de bajo costo;
La enzima debe ser razonablemente
activa en condiciones de tratamiento
típicas y relativamente estable. Se
debe considerar la variabilidad de la
composición química del efluente, que
incluso puede contener inhibidores
enzimáticos, y que el pH y la
temperatura pueden estar lejos de los
valores óptimos para la enzima;
262
 Los reactores para el proceso enzimático deben ser simples. Si el costo de la
enzima es lo suficientemente bajo como para descartarla después de la reacción, se
deben elegir reactores agitados homogéneos (discontinuos o continuos) porque son
los más simples. El uso de enzimas inmovilizadas o reactores de membrana debe
considerarse con precaución, ya que estos materiales deben desecharse después de
varios ciclos de operación debido a la obstrucción u obstrucción causada por el
crecimiento microbiano;
El uso de enzimas en los procesos de tratamiento de residuos puede resultar
apropiado en los siguientes casos:
263
 Eliminación de compuestos específicos de mezclas complejas de residuos
industriales antes de la aplicación de tratamientos biológicos;
 Pulido de aguas residuales tratadas
(municipales o industriales) o
subterráneas para ajustarlas dentro de
los límites permisibles de toxicidad;
 Eliminación de componentes
específicos de mezclas diluidas para
las que no se puede aplicar un
tratamiento biológico convencional,
por ejemplo, en la eliminación de
contaminantes de las aguas
subterráneas;
 Tratamiento de residuos generados ocasionalmente o en lugares aislados
(incluidos lugares de fuga o eliminación de residuos abandonados);
 Tratamiento en planta de aguas residuales de alta concentración y pequeño
volumen en el punto de generación de la unidad de fabricación.
23.2.1 - Degradación de organofosforados

La disposición de plaguicidas organofosforados, como paratión y cumafos, ha sido
de gran interés. Los microorganismos que contienen enzimas hidrolíticas que
desintoxican esta clase de pesticidas pueden proporcionar una solución práctica para los
efluentes tóxicos. La ingeniería genética ofrece la posibilidad de producir grandes
cantidades de dichas enzimas, que se pueden recolectar y utilizar, evitando así el
problema ambiental asociado con la liberación de microorganismos recombinantes. Su
principal aplicación es la remediación de aguas subterráneas contaminadas.
Las enzimas, como la fosfotriesterasa organofosforada (paratión hidrolasa),
pueden hidrolizar estos pesticidas a productos de menor complejidad química, como se
muestra en la figura 2. Esta enzima puede ser producida por tres fuentes recombinantes:
Streptomyces lividans, Escherichia coli y células de insectos. Los genes estructurales
(opd) de esta hidrolasa se pueden codificar en plásmidos de Flavobacterium sp. y
Pseudomonas diminuta.
Figura 2 - Hidrólisis enzimática de paratión
23.2.2 - Degradación del cianuro

El cianuro es un potente inhibidor del metabolismo celular, que se genera en
procesos industriales como la obtención de fibras y caucho sintético, lixiviación de
minerales, procesamiento de carbón y las industrias farmacéutica, alimentaria y de
galvanoplastia (3 x 106 toneladas / año). Por lo tanto, en sus efluentes industriales, la
concentración de cianuro debe reducirse a 4 - 40 M, antes de ser descartado. Muchos
procesos químicos oxidativos que se utilizan actualmente para desintoxicar efluentes que
contienen cianuro tienen algunas desventajas, como la cloración alcalina, que requiere
264
un control cuidadoso de la concentración de cloro y puede generar compuestos
organoclorados tóxicos y biológicamente persistentes, por lo que se requiere un
tratamiento adicional del efluente generado.
265
Se sabe que los microorganismos tienen varias enzimas capaces de convertir el
cianuro en compuestos que sirven como fuente de carbono y nitrógeno. Tales enzimas
incluyen: formamida hidro-liasa, L-3-cianoalanina sintasa, tiosulfato sulfurtransferasa y
oxigenasas. Recientemente, una enzima denominada cianidasa producida por
Alcaligenes denitrificans hidrolizó cianuro en amoniaco y formiato, y la producida por
Pseudomonas fluorescens hidrolizó, con ayuda del cofactor NADH, amoniaco y dióxido
de carbono.
Se han reportado varios tipos de sistemas microbianos aclimatados (lodos
activados y filtros biológicos) para el tratamiento de efluentes que contienen cianuro, el
problema es que estos sistemas biológicos requieren un tiempo de adaptación
prolongado y no funcionan con concentraciones de cianuro superiores a 8 mM. Por tanto,
la remoción enzimática del cianuro encuentra aplicabilidad ya que puede actuar
directamente sobre efluentes con marcados niveles de cianuro.
23.2.3 - Degradación de fenoles

Los compuestos aromáticos, incluidos los fenoles y las aminas aromáticas,
constituyen una de las principales clases de contaminantes y se encuentran en varias
industrias, como en la producción de resinas fenólicas, tintes, pulpa y papel, plásticos,
procesamiento de carbón, refinación de petróleo, textiles, hospitales. y laboratorios.
Los métodos tradicionales de tratamiento de efluentes son: extracción por
solventes, degradación microbiana, adsorción sobre carbón activado y oxidación química,
pero estos tienen altos costos; purificación incompleta; formación de subproductos
peligrosos; y aplicabilidad a un rango de concentración de fenol limitado.
Por tanto, las enzimas han sido una alternativa potencial, ya que son altamente
selectivas y pueden tratar eficazmente efluentes diluidos, requiriendo tiempos de
retención bajos en comparación con otros métodos.
23.2.3.1 - Peroxidasas
Peroxidasa
La peroxidasa puede catalizar la oxidación de fenoles, bifenoles, anilinas,
bencidinas y compuestos heteroaromáticos relacionados (figura 3), siendo aplicable para
el tratamiento de efluentes porque mantienen su actividad en un amplio rango de pH y
temperatura.
Los productos de reacción se polimerizan mediante un proceso no enzimático que
induce la formación de precipitados insolubles en agua, que pueden eliminarse
fácilmente mediante sedimentación o filtración. Además, esta enzima tiene la capacidad
de coprecipitar ciertos contaminantes, formando polímeros heterogéneos que también
son fácilmente removibles.
figura 3 - Hidrólisis de fenoles por una fuerte peroxidasa de raíz.
266
El tratamiento de los efluentes con peroxidasa condujo a una disminución del 46%
en la toxicidad del condensado formado en el proceso de despulpado Kraft, que contiene
alrededor de 14 mg / L de fenoles, con una actividad de 1,6 U / mL durante 3 horas de
reacción. La reducción de niveles por debajo de 1 mg / L se logró utilizando solo 1 U / mL
de peroxidasa; sin embargo, para alcanzar niveles por debajo de 0.5 mg / L, que es el
estándar legal para la eliminación, fue necesario aumentar la concentración de enzima en
4 veces.
Peroxidasa de lignina
La lignina peroxidasa proviene del basidiomiceto Phanerochaete chrysosporium y
actúa sobre la oxidación de compuestos fenólicos y poliaromáticos, la mineralización de
compuestos aromáticos recalcitrantes y la despolimerización de la lignina.
Un ejemplo de tratamiento de efluentes con lignina peroxidasa fue la degradación
de tintes sintéticos, como trifenilmetanos, heterocíclicos, azo y poliméricos, mediante
isoformas purificadas y no purificadas. La enzima no purificada pudo producir
decoloración a niveles cercanos a los promovidos por la isoforma de mejor desempeño
para cada tinte, y para la decoloración del naranja de metilo alcanzó niveles mucho más
altos que los alcanzados por cualquier otra isoforma.
23.2.3.2 - Polifenoloxidasas
La tirosinasa, también conocida como fenolasa, catecolasa o polifenoloxidasa
(PPO) cataliza dos reacciones consecutivas: la hidroxilación de monofenoles con oxígeno
molecular para formar o-difenoles, y la deshidrogenación de estos con oxígeno molecular
para formar o-quinonas, que son inestables y sufren polimerización no enzimática, como
se describe en la figura 4.
OH OH O
O2 Odos
OH O
PPO PPO
Productos
Producto s
Condensado
condensado
H2O
R R R
Monofenoles Catequinas Catequina
Monofenoles Quinonas
s Quinonas
Figura 4 - Hidrólisis de fenoles por tirosinasa (PPO)
En esta reacción también hay un fenómeno de inactivación suicida, donde el
producto en sí, el catecol, inactiva la tirosinasa en oxidación a quinonas. Para evitar esto,
se sugiere agregar quitosano al sistema de reacción o inmovilizar la enzima en
quitosano.
La polifenoloxidasa se puede obtener de fuentes vegetales, como las batatas
(patatas Ipomea), la cáscara de mango (Mangifera indica), las hojas de té (Camellia
sinesis), el tabaco (Nicotiana tabacum), la fruta temprana (Annona squamosa) y los
hongos, como Neurospora. crassa, Coriolus sp., Latania sp. y Agaricus bisporus.
Un ejemplo de tratamiento de efluentes con PPO es la remoción de fenol en aguas
residuales, donde proviene de una planta de procesamiento de carbón (0,4 g / L) y una
planta de fosfato de triarilo (0,1 g / L). Se obtuvieron eliminaciones de fenol del 94%
cuando se aplicaron 250 U / mL de enzima PPO (2000 U / mg) durante un período de 1
267
día.
268
23.2.3.3 - Lacase
Lacase es una enzima capaz de catalizar la oxidación de varios sustratos
aromáticos con reducción simultánea de oxígeno (O2) en dos moléculas de agua. En
general, las lacasas tienen cuatro átomos de cobre, que juegan un papel importante en el
mecanismo catalítico de esta enzima.
Esta oxidasa se encuentra ampliamente distribuida en vegetales superiores, en
hongos, como Trametes versicolor, y en algunas bacterias como Azospirillum lipoferum y
Alteromonas sp .. Su uso ha sido en el tratamiento de efluentes de la industria del aceite
vegetal (aceite de oliva), principalmente en su forma inmovilizada (en quitosano), con el
objetivo de incrementar su estabilidad, así como en el blanqueo de pulpas en la industria
del papel y celulosa.
23.2.5 - Aplicación de lipasas

Las lipasas se utilizan en lodos activados y otros procesos de tratamiento
aeróbico, donde las capas delgadas de grasa deben eliminarse continuamente de la
superficie de los reactores aireados para permitir la transferencia de oxígeno
(manteniendo las condiciones para la supervivencia de la biomasa). Una escisión eficaz
de sólidos y la eliminación y prevención del bloqueo por grasa o biopelícula en los
sistemas de tratamiento son importantes en muchas operaciones industriales, como
mataderos, industrias alimentarias y la industria del cuero.
Las lipasas bacterianas están involucradas en la solución de problemas
ambientales como la hidrólisis de grasas de efluentes domésticos y digestores
anaeróbicos. La primera etapa de la degradación es el tratamiento primario de lodos y
materia orgánica particulada, lo que permite la solubilización y el aumento de la hidrólisis
de la mezcla polimérica compleja. Durante el proceso de digestión anaeróbica, las
macromoléculas se escinden en monómeros de baja masa molar en presencia de
enzimas extracelulares. La concentración de sulfuro generada en el proceso de
reducción de sulfato estimula las enzimas (proteasas, lipasas y glucosidasas),
aumentando la solubilización del tratamiento primario de lodos.
Como ejemplos tenemos:
 Tratamiento de efluentes de la industria láctea con lipasas obtenidas de
Penicillium restrictum en cultivo semisólido. Las eficiencias de eliminación de
DQO con el efluente pretratado enzimáticamente fueron del orden del 80 al 95%,
o incluso con la aplicación directa de una preparación enzimática sólida sin
utilizar etapas de pretratamiento con eliminaciones del 90%;
 Los tratamientos de efluentes
derivados de mataderos que contienen
un alto nivel de sólidos, incluidas las
grasas, que representan el 70% de su
carga contaminante, se realizan
inicialmente con hidrólisis enzimática
utilizando lipasas comerciales, como
páncreas de cerdo, Rhizomucor
miehei y lipasas vegetales;
 Los efluentes de restaurantes
contienen grandes cantidades de
269
lípidos y la aplicación de lipasas
crudas de Pseudomonas aeruginosa
muestra altos valores de eficiencia de
remoción.
270
Biorremediación enzimática
En comparación con los métodos físico-químicos tradicionales, la biorremediación
es generalmente el tratamiento más seguro, menos dañino y más rentable. Esta herramienta
biotecnológica utiliza microorganismos, naturales o introducidos, o enzimas aisladas para
degradar contaminantes persistentes en compuestos con menor o nula toxicidad y, en
muchos casos, se puede combinar con procesos físicos, químicos o mecánicos para mejorar
la credibilidad y efectividad de la desintoxicación. .
Biorremediación microbiana
Uno de los principales intereses de la biorremediación con microorganismos,
particularmente en áreas marinas, es que deben soportar una variedad de condiciones
adversas que están lejos de las condiciones ideales de un laboratorio. Adicionalmente, al
utilizar microorganismos inoculados, particularmente organismos genéticamente
modificados (OGM), se deben considerar dos problemas principales: la fragilidad y el bajo
nivel de aptitud y crecimiento de estos microorganismos con los de la población nativa, y la
posibilidad de alterar un ecosistema determinado. .por la introducción de OMG.
La liberación controlada de Pseudomonas fluorescens HK44 que contiene un
plásmido que codifica una enzima que degrada el naftaleno representa el primer y único
OMG aprobado para las pruebas de biorremediación.
La biorremediación microbiana está limitada por factores como transferencia de
masa (baja biodisponibilidad del contaminante), aireación, nivel de nutrientes en los sitios
contaminantes (técnicas de bioestimulación necesarias) y problemas con las condiciones
térmicas.
Biorremediación enzimática
La biorremediación enzimática se ha convertido en una alternativa atractiva para
ayudar a las técnicas de biotratamiento disponibles: las enzimas proporcionan sistemas más
simples que los microorganismos. La mayoría de los xenobióticos pueden someterse a
biorremediación enzimática, por ejemplo, hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH),
compuestos aromáticos poli-nitrados, pesticidas, tintes sintéticos y polímeros.
Históricamente, las enzimas más estudiadas en biorremediación son las mono o
dioxigenasas bacterianas, reductasas, deshalogenasas, citocromo P450 monoxigenasas,
lacasa, lignina y peroxidasas de manganeso de hongos de pudrición blanca y
fosfotriesterasas bacterianas. Desde un punto de vista medioambiental, el uso de enzimas
tiene algunas ventajas:
 La biotransformación no genera
subproductos tóxicos como es
común en el caso de procesos
químicos o microbiológicos, y las
enzimas son digeridas, in situ, por
microorganismos nativos después
del tratamiento;
 El requisito de aumentar la
biodisponibilidad mediante la
introducción de codisolventes
orgánicos o tensioactivos es mucho
271
más plausible desde un punto de
vista enzimático que en el uso de
células completas;
 El potencial para producir enzimas
a gran escala, con mayor
estabilidad y actividad, ya un
menor costo mediante el uso de
tecnología de ADN recombinante.
272
23.3 - REFERENCIAS
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con enzimas hasta nuevos procesos ecológicos. Tendencias en biotecnología, 24 (6), 281-287, 2006.
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274
CAPÍTULO 24 - BIOCATÁLISIS EN MEDIOS NO ACUOSOS
24.1 - DISOLVENTES ORGÁNICOS
Los compuestos enantiopuros han ganado un papel central en el desarrollo de la
tecnología química moderna. Dos tercios del mercado mundial de los veinticinco
productos más vendidos son compuestos enantiopuros y sus ventas crecen a una tasa
media anual cercana al 7%.
Se pueden observar tendencias similares en otras especialidades y otros sectores
químicos. Los artículos ambientales y la demanda de tecnología sostenible requieren
nuevos materiales químicos que sean ambientalmente benignos, que se puedan producir
sin cargas adicionales en el ecosistema y que sean biodegradables.
En la década de los 80 se demostró que las enzimas tienen actividad en
disolventes orgánicos y, por tanto, pueden cambiar el curso de las reacciones
enzimáticas. La primera fermentación aplicada industrialmente fue la introducción del
grupo 11-hidroxilo en el núcleo de la progesterona, realizada por Upjohn Company
(1951). Así, la 11- -progesterona podría transformarse en cortisona en nueve pasos,
permitiendo la síntesis de cortisona en menos pasos que los 14 requeridos a partir de
diosgenina.
Las principales ventajas de utilizar enzimas en medios no acuosos son:
 Cambios en el equilibrio de la
reacción, como consecuencia del
cambio en el coeficiente de reparto de
sustratos y productos entre las fases de
interés;
 Reducción de la inhibición por sustratos y productos;
 Facilidad de recuperación de productos y biocatalizador;
 Mayor termoestabilidad del
biocatalizador;
 Menor riesgo de contaminación
microbiana;
 Aumento de la estereoespecificidad en
la resolución de mezclas racémicas;
 Variación en la especificidad de
algunas enzimas por sustratos;
 Mayor solubilidad de especies no
polares;
 La inmovilización a menudo no es
necesaria, pero si es deseable, la simple
adsorción o deposición sobre superficies
no porosas es satisfactoria.
Como ejemplo de enantioselectividad (υR / υS) en la resolución de mezclas
racémicas, donde υ es la tasa de formación del producto (enantiómero R o S), la tabla 1
muestra que esta es mayor con el aumento de la polaridad del solvente (constante
dieléctrica).
275
Sin embargo, también existen algunas desventajas como:
 Desnaturalización y / o inhibición del biocatalizador por la presencia del
disolvente orgánico;
 Mayor complejidad del sistema de
reacción;
 Costes adicionales por disolventes, codisolventes o tensioactivos.
Si es necesario no utilizar disolventes orgánicos en la biosíntesis, se pueden
utilizar lipasas alquiladas. Aparentemente, el aumento de la hidrofobicidad de la
superficie de la lipasa es responsable del cambio en la relación de biosíntesis / hidrólisis.
276
La tripsina alquilada es un catalizador más eficaz para la esterificación de
sacarosa por ácido oleico que la tripsina. La ribonucleasa y la lisozima son más estables
cuando se suspenden en disolventes orgánicos inmiscibles que cuando se disuelven en
agua.
Tabla 1 - Enantioselectividad de la lipasa del páncreas de cerdo en la transesterificación de butirato de

vinilo y alcohol s-fenetílico
Disolventes υR (mM / υS (mM / Enantioselectividad

h) h) (υR / υS)
Nitrometano 9,7 0,13 75
Dimetilformamida 2.3 0,038 61
trietilamina 4.2 0,099 42
alcohol t-amílico 6,9 0,20 35
butanona 8,6 0,32 27
acetonitrilo 14 0,64 22
benceno 10 0,67 15
ciclohexano 43 3.3 13
decano 5.5 0,85 6
24.1.1 - Clasificación de sistemas biocatalíticos

24.1.1.1 - Sistemas homogéneos
Los sistemas homogéneos son mezclas de agua y disolventes orgánicos miscibles
donde se disuelve la enzima. Estos disolventes tienen un alto grado de hidrofilicidad,
interactúan con la enzima y provocan una disminución de la actividad enzimática, siendo
este efecto más pronunciado cuando aumenta la concentración del disolvente. Esto se
debe a la capacidad de estos disolventes para solubilizar la capa de agua que rodea y
mantiene la enzima catalíticamente activa, y a los cambios conformacionales en la
molécula de la enzima que se producen en presencia de disolventes orgánicos.
Por otro lado, la estabilidad de las enzimas en estos sistemas varía en relación a
la fase acuosa. En general, los dioles, trioles y polioles son agentes estabilizantes más
eficaces, debido a su capacidad para establecer enlaces de hidrógeno.
Algunos ejemplos interesantes son los estudios comparativos de síntesis e
hidrólisis de penicilina G con penicilina acilasa de Kluyvera citrophila en glicerol al 20% (v
/ v) y la síntesis de aspartamo por termolisina en soluciones de agua y metanol.
24.1.1.2 - Sistemas macroheterogéneos
Sistemas líquido-líquido
Constan de dos fases macroscópicas, una formada por la enzima disuelta en la
fase acuosa y la otra por el disolvente orgánico no polar inmiscible (hidrocarburos,
cloroformo, éter, entre otros). La fase acuosa se puede ubicar como una capa separada
en contacto con la capa de la fase orgánica, o puede permanecer como una emulsión
dentro del solvente orgánico.
277
En los sistemas bifásicos, la reacción enzimática ocurre normalmente en la fase
acuosa. El sustrato se disuelve en la fase orgánica y se divide en la fase acuosa para ser
convertido por la enzima en un producto, que se extrae en la fase orgánica del solvente.
Sin embargo, la propia fase orgánica puede servir como sustrato, como ejemplo
en la producción de 7,8-epoxi-1-octeno a partir de una suspensión de células de
Pseudomonas putida en 1,7-octeno, que tiene un sustrato de función dual y orgánico.
fase. En la tabla 2 se describen las principales ventajas y desventajas de este tipo de
sistema:
Tabla 2 - Ventajas y desventajas de los sistemas enzimáticos líquido-líquido
Preparación sencilla, fácil separación de Partición de disolventes polares utilizados
los productos de reacción y como fase orgánica en agua - pérdida de la
regeneración enzimática actividad catalítica de la enzima disuelta en la
fase acuosa
Reacciones altamente conducidas que El área de la interfaz agua-disolvente orgánico
ocurren con la formación de agua como es bastante pequeña y, en consecuencia, la
producto (por ejemplo, síntesis de magnitud de la transferencia de masa a través
péptidos y ésteres de aminoácidos) de la interfaz es baja.
Convertir compuestos poco solubles en La agitación intensa puede generar una
agua tendencia a que las enzimas se adsorban en
la interfaz.
Sistemas sólido-líquido-líquido
Corresponden a aquellos sistemas en los que el biocatalizador está inmovilizado y
están protegidos del contacto directo con la interfaz agua-disolvente orgánico y, por lo
tanto, a menudo son más estables que los sistemas líquido-líquido. Como ejemplo, está
la hidro-hidroxiesteroide deshidrogenasa, inmovilizada en sefarosa 4B y activada por
BrCN, la cual mantuvo aproximadamente el 60% de su actividad inicial luego de dos
meses de operación continúa en un sistema agua-acetato de etilo, mientras que la
enzima libre fue inactivada. en unos dias.
Dado que las enzimas son insolubles en la mayoría de los disolventes orgánicos
utilizados, no hay necesidad de enlaces covalentes entre la enzima y el soporte. Una
forma de inmovilizar es mezclando una solución acuosa de enzima con el soporte y
eliminando el agua a presión reducida. Sin embargo, los contaminantes hidrófilos en los
disolventes orgánicos influirán en el microambiente enzimático y afectarán su actividad.
Los contaminantes como las proteínas y los carbohidratos pueden servir de apoyo y
tener una influencia positiva. Otra alternativa es precipitar la enzima de una solución
acuosa en presencia de un soporte añadiendo un disolvente orgánico frío miscible en
agua, como acetona.
La naturaleza química del soporte puede influir directamente en la actividad
enzimática, debido a diferentes conformaciones enzimáticas posibles. Por ejemplo, en la
alcoholización sobre soporte de poliamida, o en la co-movilización de sorbitol con enzima
en el soporte, aumenta la presencia de agua alrededor de la enzima.
278
Los sistemas sólido-líquido-líquido tienen otras ventajas adicionales sobre los
sistemas líquido-líquido como:
 Facilitar la separación del
biocatalizador del sistema para su
reutilización;
 Proporcionar una gran interfaz y, en consecuencia, menos restricciones de
difusión durante la transferencia de sustratos y / o productos, lo que se traduce
en una mayor velocidad de reacción que en los sistemas líquido-líquido sin
agitación.
La desventaja que puede ocurrir en estos sistemas son las limitaciones en la
transferencia de masa, especialmente cuando las hidrofobicidades de la matriz y los
reactivos que se difunden a través de ella son muy diferentes.
Sistemas sólido-líquido (suspendidos)

Dichos sistemas biocatalíticos se han estructurado utilizando preparaciones
enzimáticas comerciales, cristales enzimáticos o enzimas liofilizadas, obteniendo mayor
éxito con el uso de disolventes hidrófobos.
Siempre es importante que el estado de ionización de la enzima sea adecuado
para la catálisis, ya que la protonación y la desprotonación de la enzima rara vez ocurren
en la fase orgánica. El estado de ionización de la enzima debe ser adecuado ya en la
preparación liofilizada, ajustando el valor de pH antes de la liofilización (llamada memoria
de pH).
Para aumentar la capacidad tampón del sistema, los tampones se liofilizan junto
con las enzimas o bien se disuelven en la fase orgánica. Para evitar la inactivación
durante la liofilización, es necesaria la presencia de sorbitol, haciendo que la enzima sea
más activa en disolventes orgánicos secos o añadiendo pequeñas cantidades de agua.
Las suspensiones de enzimas sólidas tienen la ventaja de permitir procesos a
temperaturas muy elevadas, como en el caso de la lipasa pancreática de cerdo, que tiene
una actividad mayor a 100 ° C que la temperatura ambiente durante la transesterificación
de tributirina. Esto se debe a que, en presencia de disolventes orgánicos, las moléculas
de enzima conservan su forma original. Esta rigidez conformacional también produce
cambios en la especificidad del biocatalizador.
24.1.1.3 - Sistemas microheterogéneos

Estos sistemas están representados por micelas inversas. Las micelas son
agregados esféricos cerrados de tensioactivos que se forman dentro de una solución
acuosa y son capaces de retener solventes y sustancias no polares en su interior. Las
micelas inversas, por otro lado, son agregados de tensioactivos que se forman dentro de
una solución polar baja, como se muestra en la figura 1.
Una propiedad importante de las micelas inversas es su capacidad para retener
cantidades considerables de agua, enzimas y electrolitos en su interior hidrófilo, que tiene
un diámetro en el rango de 10 a 100 Å. La enzima se retiene fácilmente agitando la
mezcla de la solución tampón acuosa que la contiene y la solución orgánica que contiene
el tensioactivo, o mejor dicho, disolviendo la enzima seca en micelas inversas
prehidratadas que proporcionan una solución ópticamente transparente, homogénea y
279
termodinámicamente estable. . El contenido de agua de estos sistemas debe ser inferior
al 1% (v / v).
280
Figura 1 - Micelas: normales, inversas y cilíndricas, respectivamente.
El microambiente presente en la cavidad interna de las micelas inversas

proporciona a la enzima retenida un medio más natural que el seno de la solución
acuosa. Un ejemplo de esto es que la constante cinética de primer orden para la
oxidación del pirogalol por peroxidasa solubilizada en micelas inversas es
aproximadamente 100 veces mayor que la obtenida en solución acuosa.
24.1.2 - Principios físico-químicos

24.1.2.1 - Papel del agua
La cantidad de agua presente en la mezcla de reacción influye en la biocatálisis de
varias formas. Incluso después de la liofilización u otros procesos de secado, la
preparación enzimática contiene algo de agua, que está fuertemente ligada.
El agua residual probablemente activa la enzima, aumentando su flexibilidad
interna. Sin embargo, también puede actuar como sustrato en la reacción enzimática,
especialmente en reacciones hidrolíticas, generando reacciones secundarias y menores
rendimientos de producto.
La cuantificación del agua en el medio de reacción se puede realizar midiendo la
concentración de agua (% v / vo mol / L) o por la actividad del agua, que es la más
recomendada por tratarse de un parámetro termodinámico. En sistemas de
microemulsión que contienen micelas inversas, la relación molar entre agua y
tensioactivo se usa a menudo para cuantificar el agua. La actividad máxima se obtiene
normalmente cuando el tamaño de las micelas es igual al de las enzimas.
Para obtener reacciones con actividad de agua controlada, tanto la preparación
enzimática como la solución de sustrato deben preequilibrarse con soluciones salinas
saturadas, antes de que comience la reacción. En las reacciones que ocurren en la fase
gaseosa, el equilibrio es muy lento, especialmente si se forma agua en la reacción
(esterificación), en cuyo caso es un mejor control bombear la solución salina a través del
reactor.
La cantidad de agua necesaria para la catálisis orgánica depende de la enzima
utilizada. La quimotripsina, suspendida en octano, permanece catalíticamente activa con
50 moléculas de agua por molécula de enzima. La tirosinasa, por otro lado, requiere
aproximadamente 0,5% (v / v) de agua para mostrar la actividad del cloroformo. De
manera similar, la peroxidasa extraída del rábano es más activa en tolueno en presencia
de 0,25% (v / v) de agua.
281
24.1.2.2 - Interacciones que afectan la estabilidad de la enzima
Las enzimas exhiben sus propiedades catalíticas en forma completa solo cuando
tienen una estructura conformacional estrictamente definida, que depende de las
interacciones que se establecen con el medio que las rodea y consigo mismo. La
conformación de la molécula enzimática en solución está determinada por interacciones
complejas que tienen lugar tanto en el interior de la proteína como en su superficie, tales
como: enlaces de hidrógeno, enlaces disulfuro, fuerzas de van der Waals, interacciones
electrostáticas e hidrofóbicas.
Los puentes disulfuro reducen la posibilidad de que la enzima se despliegue y
consiguen la desnaturalización, al tiempo que limitan la agregación y la inactivación
irreversible posterior.
Los enlaces de hidrógeno juegan un papel importante en la estabilidad de las
enzimas en disolventes orgánicos. En el agua, una cadena polipeptídica completamente
desarrollada puede satisfacer sus enlaces de hidrógeno a través de interacciones con el
solvente. De manera similar, una proteína plegada satisface sus enlaces de hidrógeno
mediante interacciones intracadena y solvente. En un medio no acuoso, que forma
enlaces de hidrógeno débilmente, se produce una estructura de proteína que ayuda a
maximizar los enlaces de hidrógeno internos y estabilizar la molécula. Esta estructura
alternativa tiene un alto costo energético para la enzima, ya que puede promover la
formación de enlaces de hidrógeno incompletos y como resultado se obtiene una
conformación inactiva o cambio en la flexibilidad conformacional de la molécula.
Las interacciones electrostáticas como los puentes salinos y las interacciones
dipolo-dipolo cerca de la superficie también afectan la conformación y estabilidad de la
enzima en un medio no acuoso. Cuando las proteínas se encuentran en un ambiente
acuoso, la solvatación de sus residuos cargados tiende a ser máxima y, en
consecuencia, aumenta su estabilidad. En un ambiente hidrofóbico, los puentes salinos
son muy inestables y, como resultado, los pares iónicos deben estabilizarse con sus
cargas electrostáticas complementarias, dentro del ambiente polar de la proteína.
Con el fin de reducir el efecto desfavorable del disolvente, se han realizado
estudios de ingeniería de proteínas que permiten modificar la secuencia de aminoácidos
de una enzima, mediante la sustitución selectiva de residuos cargados que no intervienen
en la función biológica de la superficie proteica, por otros neutrales. Como resultado, hay
un aumento en la estabilidad de la enzima original, variación en la dependencia del pH y
modificación de las interacciones que contribuyen a la entropía configuracional.
24.1.2.3 - Propiedades de los disolventes orgánicos y sus efectos sobre la biocatálisis.

En todos los sistemas biocatalíticos que contienen disolventes, la naturaleza y
polaridad de los disolventes influyen en gran medida en la actividad y estabilidad de la
enzima. La disminución de la constante dieléctrica del medio conduce a un aumento de
las interacciones electrostáticas entre los residuos cargados de la enzima, generando
una disminución de su flexibilidad interna, acompañada de una reducción de la actividad
catalítica. Por lo tanto, se ha sugerido una alta polaridad del sitio activo de la enzima
como un factor en el aumento de la actividad catalítica. El cambio en la constante
dieléctrica también cambia los valores de pK.
282
Tales cambios en o cerca del sitio activo pueden alterar la unión o conversión del
sustrato y, si el cambio en la constante dieléctrica es drástico, la estructura tridimensional
de la proteína puede verse afectada.
La presencia de disolvente orgánico siempre constituye un riesgo de inactivación
de la enzima. Cuando se utilizan disolventes miscibles en agua, se pueden añadir
concentraciones moderadas sin efectos negativos para las enzimas. Sin embargo, la
adición de cantidades mayores, que a veces son necesarias para disolver el sustrato,
puede provocar la inactivación de la enzima. El grado de inactivación depende del
disolvente que se esté utilizando, y para cada disolvente, la inactivación se produce
cuando la concentración de agua desciende por debajo de un cierto valor.
La concentración crítica de agua para alcoholes, dioles y trioles aumenta con el
aumento del valor logP del disolvente, que se define como el logaritmo del coeficiente de
reparto de la sustancia de un sistema estándar de dos fases 1-octanol / agua. Puede
determinarse experimentalmente midiendo la partición del disolvente entre octanol y
agua, o calcularse basándose en la estructura molecular del disolvente utilizando las
constantes hidrófobas fragmentarias de Rekker.
La tendencia del disolvente a inactivar enzimas no depende únicamente de su
hidrofobicidad. Otras características físico-químicas de estos, como la geometría
molecular y la capacidad de solvatación, son importantes.
Los disolventes inmiscibles pueden influir en las enzimas no solo en la disolución
de las moléculas (toxicidad molecular), sino que la presencia de una fase orgánica
separada constituye otro riesgo de inactivación enzimática (toxicidad de fase). Por lo
general, estos disolventes con valores de logP altos, superiores a 4, provocan menos
inactivación de los biocatalizadores que los disolventes más hidrófilos. Por ejemplo, las
lipasas son más estables en disolventes hidrófobos, mientras que la quimotripsina es
más estable en disolventes hidrófilos.
Las preparaciones enzimáticas sólidas se pueden utilizar normalmente en una
amplia gama de disolventes que generan muchas posibilidades para optimizar la elección
del disolvente con respecto a la actividad enzimática, la estabilidad y otros. Sin embargo,
en sistemas que utilizan enzimas solubilizadas en medios orgánicos, la elección es más
restringida. Las enzimas modificadas covalentemente con PEG muestran buena
solubilidad principalmente en hidrocarburos aromáticos y clorados. Los hidrocarburos
aromáticos son disolventes útiles para complejos enzima-polímero. En otros disolventes,
los complejos forman suspensiones de partículas finas en lugar de soluciones. Se han
descrito microemulsiones con diferentes disolventes, pero la mayoría son hidrocarburos.
24.1.2.4 - Propiedades de los solutos y productos de reacción.

Las propiedades como solubilidad, hidrofobicidad y distribución del sustrato y las
composiciones del producto en equilibrio generan un gradiente de difusión, a saber:
Para el sustrato:
 Para impulsar el sustrato disuelto en
la fase orgánica a la interfaz, las
polaridades del medio orgánico y el
sustrato deben ser diferentes;
283
 Para mantener el sustrato soluble en la interfaz, las diferencias de polaridad
entre la interfaz y el sustrato deben ser pequeñas;
 Para situaciones en las que una
determinada concentración de sustrato
en el microambiente enzimático
provoca inhibición (inhibición por el
sustrato), la polaridad de la interfaz
debe optimizarse con respecto a la
polaridad del sustrato.
Al producto
 Para que los productos no queden
atrapados en la interfaz, las
diferencias de polaridad entre los
productos y la interfaz deben ser
grandes;
Para que los productos difundan
incluso el disolvente orgánico, la
polaridad de los mismos debe ser
similar a la de los productos; como
consecuencia, se evitará la inhibición
de los subproductos, ya que siempre
se reducirá la concentración de las
enzimas que los rodean.
24.1.3 - aplicaciones
Las principales aplicaciones de la biocatálisis en medios orgánicos se pueden dividir
en:
24.1.3.1 - Hidroxilación
La hidroxilación aromática de fenoles se realizó utilizando polifenoloxidasa
adsorbida en perlas de vidrio y suspendida en cloroformo para oxidar los sustratos a las
quinonas correspondientes, que luego pueden reducirse a compuestos hidroxilados con
ácido ascórbico. De esta forma, se obtuvieron cantidades apreciables de 4-metilcatecol a
partir de p-cresol. Esta reacción es imposible de llevar a cabo en una solución acuosa ya
que la polifenoloxidasa se inactiva rápidamente durante la reacción de hidroxilación. Los
disolventes orgánicos anhidros no permiten que las quinonas polimericen e inactiven la
enzima.
24.1.3.2 - Síntesis de ésteres

La lipasa pertenece a un grupo de enzimas que, en presencia de agua, catalizan
enlaces éster de triglicéridos. Recientemente, ha aumentado el interés comercial, debido
a la posibilidad de revertir su forma de actuar en un medio orgánico, de tal forma que se
puedan realizar reacciones de esterificación e interesterificación. Como ejemplo, tenemos
los procesos de biotransformación de lipasas en reacciones de interesterificación, para
obtener productos de interés industrial en el sector de aceites y grasas.
284
Estos productos tienen una amplia aplicación en la industria cosmética, siendo
fuentes de ácidos grasos específicos y deseables para fines terapéuticos y nutricionales.
285
Industrialmente, la esterificación de lipasa fue comercializada por Unichema
International para la producción de ésteres de ácidos grasos de alta pureza y calidad,
como isopropilmiristato, isopropilpalmitato y 2-etillexilpalmitato, que son ingredientes
utilizados en la formulación de cremas, cosméticos y otros productos de higiene. El
proceso en cuestión se lleva a cabo en reactores agitados, utilizando una preparación de
lipasa inmovilizada a una temperatura entre 50-70 ° C. El proceso permite la
recuperación de la enzima y su reutilización en lotes posteriores. Una de las
características importantes de un producto para su aplicación en cosmética o
medicamentos es su mayor o menor facilidad para formar emulsiones estables.
También hay interés en la producción de ésteres de fragancias, como el butirato
de geranilo y el acetato de mentilo, y antioxidantes, como el galato de isopropilo.
24.1.3.3 - Síntesis de péptidos

Además de la síntesis de ésteres, la síntesis de péptidos por proteasas es una de
las aplicaciones de gran potencial para la biocatálisis en medio orgánico, utilizándose
disolventes tanto anhidros como miscibles con un porcentaje máximo de agua del 50%.
Debido a la relativa hidrofilia de la mayoría de los aminoácidos, la síntesis se ha realizado
generalmente con derivados hidrófobos de aminoácidos solubles en disolventes
orgánicos.
La quimotripsina inmovilizada en sefarosa y suspendida en butanol hidratado al
10% (v / v) cataliza la unión del éster de N-acetil-L-fenilalanina-O-metílico con amidas de
alanina y glicina. Los rendimientos de dipéptidos aumentaron con la disminución del
contenido de agua en el sistema. Se obtuvieron resultados similares en la síntesis del
dipéptido Ac-Tyr-Gly-NH2 con -quimotripsina inmovilizada en quitina en acetonitrilo al
95% (v / v).
La papaína, por ejemplo, puede formar enlaces peptídicos durante la hidrólisis de
proteínas, si el pH es 6 y la concentración de péptidos está entre 30-35%. Además, se ha
demostrado que esta biosíntesis es consistente con el mecanismo de la acilenzima
intermedia, donde el grupo acilo se transfiere a una molécula nucleófila aceptora
(generalmente agua). Sin embargo, si la concentración de otro nucleófilo, como el grupo
amina (aminoácido), es lo suficientemente alta, el grupo acilenzima acilo se reparte entre
agua y el grupo amino según sus nucleofilicidades y concentraciones relativas. Si se
sustituye parte del agua por disolventes orgánicos inmiscibles, la biosíntesis se produce
incluso más rápidamente, siempre que la concentración de agua se reduzca en relación
con la del grupo amina.
Estas reacciones competitivas de biosíntesis e hidrólisis se han utilizado con éxito
en la reacción de plasteína para alterar las características de la proteína de soja. Este
proceso se lleva a cabo agregando metionina metil éster a la mezcla de reacción y
promueve su incorporación a la proteína de soja. El resultado es un producto más firme y
sabroso, con mejores cualidades nutricionales. De manera similar, se crearon mejores
tensioactivos usando proteasa para formar derivados láuricos de gelatina.
286
24.1.3.4 - Resolución de mezclas racémicas
La producción de compuestos ópticamente activos es un desafío importante para
la síntesis química. Se han utilizado lipasas, como Candida cylindracea, para resolver
alcoholes racémicos y ácidos carboxílicos mediante la hidrólisis asimétrica de los ésteres
correspondientes. Por ejemplo, la mezcla de (±) -mentol se ha resuelto por esterificación
del isómero (-) con ácido láurico en heptano, produciendo laurato de mentol con
rendimientos del orden del 95%. El mentol (+) se puede recuperar como mentol libre.
24.2 - FLUIDOS SUPERCRÍTICOS

Se ha propuesto el uso de fluidos supercríticos como un medio para mejorar la
actividad de las enzimas en un ambiente anhidro. Los fluidos supercríticos son
compuestos sometidos a condiciones de presión y temperatura por encima de los valores
críticos, donde adquieren características físicas intermedias entre el estado líquido y
gaseoso. Las propiedades de estos fluidos se pueden ajustar cambiando la presión, por
ejemplo, lo que produce variaciones en la densidad y solubilidad.
Otro aspecto atractivo de este tipo de fluido, como medio de reacción, está
relacionado con las altas difusividades, baja toxicidad e impacto ambiental, y la facilidad
de remoción y reciclaje del solvente (figura 2).
La densidad de un fluido supercrítico (250-800 kg / m³) es similar a la de un líquido
y, por tanto, es un buen disolvente; las propiedades de transporte se encuentran entre las
características de los estados líquido y gaseoso. Por ejemplo, los coeficientes de difusión
son más altos que los del líquido (de 10 a 100 veces) mientras que la viscosidad es
mucho menor (de 10 a 100 veces). Esto hace que el fluido supercrítico sea una fase muy
móvil y el hecho de que la viscosidad sea menor facilita el transporte por difusión y
reduce las necesidades de bombeo. La conductividad térmica es mayor que la del gas.
Además, las velocidades de difusión son considerablemente más altas en los medios
supercríticos en comparación con los medios líquidos normales. Esto puede aumentar la
velocidad general de bioconversión.
Manómetro
Sustrato
Válvula
Precalentador
Catalizador
Producto
Cilindro de Enzima
CO2
Polímero hidrofílico
Figura 2 - Esquema de biocatálisis con fluido supercrítico de CO2.
287
Entre los fluidos supercríticos, el más utilizado como medio de bioconversión es el
CO2, por su baja temperatura (31ºC) y presión crítica (7,65 MPa), por su carácter no
tóxico y no inflamable, por el aumento de la difusividad, cuando en comparación con una
fase líquida y la facilidad con la que se puede eliminar después de la reacción. La
descompresión simple permite la eliminación de dióxido de carbono del medio de
reacción. El CO2 supercrítico tiene características que se asemejan al hexano y, por lo
tanto, es adecuado para solubilizar compuestos hidrófobos. Las lipasas se han utilizado
con frecuencia para promover reacciones de esterificación, transesterificación, hidrólisis y
acilación y resolución de racematos en fluidos supercríticos. Otras enzimas utilizadas en
estos sistemas incluyen celulasas (hidrólisis), subtilisina (transesterificación) y colesterol
oxidasa (oxidación). La solubilidad de algunos sustratos se puede aumentar
introduciendo pequeñas fracciones de codisolventes en el medio. Como ejemplo, se
utilizó metanol (3,5%) para aumentar la solubilidad del colesterol en CO2 supercrítico.
A pesar de las ventajas que ofrece este sistema de reacción, las elevadas
presiones operativas que encarecen los equipos y los considerables costes energéticos
necesarios condicionan su aplicación más amplia.
24.3 - GASES DENSOS (GAS SOLIDO)

La viabilidad de utilizar enzimas aisladas como catalizadores en sistemas de
reacción en fase gaseosa también se demuestra en la práctica. En este tipo de sistema,
el biocatalizador forma una fase sólida, sobre la cual fluye el sustrato gaseoso. Esto
permite obtener varias moléculas responsables de fragancias y aromas, especialmente
aldehídos y alcoholes, que son de interés para la agroindustria y la industria cosmética.
Un ejemplo típico de la aplicación de este tipo de sistema de reacción es la reducción de
los aldehídos de cadena corta al alcohol correspondiente, promovida por la alcohol
deshidrogenasa. La regeneración del cofactor se realiza convirtiendo el etanol en
acetaldehído.
El uso de la enzima pura requiere la coinmovilización del cofactor, una práctica
económicamente inviable para la aplicación a gran escala. Como alternativa, se
considera el uso de células completas de Saccharomyces cerevisiae. Los sistemas
biocatalíticos en fase gaseosa ofrecen algunas ventajas sobre los sistemas en fase
líquida, tales como:
 Resistencia reducida a la transferencia
de masa de sustrato y producto;
 Altas concentraciones de sustrato / producto sin necesidad de agregar una
fase líquida;
 Fácil recuperación del biocatalizador
de la mezcla de reacción;
 Mayor estabilidad de enzimas y cofactores debido al bajo contenido de
agua;
 Reducción del riesgo de contaminación microbiana debido al uso de
temperaturas moderadamente altas (65 ° C).
288
La concentración de agua, cuantificada en términos de actividad del agua, debe
mantenerse en un rango estrecho de valores. Para valores muy bajos se observa
inactivación enzimática, efecto posiblemente asociado a la pérdida de agua ligada,
necesaria para mantener la conformación estructural catalíticamente activa de la enzima.
Valores elevados de actividad de agua, resultantes de una fase de agua libre, pueden
inducir fenómenos de desnaturalización, además de crear restricciones a la transferencia
de masa, lo que implica una aparente reducción de la actividad catalítica. La presencia
de agua libre conduce, en el límite, a sistemas trifásicos sólido-líquido-gas, en lugar de
un sistema bifásico sólido-gas.
Los sistemas biocatalíticos de gas sólido se han utilizado en reacciones de
esterificación y transesterificación con lipasas y cutinasas, en la oxidación de etanol,
utilizando células secas de Hansenula polymorpha, y en la mineralización de
tricloroetileno utilizando cepas de Burkholderia cepacia.
24.4 - LÍQUIDOS IÓNICOS

Los líquidos iónicos son líquidos compuestos enteramente por iones, por ejemplo,
tetrafluoroborato de 1-butil-4-metilpiridinio (BMPy-BF4) y sulfato de etilo de 1-etil-3-
metilimidazol (EMIM-EtSO4). Los líquidos iónicos pueden dar lugar a sustancias sólidas
con puntos de fusión muy altos, como rocas y minerales. Por otro lado, la combinación de
cationes grandes, con cloroaluminatos, dio lugar a la formación de líquidos iónicos con
puntos de fusión muy bajos (-96 ° C). Las propiedades fisicoquímicas de los líquidos
iónicos están determinadas por el porcentaje de tetracloruro de aluminio. Los líquidos
iónicos suelen tener poco color y son fáciles de usar.
Se presentan en estado líquido hasta 300ºC, un rango de temperaturas muy
amplio en comparación con el agua (100ºC) y el amoniaco (44ºC). Son buenos
disolventes para una variedad de compuestos orgánicos, inorgánicos y materiales
poliméricos. La solubilidad de algunos compuestos en estos líquidos permite reducir el
volumen del reactor. Son térmicamente estables hasta 200ºC, fáciles de preparar y no
tienen una presión de vapor efectiva.
Recientemente se ha sugerido el uso de líquidos iónicos en un sistema de
reacción multifásico como una forma potencial de reemplazar los disolventes orgánicos
comúnmente utilizados. Esta alternativa permite superar algunas desventajas asociadas
al uso de disolventes orgánicos, como la toxicidad para los operadores del proceso y la
toxicidad ambiental, así como los riesgos de explosión asociados a la naturaleza volátil e
inflamable de muchos de estos disolventes. El uso de líquidos iónicos se ha probado con
éxito en una amplia gama de reacciones asociadas con procesos catalíticos, por ejemplo,
hidrogenación de compuestos aromáticos o reacciones de Diels-Alder.
La viabilidad de aplicar esta metodología en biocatálisis también se ha utilizado
con éxito en algunos sistemas de reacción, por ejemplo, en la hidratación de 1,3-
dicianobenceno a 3-cianobenzamida, utilizando células Rhodococcus R312, como
alternativa al uso de un disolvente orgánico. , tolueno, que se ha encontrado que es
tóxico para las células. No se observó toxicidad con el uso del líquido iónico,
hexafluorofosfato de 1-butil-3-metilimidazol.
289
Sin embargo, la viscosidad de este líquido iónico es aproximadamente 300 veces
mayor que la del agua y 600 veces mayor que la del tolueno, lo que puede ser una
limitación para su uso debido a problemas de transferencia de masa asociados con su
alta viscosidad.
Otro ejemplo fue la síntesis del dipéptido Z-aspartamo utilizando la proteasa
termolisina, donde la sustitución del disolvente orgánico convencional (acetato de etilo)
por el líquido iónico mantuvo la velocidad de reacción y aumentó la estabilidad
enzimática. Esta sustitución también se mostró en reacciones catalizadas por lipasas,
donde se puede citar la acilación regioselectiva de glucosa utilizando la lipasa de
Candida antarctica en MOEMIM-BF4 (1-metoxietil-3-metil imidazol - tetrafluoroborato)
obteniendo valores de 99% de rendimiento y 93% de selectividad. Mucho más altos que
los observados usando cualquier otro solvente orgánico (Figura 3).
figura 3 - Acilación regioselectiva de glucosa mediante lipasa en líquido iónico.
24.5 - MEZCLAS EUTÉTICAS (SÓLIDO-SÓLIDO)

Estos sistemas consisten en el uso de sustratos en forma sólida, en presencia de
una cantidad de solvente que representa en términos de masa una pequeña parte del
sistema. Las fases sólidas de sustratos y / o productos inmiscibles en agua son en sí
mismos depósitos de estos compuestos. En estos sistemas, el sustrato sólido se disuelve
y se transforma en producto, en fase líquida por el biocatalizador. Si la concentración del
producto excede su límite de solubilidad, el producto cristaliza (figura 4).
Estos sistemas trifásicos, líquido-sólido-sólido, tienen la ventaja de permitir el uso
de altas concentraciones de sustrato (parte del volumen del reactor tiene que ser líquido,
ya que la bioconversión ocurre en la fase líquida), obteniendo conversiones a altas
velocidades. . El hecho de que el producto cristalice facilita su recuperación. Estos
sistemas ofrecen mayor seguridad en cuanto a proceso y menor impacto ambiental, ya
que no utilizan disolventes orgánicos. Todas estas ventajas se reflejan en costos de
producción generales más bajos en comparación con otros sistemas multifásicos.
Figura 4 - Tipos de biocatálisis sólido-sólido, donde S es sustrato y P, producto.
290
Considerando el caso general de una reacción: A + B ↔ AB + H2O, la constante
de equilibrio termodinámico correspondiente, Kt, está representada por la ecuación 1,
donde a representa las actividades de cada especie.
LaAB  Law
K t= (1)
LL LaB
aA
Cuando la reacción se lleva a cabo en un medio acuoso con especies
relativamente diluidas, la actividad del agua será igual o cercana a 1. Al reducir la
actividad del agua y utilizar concentraciones muy altas de sustratos, es posible desplazar
el equilibrio de la reacción hacia la formación de una mayor cantidad de productos.
Tomando como ejemplo la síntesis de péptidos en un sistema líquido-sólido-sólido, la
actividad de las especies disueltas en el líquido residual será idéntica a su actividad en la
fase sólida, ya que se establecerá un equilibrio entre las fases sólida y disuelta. en cada
momento de la reacción.
Dado que, en un momento dado de la reacción, alguna de las especies
consideradas existe realmente en fase sólida, solo existirá un valor de actividad del agua
compatible con la constante de equilibrio termodinámico. Para cualquier valor de aw por
debajo de este valor crítico, la reacción continuará indefinidamente hasta que se agoten
uno o más sustratos en la fase sólida. En este caso, en equilibrio, habrá un producto
sólido además de una fase líquida con todas las especies disueltas. Si aw es mayor que
el valor crítico, el equilibrio se desplazará en la dirección de la hidrólisis. Así, la fase
líquida, aunque puede representar una pequeña parte del sistema en términos de masa,
determinará la dirección de la reacción. Se observaron rendimientos de formación de
péptidos a partir de aminoácidos del orden del 80-90% en procesos que duraron unas
pocas horas, para valores de aw crítica no mucho menos de 1. Analizando el sistema en
términos de la constante de equilibrio expresada en función de las concentraciones de
especies, se obtiene Kt en la ecuación 2, donde S representa la solubilidad de las
especies; a0, es la actividad de la especie en estado sólido puro; , es el coeficiente de
actividad ( = a0 / S).
  [AB]  [AB] Ka 0  La 0 s
La
K= AB w
→K= = t  AB  AB (dos)
t
 L  [ A]  B  [B] C
[A] [B] w 0
AB  sB
A La LA sL
a
Por tanto, parece que el valor de Kc será mayor cuanto menor sea la actividad del
agua y también la solubilidad de los sustratos en el disolvente elegido. La biocatálisis
sólido-sólido se ha utilizado a escala (del orden de mM) en la síntesis de péptidos,
compuestos enantiopuros, ésteres (ácidos grasos y azúcares) y a mayor escala (del
orden de M) en la producción de aspartamo. e His-Phe-NH2.
Membranas liquidas
La separación de solutos mediante membranas líquidas se basa en una idea simple y bien
establecida: dos fases líquidas completamente miscibles, separadas por un tercer líquido,
inmiscible en ambas, que pueden transferir solutos, promoviendo una diferencia de potencial
químico en ambas fases. . En la mayoría de los casos, los dos líquidos miscibles, llamados fase
donante y aceptora, son soluciones acuosas y la tercera fase (membrana) es un líquido orgánico
(figura 5).
291
La principal ventaja de las membranas líquidas sobre las poliméricas es el mayor flujo,
gracias a que los coeficientes de difusión de los solutos son mucho mayores en la fase líquida
que en la sólida. Además, algunas técnicas de membrana líquida permiten un régimen de
difusión convectiva en lugar de difusión molecular, lo que también aumenta el flujo. Otra ventaja
es la disponibilidad de una gran cantidad de sustancias (portadores) que, cuando se agregan a la
membrana líquida, aumentan la selectividad.
Las enzimas, como las lipasas y las proteasas, son los principales portadores de ácidos
orgánicos, aminoácidos y en la separación de mezclas racémicas.
Fase donante Membrana líquida soportada Fase de

recepción (Fase Acuoso) (Fase Orgánico)
(Fase acuosa)
Complejo tensioactivo-enzima
Figura 5 - Membrana líquida soportada usando una enzima como portador.
24.6 - REFERENCIAS
― BECKMAN, EJ; CO2 supercrítico y casi crítico en la síntesis y el procesamiento de productos químicos
ecológicos. Revista de fluidos supercríticos, 28, 121-191, 2004.
Lisboa, 2003.
― CARVALHO, CML; CABRAL, JMS; Micelas inversas como medio de reacción para lipasas. Biochimie, 82,
1063-1085, 2000.
― DAVISON, BH; BARTON, JW; PETERSEN, GR; Nomenclatura y metodología para la clasificación de
biocatálisis no tradicionales. Progreso de la biotecnología, 13, 512-518, 1997.
― ERBELDINGER, M.; NI, X.; HALLING, PJ; Síntesis enzimática con sustratos principalmente no disueltos a
muy altas concentraciones. Enzyme and Microbial Technology, 23, 141-148, 1998.
― GOTO, M.; Avances recientes en la extracción de proteínas y la separación quiral de biomoléculas. Ciencia y
tecnología de Tsinghua, 11 (2), 194-201, 2006.
292
― HADIK, P.; SZABÓ, LP; NAGY, E.; FARKAS, Z.; Enantioseparación de ácido D, L-láctico mediante
técnicas de membrana. Journal of Membrane Science, 251, 223-232, 2005.
― KIM, HJ; YOUN, SH; SHIN, CS; Síntesis catalizada por lipasa de ésteres de ácidos grasos y sorbitol a
concentraciones de sustrato extremadamente altas. Revista de biotecnología, 123, 174-184, 2006.
― KLIBANOV, AM; Mejora de las enzimas usándolas en disolventes orgánicos. Nature, 409, 241-246, 2001.
― KLYACHKO, NL; LEVASHOV, AV; Síntesis bioorgánica en micelas inversas y sistemas relacion ados.
Opinión actual en ciencia coloide y de interfaz, 8, 179-186, 2003.
― KNEZ, Z.; HABULIN, M.; PRIMOZIC, M.; Reacciones enzimáticas en gases densos. Revista de ingeniería
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― KNEZ, Z.; HABULIN, M.; Gases comprimidos como disolventes alternativos de reacción enzimática: una breve
reseña.
Revista de fluidos supercríticos, 23, 29-42, 2003.
― KOSKINEN, AMP; KLIBANOV, AM; Reacciones enzimáticas en medios orgánicos, Blackie Academic &
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― KRAGL, U.; ECKSTEIN, M.; KAFTZIK, N.; Catálisis enzimática en líquidos iónicos. Opinión actual en
biotecnología, 13, 565-571, 2002.
― MATSUDA, T.; WATANABE, K.; HARADA, T.; NAKAMURA, K.; Reacciones enzimáticas en CO2
supercrítico: carboxilación, reducción asimétrica y esterificación. Catálisis hoy, 96, 103-111, 2004.
― PARK, S.; KAZLAUSKAS, RJ; Biocatálisis en iónicos líquidos: ventajas más allá de la tecnología verde.
Opinión actual en biotecnología, 14, 432-437, 2003.
― SAHOO, GC; DUTTA, NN; DASS, NN; Extracción de membrana líquida de cefalosporina-C del caldo de
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Revista de la Sociedad Química Estadounidense, 108, 2768-2769, 1986.
http://www.metafysica.nl/ontology/general_ontology_29m1b.html
293
CAPÍTULO 25 - OTRAS APLICACIONES
25.1 - INDUSTRIA DE ALIMENTOS
25.1.1 - Azucar refinada
25.1.1.1 - Procesamiento de azúcar de remolacha

Durante la producción de azúcar de remolacha, se produce una acumulación de
rafinosa en el licor madre, que al alcanzar el valor del 8%, cristaliza contaminando el
producto final. Por este motivo, se recomienda la eliminación de este trisacárido con la
rafinasa (melibiasis o -galactosidasa) obtenida del hongo Mortierella vinacea, que crece
en forma de gránulos dentro del cual se encuentra la enzima. Los gránulos se utilizan en
reactores adecuados para la conversión de rafinosa, utilizándose 70.000 unidades
galactosídicas por gramo de rafinosa durante 2 horas, 30 ° Brix, pH 5,2 y 45 ° C, para
lograr una hidrólisis del 80%.
25.1.1.2 - Eliminación de dextrano del azúcar obtenido de la caña de azúcar

Durante el procesamiento del jugo de caña de azúcar para la producción de
azúcar, el polisacárido dextrano se forma a partir de la actividad metabólica de
Leuconostoc mesenteroides, que se desarrolla bien en las condiciones de tratamiento del
jugo y dificulta varias operaciones como la clarificación. Para superar este problema, se
utiliza la dextranasa obtenida de Penicillium funiculosum.
25.1.2 - Modificación enzimática de materiales con almidón

Un campo muy importante, en el que las enzimas han demostrado ser de gran
valor, es la industria del almidón. El almidón es un polisacárido muy utilizado en la
fabricación de varios "productos de sabor dulce" y está formado por cadenas lineales y
cadenas altamente ramificadas de moléculas de glucosa.
El descubrimiento de preparaciones enzimáticas, capaces de descomponer el
almidón en glucosa, favoreció la transición de la hidrólisis ácida a la enzimática. Hoy en
día, casi toda la hidrólisis del almidón se lleva a cabo mediante el uso de enzimas. La alta
especificidad de estas reacciones enzimáticas, unida a la gran actividad de las
preparaciones disponibles, permite la reducción de subproductos indeseables. Las
enzimas aumentan la productividad del proceso hidrolítico, mejoran la calidad del
producto final y promueven el ahorro energético.
Tabla 1 - Usos de productos resultantes de la hidrólisis del almidón
Producto Usos
Maltodextrinas Estabilizadores, espesantes, encías
Jarabes mixtos Confitería, refrescos
Jarabe de maltosa Confitería
Jarabe de glucosa Refrescos, dulces
Jarabe de alta fructosa (JMAF) Refrescos, conservas, almíbares
294
La conversión enzimática del almidón, que produce un jarabe de sabor dulce, se
subdivide en 3 etapas: licuefacción, sacarificación e isomerización.
En el proceso de licuefacción, el almidón se convierte en una mezcla de varios
oligosacáridos y dextrinas diferentes mediante el uso de -amilasas. Las maltodextrinas
ligeramente dulces experimentan una conversión adicional mediante la adición de otras
enzimas. La amiloglucosidasa (glucoamilasa) todavía hidroliza completamente los
compuestos de glucosa, en un proceso de sacarificación, y se pueden agregar otras
enzimas, como la pululanasa reductora. Mediante la acción de la glucosa isomerasa, la
glucosa se puede isomerizar en fructosa, de igual valor calórico, pero con un sabor dos
veces más dulce.
El almidón se usa ampliamente en la producción de "jarabe de maíz con alto
contenido de fructosa - Karo" (XMRF). Es una mezcla de glucosa y fructosa que sirve
para endulzar muchos productos alimenticios e incluso reemplazar el azúcar de caña o
remolacha, previamente utilizada en la elaboración de bebidas, productos lácteos,
productos de panadería y alimentos enlatados, como se muestra en la Tabla 1. El
contenido de fructosa de XMRF es, en general, 42 o 55% (Tabla 2).
Tabla 2 - Composición de los jarabes
Producto % EN Glucos Maltosa Isomaltosa Maltotriosi Fructos
a s a
Maltodextrinas 48 - 60 2-9 48 - 55 - 15 - 16 -
Jarabes mixtos 56 - 58 22 - 35 40 - 48 - - -
Jarabe de 40 - 45 16 - 20 41 - 44 - - -
maltosa
Jarabe de glucosa 96 - 98 95 - 97 1-2 0,5 - 2 - -
Jarabe de alta 98 52 1-2 0,5 - 2 - 42
fructosa
25.2 - INDUSTRIA COSMÉTICA

El interés de la cosmetología por las enzimas ha crecido tanto en el área técnica
como en el marketing. Desde la década de 1960, los estudios han informado del uso de
enzimas en el área cosmética con el fin de mejorar las condiciones de la piel y normalizar
sus funciones. Actualmente se ha investigado mucho sobre las actividades que ejercen
las enzimas sobre la piel y el cabello, cuando se incorporan en las distintas formas
cosméticas.
La manipulación de enzimas en formulaciones cosméticas y el estudio de su
efectividad requieren cuidados y conocimientos técnicos para que su actividad no se
reduzca e incluso cancele. En ocasiones no basta con incorporarlos al vehículo acabado,
se debe comprobar la compatibilidad con el resto de componentes, como principios
activos o vehículos, y también con el material de embalaje. También hay que considerar
el método de incorporación de la enzima con la que se realiza esta operación.
El mantenimiento de su estabilidad física, química y microbiológica asegura su
efectividad durante todo el período de vigencia del producto, garantizando la seguridad al
usuario,
295
sin riesgo de reacciones irritantes o alérgicas. Por tanto, las enzimas para uso en
cosmética deben cumplir los siguientes requisitos:
1. La estabilidad de la enzima debe permitir la preparación de un producto comercial,
que no cambia en condiciones normales de almacenamiento.
2. Los componentes de la formulación cosmética no deben inhibir la enzima. Los
tensioactivos, especialmente los aniónicos, pueden inhibir las enzimas. Muchos
cosméticos contienen tensioactivos, en particular emulsiones y jabones.
3. La enzima no debe producir toxicidad o irritación cuando se aplica tópicamente.
4. La incorporación de enzimas en formulaciones no es tan sencilla, pero es posible. El
primer punto a considerar es la elección de la enzima a utilizar, que dependerá de la
naturaleza del sustrato y del medio donde se añadirá la enzima. Luego factores
relacionados con la formulación, que pueden influir en la actividad de la enzima, tales
como:
 El pH del medio: la mayoría de las preparaciones para uso tópico están
formuladas al pH normal de la piel (4,2 - 5,6) y, por lo tanto, las enzimas elegidas
deben estar activas a este pH, o podemos tamponar la preparación al pH en el que la
enzima tiene actividad, siempre que este pH no provoque irritación cutánea y se
mantenga en condiciones fisiológicas. En el caso de mezclas de enzimas, se debe
considerar el pH requerido de cada enzima y no se deben usar en la mezcla
combinaciones de enzimas con requisitos de pH muy diferentes. Otro aspecto que se
debe tener en cuenta es el pH de la estabilidad de la enzima, ya que esto permitirá
aumentar su longevidad en la preparación.
 La forma cosmética: Deben evitarse las incompatibilidades básicas entre las
enzimas y los componentes de la formulación. Las formas cosméticas más utilizadas
son las lociones y cremas cremosas, donde hay presencia de agua, que puede
interferir con la estabilidad de las enzimas. Las enzimas incorporadas en
preparaciones no acuosas, como pomadas, son desventajosas. Esto se debe a que
estas preparaciones son desagradables de usar, debido a su alto contenido en
grasas, y la falta de humedad puede impedir o disminuir la correcta funcionalidad de
las enzimas. A menos que se aplique una fuente externa de humedad, la enzima
dependerá de los exudados del cuerpo para suministrar el agua necesaria para su
solubilización y para que ocurran reacciones hidrolíticas.
 Compatibilidad base: en este caso, se evalúa la estabilidad de las emulsiones
frente a las enzimas. No se puede esperar que una emulsión que tiene una fase
lipídica sea estable en presencia de una enzima lipolítica. Asimismo, no se puede
esperar que el tensioactivo de una emulsión en forma de éster sea estable frente a la
acción hidrolítica de las esterasas. Por tanto, se debe elegir el emulsionante
apropiado para cada enzima. El uso de papaína y lisozima combinados con
biopolímeros en cosmética ya es una realidad, y el número de patentes en esta área
ha ido aumentando cada año.
El uso de enzimas en cosmetología es amplio, abarcando las diversas formas
cosméticas. A continuación se enumeran algunos productos en los que se pueden
incorporar enzimas.
296
25.2.1 - Depilatorios y alisadores
En las formulaciones depilatorias se utilizan enzimas como la queratinasa, la
cistina reductasa, la glutatión reductasa y la papaína para facilitar el proceso de
depilación. El mecanismo de acción implica tanto la solubilización de sus constituyentes,
como puede actuar sobre la parte proteica de la piel, facilitando la depilación. Se debe
tener cuidado con el pH de la fórmula, que debe ser compatible con la actividad y
estabilidad de estas enzimas, que es de 7 a 8.
Los sistemas depilatorios con enzimas funcionan más lentamente que las fórmulas
con tioglicolatos, pero son más suaves y menos irritantes para la piel. Después de la
depilación se han utilizado preparados a base de papaína al 0,8% (pH 5,5) para ralentizar
el crecimiento del cabello. Después de un uso prolongado, la matriz del cabello puede
dañarse, inhibiendo su crecimiento.
En el caso de las cremas depilatorias es difícil encontrar una preparación eficaz,
ya que el agente depilador ideal sería aquel que no presente un olor desagradable, que
elimine el vello en pocos minutos, pero que no provoque irritación cutánea.
La queratina en el cabello y las uñas se llama queratina dura debido a su alto
contenido de cistina. La queratina de la piel se llama queratina blanda. La degradación de
la queratina dura del cabello por enzimas (queratinasas) es difícil, sin irritación de la piel,
ya que es menos resistente por la presencia de queratina blanda. Es posible utilizar
enzimas en planchas y rizadores donde el cabello no se destruye, pero solo se altera la
disposición de los enlaces disulfuro de queratina, y de forma más suave que las
preparaciones tradicionales.
25.2.2 - Sales de baño

En esta forma cosmética podemos incorporar lipasas para eliminar grasas, y
proteasas que actúan sobre las proteínas de la queratina de las células muertas de la
piel, descomponiéndolas en moléculas más pequeñas y facilitando su eliminación con
agua, aportando limpieza y tersura a la piel. .
El propósito de añadir una enzima en los productos de baño es acelerar los
distintos efectos que se quieren obtener al bañarse, como el efecto detergente. La piel
consta de tres capas, una de las cuales es una capa queratinizada y, como la queratina
es una proteína, acaba siendo el objetivo de la proteasa. A medida que la piel se
queratiniza, se regenera continuamente y cuando la queratina llega a la superficie de la
piel en este proceso de queratinización, se mezcla con las grasas de las glándulas
sebáceas, el sudor y el polvo. Esta mezcla bajo la acción de la temperatura y la oxidación
puede resultar en infección, mal olor y dermatitis. Por lo que debes contar con productos
cosméticos eficientes para eliminar toda esta mezcla de manera eficiente.
Cuando se desarrolla cualquier producto que contenga enzimas, se debe evaluar
rigurosamente la estabilidad del efecto enzimático. Un experimento realizado mostró que
al agregar un producto de baño que contiene una enzima en una bañera y mantener la
solución a una temperatura de 40 ° C durante 24 h, después de una semana, queda al
menos el 50% de la actividad enzimática presente en la solución. .
297
25.2.3 - Productos para "Peeling químico"
Las enzimas proteolíticas (tripsina, papaína y bromelina) actúan sobre las células
queratínicas muertas presentes en la epidermis, facilitando su eliminación. Actúan
reduciendo el grosor del estrato córneo y proporcionan una condición más natural a la
piel. También se pueden utilizar en hiperqueratinosis ("callosidades"), para reducir el
grosor de la piel.
En el caso del acné, se puede utilizar un complejo de enzimas lipolíticas con el fin
de suavizar y reducir el sebo, reduciendo el bloqueo del poro folicular. El uso de sistemas
proteolíticos puede contribuir a la reducción de la queratina que obstruye el conducto
excretor de la glándula sebácea, y también ayudaría en la remoción de tejido necrótico
en los casos más severos de acné, donde ocurre la inflamación.
25.2.4 - Otras aplicaciones en cosmetología

Además de los productos mencionados anteriormente, las enzimas también se
aplican en el campo cosmetológico en:
25.2.4.1 - Productos anticaspa

La caspa está formada por fragmentos de la epidermis y contiene proteínas y
lípidos. El uso de fórmulas que contienen enzimas proteolíticas y lipolíticas ayuda a
eliminar las escamas que son difíciles de eliminar con el lavado con champús
convencionales.
25.2.4.2 - tintes
Se pueden utilizar enzimas como la peróxido dismutasa, que actúan como
inhibidores de la oxidación prematura de bases coloreadas.
25.2.4.3 - Productos anti-radicales libres

Las enzimas que actúan contra los radicales libres protegen la piel, retrasando el
envejecimiento cutáneo. Tienen la función de capturar radicales libres, responsables de
las reacciones de oxidación. Como ejemplo, tenemos catalasa y superóxido dismutasa.
La SOD (superóxido dismutasa) de origen marino fue patentada en 1973 por
L´oreal para su uso en cosmética en general. Con la edad, los niveles de SOD
disminuyen en los tejidos. La SOD en combinación con la catalasa, que limpia los
subproductos de la dismutación, el peróxido de hidrógeno, es responsable de proteger
las proteínas contra el envejecimiento debido a la oxidación.
La SOD actúa por dismutación, un proceso mediante el cual un radical libre de
oxígeno altamente reactivo se convierte en una forma menos reactiva. Lo mismo ocurre
con el peróxido de hidrógeno, razón por la cual SOD se puede usar para catálisis juntos.
25.2.4.4 - Función antimicrobiana

Otra aplicación de la enzima en cosméticos puede ser evitar que la formulación
cosmética sea atacada por bacterias. Este proceso se basa en enzimas, como la
peroxidasa, que consumen el oxígeno presente en la formulación, creando un medio no
propicio a la contaminación.
298
25.2.5 - Inhibidores de metaloproteasas
Otra función que también cumplen estos cosméticos es que no tienen ninguna
enzima en su formulación pero sí sustancias que inhibirán las enzimas que están
presentes en nuestra piel y que le causan problemas.
Las metaloproteinasas de la matriz son enzimas presentes en la piel,
responsables de la degradación de las macromoléculas que forman la matriz extracelular
de la piel (MEC). La matriz extracelular juega un papel muy importante en las diferentes
funciones biológicas, ya que es la que establece la integridad tridimensional de la piel.
El equilibrio enzimático de las metaloproteinasas está naturalmente controlado por
la presencia de inhibidores. El envejecimiento y las agresiones ambientales, como las
radiaciones UV, alteran este equilibrio, favoreciendo una excesiva actividad enzimática.
Este exceso de actividad provoca un colapso de la malla de la red de matriz extracelular
y contribuye a los efectos visibles de la lesión UV: arrugas, pérdida de elasticidad y
dilatación de los vasos microcapilares superficiales. Los inhibidores de metaloproteinasas
son recursos nuevos e interesantes que pueden utilizarse para dar diferentes
características a los cosméticos.
Las metaloproteinasas de matriz (MPM) son una familia de proteínas que
participan en la degradación de macromoléculas MEC. Hasta el momento, se han
identificado 20 MPM. La actividad fisiológica de MPM está controlada por algunos
fenómenos, como la interacción MEC-molécula y la estimulación de la célula a través de
enlaces específicos. Hay tres formas principales de controlar la actividad de MPM:
regular la transcripción genética; conversión de proenzima latente en enzima activa;
inactivación de la enzima por la presencia de inhibidores selectivos.
MPM puede estar regulado por una serie de factores que influyen. El regulador
natural se denomina inhibidor tisular de metaloproteinasas (ITMP) y puede inhibir la
actividad enzimática de las MPM.
Los ITMP son producidos por células de varios órganos, incluida la piel. Se unen a
MPM en una proporción estequiométrica de 1: 1 para formar complejos no covalentes
reversibles. La pérdida del inhibidor de ITMP natural desplaza el equilibrio hacia una
actividad resultante de las MPM y una degradación excesiva de las macromoléculas de
las MEC.
Condiciones como el envejecimiento o la exposición prolongada a la luz
ultravioleta están asociadas con:
 Caída de la síntesis de fibras de
colágeno;
 Elevación de la actividad de MPM;
 Caída en la expresión de los ITMP.
Los inhibidores de MPM pueden formar parte de varias formulaciones cosméticas
para tipos de piel específicos. El refuerzo del ECM puede ayudar a promover el tono de
la piel, reduciendo así la aparición de arrugas y patas de gallo. Los productos diseñados
para mejorar la firmeza y elasticidad de la piel también pueden beneficiarse de la adición
de inhibidores de MPM.
299
La luz ultravioleta no solo está asociada con la dilatación capilar, sino que también
induce MPM. Por lo tanto, los inhibidores de MPM son ideales para productos destinados
a la protección solar, en ese sentido, los inhibidores de MPM se utilizan como protectores
contra las agresiones ambientales.
Los inhibidores de MPM podrían contribuir a la eficacia de cualquier formulación
cosmética que busque: retrasar la aparición de líneas de piel flácida, reducir el
enrojecimiento de la piel, reducir la aparición de venas en telaraña (telangiectasia),
reducir la aparición de ojeras cuando alrededor de los ojos, mejoran la cohesión de la
ECM, mejoran las funciones protectoras naturales de la piel (contra la contaminación, el
estrés, el envejecimiento, el sol) y mejoran la firmeza y elasticidad de la piel.
25.2.6 - Ejemplos comerciales

Los productos cosméticos que contienen una enzima (lipasa) y precursores de
hidroxiácidos se reivindican en la patente francesa (Maurin E, Sera D, Guth G - L'Oreal).
El precursor y la lipasa entran en contacto solo en el momento de la aplicación en la piel
y, por lo tanto, se mantienen en recipientes separados hasta el momento de su uso.
En la patente francesa (Holtzinger G-yves Rocher), se utiliza composiciones
cosméticas para el cabello que contienen lipasa e indicadas contra la fluidización del
material sebáceo.
Los productos cosméticos diseñados para promover el blanqueamiento de la piel
utilizan enzimas obtenidas del arroz. La patente japonesa (Sawaki S, Yamada K, Ashida
M, Maruyama K - Kyoei Chemical) utiliza tripsina, papaína, peptidasa y / o bromelina
sobre una base. Esta composición inhibe la formación de melanina y la pigmentación
producida por la radiación UV.
25.3 - RESUMEN ORGÁNICO

La síntesis química es un área donde el uso de catálisis enzimática ha sido
durante algún tiempo una gran promesa. Sin embargo, la industria química ha tardado en
implementar estos procesos enzimáticos. En esta área, el más desarrollado es el uso de
procesos enzimáticos para la producción de un enantiómero único de un intermedio
utilizado para la producción de fármacos y agroquímicos.
Este mercado se caracteriza por un alto grado de fragmentación, ya que pocas
enzimas tienen aplicabilidad en una amplia variedad de procesos. Recientemente, los
procesos enzimáticos introducidos en este campo incluyen el uso de lipasas en la
producción de alcoholes enantiopuros y amidas; nitrilasas para la producción de ácidos
carboxílicos enantiopuros y acilasas para la producción de nuevas penicilinas
semisintéticas.
Otro ejemplo es la síntesis enzimática de aspartamo, que es un dipéptido,
actualmente muy utilizado como edulcorante, formado por la condensación del ácido L-
aspártico con el éster metílico de L-fenilalanina. Su poder edulcorante depende de la
forma correcta conseguida en el acoplamiento de dos aminoácidos, siendo la forma
adecuada con poder edulcorante 200 veces mayor que la sacarosa y la forma con
sabor amargo. Esta estereoespecificidad selectiva eleva los costes de obtención, cuando
se utiliza un proceso químico, y por tanto el método enzimático utilizando proteasa de
Bacillus sp. está siendo utilizado cada vez más por la industria japonesa y europea.
300
Extras
Solubilización de sólidos de té
Cuando se desea obtener té de disolución instantánea, la turbidez es común debido
a la presencia de taninos. Estas sustancias se pueden eliminar mediante la tanasa obtenida
de Aspergillus niger y se encuentran en forma de polvo. Para ello se utilizan 3 g de tanasa
por litro de extracto de té, manteniendo el sistema en agitación a 30 ° C durante 70 min y
pH 5,5.
Eliminación de tioglucósidos
Las semillas de mostaza (Brassica juncea) tienen una enzima llamada mirosinasa, que
actúa sobre los tioglucósidos, liberando aliliostiocianato, que se separa por destilación. El
procedimiento consiste en colocar una cierta cantidad de semillas de mostaza a 100 ° C
durante 2 horas y luego molerlas. A este polvo se le añaden semillas de mostaza recién
molidas (la mirosinasa es activa) y agua, hasta obtener una humedad en torno al 16%. La
pasta se mantiene a 50 ° C durante 45 min, aumentando a 115 ° C durante 30 min, con el
fin de cocinar la pasta, romper las membranas celulares para liberar el aceite, reducir el
contenido de humedad y eliminar el isotiocianato de alilo. El producto final, que en
condiciones normales contendría 0.5% del compuesto mencionado anteriormente,
contendrá solo 0.04%.
Peladura y limpieza de la carcasa del camarón
Un proceso típico sería mezclar 2 kg de camarón sin cabeza con agua; 7,6 g de
ficina; 15,2 g de amilasa y 7 g de bicarbonato de sodio; pH 7,8, 52 ° C, durante 30
minutos. Se recolectan los camarones, que se lavan profusamente con chorros de agua,
seguidos de chorros de aire. Esto elimina todos los escombros. Al final del proceso se
obtienen aproximadamente 1,2 kg de camarón limpio.
25.4 - REFERENCIAS
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la producción de alimentos, vol. 4; Editora Edgard Blücher Ltda., São Paulo, 2001.
― BELMARES, R.; CONTRERAS-ESQUIVEL, JC; RODRÍGUEZ-HERRERA, R.; CORONEL, AR;
AGUILAR, CN; Producción microbiana de tanasa: una enzima con potencial uso en la industria alimentaria.
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― CAENN, R.; CHILLINGAR, GV; Fluidos de perforación: estado del arte. Journal of Petroleum Science and
Engineering, 14, 221-230, 1996.
― CANGREJO, WD; MITCHINSON, C.; Enzimas involucradas en la transformación del almidón en azúcares.
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― FRIEDRICH, J.; GRADISAR, H.; VRECL, M.; POGACNIK, A.; Degradación in vitro de la epidermis de la
piel porcina por una queratinasa fúngica de Doratomyces microsporus. Tecnología enzimática y microbiana,
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― HASAN, F.; SHAH, AA; HAMEED, A.; Aplicaciones industriales de las lipasas microbianas. Tecnología
301
― HIRATA, M.; ISHIMINE, T.; HIRATA, A.; Desarrollo de un método novedoso para la síntesis enzimática de
péptidos mediante reacción extractiva. Revista de Ingeniería Química de Japón, 30 (3), 467-477, 1997.
― JIN, F.; LI, Y.; ZHANG, C.; YU, H.; Producción termoestable de -amilasa y -galactosidasa a partir de
Bacillus sp. Termófilo y aeróbico. Cepa JF. Process Biochemistry, 36, 559-564, 2001.
― KIRK, O.; BORCHERT, TV; FUGLSANG, CC; Aplicaciones de enzimas industriales. Opinión actual en
biotecnología, 13, 345-351, 2002.
― ROCHA FILHO, PA. Cosmética y Biotecnología. Cosméticos y artículos de tocador, v. 9, n. 4, pág. 22 -28 de 1997
― SANTOS, EP. Enzimas en cosmetología. Cosmética y artículos de tocador, São Paulo, Vol. 13, n. 4, pág. 66-71,
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― SÍ, YC; LEE, SG; LEE, DC; KANG, BY; PARQUE, KM; LEE, JY; KIM, MS; CHANG, ES;
RHEE, JS; Estabilización de papaína y lisozima para aplicación a productos cosméticos. Letras de biotecnología,
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― TSAO, R.; YU, Q.; FRIESEN, I.; POTTER, J.; CHIBA, M.; Factores que afectan la disolución y degradación
de sinigrina e isotiocianato de alilo derivados de la mostaza oriental en medios acuosos. Revista de quí mica
agrícola y alimentaria, 48, 1898-1902, 2000.
― VELASCO, MVR; Uso de enzimas en cosmética. Revista Cosmiatria y Estética, São Paulo, Vol. 7, n.
3, pág. 8 y 9 de 1999.
― WILKINSON, JB; MOORE, RJ; Cosmetología de Harry; Ediciones Díaz de Santos, SA, Madrid, 1990.
302
CAPÍTULO 26 - BIOSEGURIDAD EN LA APLICACIÓN ENZYM
La producción y comercialización de una enzima siguen estándares estrictos en

cualquier país de la Unión Europea (UE) y están sujetos a diversas leyes. La mayoría de
las enzimas están exentas de las pautas de seguridad, ya que se consideran ayudas
tecnológicas y no aditivos alimentarios. Los aditivos, con efecto tecnológico, dependen de
autorización, inclusión en lista positiva, y su presencia debe ser declarada en la etiqueta
junto con los demás ingredientes del producto. Las enzimas consideradas coadyuvantes
o ayudas tecnológicas, que no presentan ningún riesgo para la salud y no se consumen
como ingrediente alimentario, están exentas de estas obligaciones. La separación entre
aditivo y adyuvante para enzimas no siempre es fácil, pudiendo utilizarse como aditivos o
adyuvantes, dependiendo del proceso en cuestión.
El JECFA (Comité Mixto FAO / OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios - Unión
del Comité de Especialistas en Aditivos Alimentarios de la Organización de las Naciones
Unidas para la Agricultura y la Alimentación y la Organización Mundial de la Salud) sirve
como referencia para los consultores científicos de la FAO, la OMS, sus estados
miembros y para la Comisión del CODEX Alimentarius.
26.1 - EUROPA
En Europa, los factores importantes a la hora de establecer la regulación del uso
de una enzima específica son:
• El propósito de su uso  la enzima se utiliza como auxiliar de proceso y
puede eliminarse o permanecer en el alimento durante el procesamiento; o como
aditivo, que tiene una función específica en el alimento final que llega al
consumidor;
• El tipo de alimento en el que se utilizará una enzima.  definido en los
países donde se utilizará la enzima en los alimentos, ya que la normativa no está
armonizada y, por tanto, varía en los diferentes países de la comunidad europea;
• El origen de la enzima  Las enzimas industriales pueden obtenerse de
fuentes animales, vegetales, microbianas o por organismos modificados
genéticamente (OGM). Estos pueden estar bajo diferentes regulaciones, y algunos
países tienen leyes especiales para enzimas derivadas de OGM.
Las enzimas derivadas de OMG tienen algunas consideraciones adicionales con
respecto al material introducido:
• Precaución con el marcador resistente a los antibióticos (si lo hay, debe estar
inactivado o codificar un antibiótico sin uso clínico);
• El organismo productor no puede ser potencialmente patógeno;
• Sus productos no deben contener toxinas proteicas o enzimas que puedan estar
involucradas en la síntesis de toxinas u otras sustancias indeseables.
Las consecuencias de la actual situación regulatoria en Europa:
303
Aunque la aprobación de una enzima sigue estándares estrictos en cualquier país
de la comunidad europea, no existe un sistema único de aprobación, que requiere
tiempo, mano de obra y otros gastos innecesarios para su aprobación. Además, no
siempre existe un reconocimiento mutuo de los tipos de pruebas de seguridad a realizar,
lo que puede dar lugar al uso innecesario de animales de laboratorio.
La falta de sistemas armonizados y un plazo fijo para las aprobaciones genera
incertidumbre sobre el rendimiento de las inversiones en I + D para la industria de las
enzimas.
La falta de aplicación de determinadas normas comunes a todos los Estados
miembros puede prohibir el uso de una determinada enzima en la producción de
alimentos dentro de su propio territorio, pero los productos alimenticios producidos con
dicha enzima pueden importarse debido al mercado abierto de la UE.
Los partidos políticos, el Parlamento y los grupos de acción también reclaman la
necesidad de una regulación uniforme de las enzimas, principalmente procedentes de
OMG.
Por tanto, la ausencia de una situación jurídica armonizada lleva a la industria
alimentaria a crear sus propias normas, creando una situación complicada y costosa. Los
países sin una legislación específica sobre enzimas, como Alemania, pueden generar
una baja confianza del consumidor.
26.2 - EE.UU
En los Estados Unidos, las enzimas están actualmente reguladas por la
Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) bajo la Ley de
Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (Ley de Alimentos, Medicamentos y
Cosméticos). Los criterios adoptados por la FDA incluyen análisis de seguridad de:
• Enzima utilizada;
• Produciendo microorganismos;
• Proceso de producción;
• Preparación enzimática.
Las enzimas se pueden regular de dos formas: como un aditivo secundario directo
o como un ingrediente del tipo GRAS (generalmente reconocido como seguro).
Un aditivo alimentario requiere aprobación previa para su uso a través de un
documento oficial (petición). Este procedimiento puede tardar varios años. El
procedimiento de evaluación de la seguridad de las preparaciones enzimáticas, tanto las
derivadas de OMG como las convencionales, es rígido. En el caso de las enzimas que se
consideran GRAS, las que se utilizan comúnmente en los alimentos desde o antes de
1958, o aprobadas por procesos científicos de seguridad, no requieren la aprobación de
la FDA. La compañía proporciona el certificado de que la sustancia es GRAS o segura
para uso general en alimentos y, si se desea, se le puede pedir a la FDA que confirme el
estado GRAS a través de un proceso específico.
Cuando la FDA declara el estado GRAS, las regulaciones se publican en el
Código de Regulaciones Federales. Una vez que se clasifica una enzima
304
al igual que GRAS, una empresa puede comercializarlo, aunque la FDA esté revisando el
proceso de solicitud.
La FDA generalmente acepta la decisión de evaluación de seguridad descrita
inicialmente en 1983, ampliada por el Consejo Internacional de Biotecnología Alimentaria
en 1990 y ampliada en 2001. Todas las nuevas preparaciones enzimáticas se someten a
una evaluación de seguridad: del organismo que la produjo, del componente enzima,
proceso de producción y exposición alimentaria, y cualquier actividad secundaria.
26.3 - BRASIL
La legislación vigente (Ley de Bioseguridad, 8,974 / 95, modificada y actualizada
por MP 2.191-9) atribuye a la CTNBio (Comisión Técnica Nacional de Bioseguridad),
integrada por 36 miembros designados por las sociedades representativas de la
comunidad científica brasileña, por los Ministerios sectoriales. (Salud, Agricultura,
Abastecimiento y Ganadería, Medio Ambiente, Ciencia y Tecnología, Educación y
Relaciones Exteriores), por entidades representativas del segmento de consumidores,
salud de los trabajadores y del negocio biotecnológico, la competencia para establecer
normas y reglamentos relacionados con actividades y proyectos que contemplen la
construcción, cultivo, manipulación, uso, transporte, almacenamiento, comercialización,
consumo, liberación y disposición de OGM y sus derivados. La legislación también define
la relación entre CTNBio y los Ministerios sectoriales (Salud,
CTNBio realiza análisis caso por caso para emitir un dictamen técnico previo
concluyente, verifica la inocuidad de sustancias en alimentos derivados de la
biotecnología moderna de acuerdo con las evaluaciones de riesgo más avanzadas,
incorporando los aportes del desarrollo científico y tecnológico en los campos de la
toxicología y otras ciencias afines.
Recientemente, a finales de 2005, ANVISA (Agencia Nacional de Vigilancia
Sanitaria) dio a conocer la consulta pública del Reglamento Técnico sobre Uso de
Enzimas y Preparados Enzimáticos en la Producción de Alimentos para Consumo
Humano, donde adopta algunas definiciones, tales como:
• Enzimas: compuestos químicos naturales constituidos por proteínas biológicamente
activas, catalizadores de reacciones durante el procesamiento de los alimentos,
facilitando su obtención, estabilizándolos o provocando cambios deseables en sus
características.
• Preparación enzimática: es la mezcla de dos o más enzimas, que contiene o no
sustancias autorizadas.
Las enzimas se enumeran según su origen animal, vegetal, bacterias, hongos,
levaduras y OGM, y deben cumplir con los requisitos de identidad y pureza del JECFA y
la FDA.
305
26.4 - TOXICOLOGIA
Las enzimas puras por sí solas no son tóxicas, pero como cualquier proteína
puede causar alergias, especialmente si es inhalable, como los concentrados de
proteasa. La sensibilidad a las enzimas que se utilizan como aditivos alimentarios es
rara, ya que las cantidades añadidas de enzima son pequeñas, en el rango de unas
pocas partes por millón, y puede ocurrir, solo en algunos casos, si la enzima no se ha
desnaturalizado térmicamente.
Los productores de enzimas ya han tomado medidas para prevenir o minimizar
estos problemas, como formular solo enzimas granuladas, microcapsuladas o líquidas.
También se impusieron límites en relación con los contaminantes, siguiendo las
recomendaciones del JECFA, determinadas en el cuadro 1.
Cuadro 1 - Limitaciones de contaminantes en preparaciones enzimáticas, según el JECFA

Contaminantes Limites
Arsénico  3 mg / kg
Plomo  10 mg / kg
Rieles pesado  40 mg / kg
Salmonella, Escherichia coli Ausente en muestra de
25 g Coliformes  30 / g
Bacterias totales salud  50000 / g
Micotoxina  10   
Actividad antibiótico ausente
Regulación en otros países

Canadá:
En Canadá, las enzimas están reguladas por Health Canada de acuerdo con las leyes
y reglamentos de alimentos y medicamentos del país, donde todas se consideran aditivos
alimentarios y requieren aprobación previa para su comercialización.
Las enzimas se enumeran por actividad, fuentes específicas, aplicaciones permitidas
y límites de uso, y la evaluación de los procedimientos de seguridad se describe solo en
términos generales.
Japón:
En Japón, las enzimas están reguladas por el Ministerio de Salud, Trabajo y
Seguridad Social del país, donde todas las enzimas se consideran aditivos alimentarios y
solo deben aprobarse aquellas que no figuran en la lista.
Australia / Nueva Zelanda:

En estos países, las enzimas están reguladas por el Código de Normas Alimentarias,
donde todas las enzimas se consideran coadyuvantes de proceso y también necesitan
aprobación previa antes de la venta.
Utilizan las mismas evaluaciones de seguridad europeas y las enzimas se enumeran 291
según su clase y fuente.
26.5 - REFERENCIAS
― ANVISA - CONSULTA PÚBLICA; Reglamento técnico sobre el uso de enzimas y preparados enzimáticos
en la producción de alimentos destinados al consumo humano, nº 93, 21/12/2005.
― ORANDO, DP; Cuestiones reglamentarias de las enzimas utilizadas en los alimentos desde la perspectiva del
mercado de la UE.
Taller de enzimas industriales para la producción de alimentos: perspectivas pasadas, presentes y futuras,
2002.
― SOUZA, LH; SOMMER, PSM; Enzimas industriales en la producción de alimentos: perspectivas pasadas,
presentes y futuras. Jornal da ANBIO, 2 (7), 6-7, 2002.
― Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA); Alimentos, medicamentos y cosméticos
federalesActuar, actualizado el
31/12/2004.
― ZEMAN, NW; Normativa de enzimas utilizadas en alimentos en el Taller de evaluación de enzimas
industriales para la producción de alimentos de la Unión Europea (UE): perspectivas pasadas, presentes y
futuras, 2002.
http://www.anbio.org.br/english/worksh42.htm
http://www.anbio.org.br/english/worksh44.htm
http://www.fda.gov/opacom/laws/fdcact/fdctoc.htm
292
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
― AIBA, S.; HUMPREY, AE; MILLIS, NF; Ingeniería bioquímica, Tokio, University Tokyo Press, 1973.
― BAILLEY, JE; OLLIS, DF; Fundamentos de la ingeniería bioquímica, McGraw - Hill Book Company, Nueva
York, 1986.
― BLANCH, HW; CLARK, DS; Ingeniería bioquímica, Marcel Dekker Inc, Nueva York, 1997.
― PELCZAR, MJ; CHAN, ECS; KRIEG, NR .; Microbiología, conceptos y aplicaciones, McGraw-Hill, Inc.,
Nueva York, 1993
― SIKYTA, B.; Métodos en microbiología industrial, Ellis Horwood Limited, 1983.
― SALOMONES, GL; Materiales y métodos de fermentación, Academic Press, Londres, 1969.
― WANG, DIC; COONEY, CL; DEMAIN, AL; DUNNIL, P.; HUMPREY, AE; LILLY, MD;
Tecnología de fermentación y enzimas, John Wiley & Sons, Inc.; Nueva York, 1984.
REVISTAS Y REVISTAS
― Avances en microbiología aplicada

― Avances en biotecnología bioquímica
― Avances en ingeniería bioquímica
― Microbiología y biotecnología aplicadas
― Ingeniería de Tecnología de Microbiología Bioquímica
― Ingeniería de bioprocesos
― Biotecnología y Bioingeniería
― Cartas de biotecnología
― Técnicas biotecnológicas
― Revista Brasileña de Ingeniería Bioquímica
― Microbiología y tecnología enzimática
― Journal of Bioscience Bioengineering
293
― Revista de biotecnología
― Revista de tecnología de fermentación
― Bioquímica de procesos
294

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TECNOLOGÍA

MARIA ALICE ZARUR COELHO ANDRÉA

CAPÍTULO 25 - OTROS APLICACIONES ............................................................ 279

Desde un punto de vista industrial, las enzimas tienen características

1.2.1 - Respecto a la forma de uso

3er grupo - La enzima es el producto que se vende, normalmente, combinado con

1.2.3 - Modo de acción

1.2.4 - Reacción química catalizada

En 1998, las ventas mundiales de enzimas acumularon más de US $ 1.500

1.4 - PRINCIPALES TIPOS Y USOS INDUSTRIALES

1.5 - INNOVACIONES INDUSTRIALES

Cada enzima es una secuencia única de aminoácidos que genera miles de

Figura 1 - Modelo con cerradura de llave

En 1958, Daniel E. Koshland Jr. postuló un modelo llamado ajuste inducido,

Figura 2 - Modelo de ajuste inducido

(1) S + EES * (paso reversible)

La enzima tiene la característica de disminuir la energía de activación

Se puede dar un ejemplo numérico de esta ecuación, considerando una

Progreso de la reacción (t)

2.2.1 - Catálisis covalente

Las coenzimas piridoxal fosfato y tiamina pirofosfato funcionan

2.2.2 - Catálisis ácido-básica

Figura 5 - Catálisis ácido-base

2.2.3 - Catálisis de iones metálicos

2.2.4 - Catálisis de aproximación y orientación

2.3 - MODELOS CINÉTICOS

2.3.1 - Con un solo sustrato

Dividiendo la ecuación 2 por [E] t usando las ecuaciones 3 y 4, tenemos:

En el gráfico anterior, se definieron dos regiones de modelos cinéticos

Para determinar los parámetros cinéticos KM y Vm, la región ideal sería la

1/v Con inhibidor

1 K METRO  [I]  1 1 [I] 

2.3.2 - Con más de un sustrato

Aplicaciones de inhibición de enzimas

2.4 - FACTORES QUE INFLUYEN EN LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS

2.4.1 - Concentración de sustrato

2.4.2 - Selección de sustrato

Los valores de las constantes de equilibrio se pueden obtener analizando las

Figura 6 - Perfiles de actividad enzimática x

2.4.6 - Actividad acuática

2.4.8 - Estabilidad enzimática

 [NORTE] − [NORTE min ] 

2.5 - DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

2.5.1 - Definición y Unidades

2.5.2 - Análisis cuantitativo de la actividad enzimática

2.5.3 - Técnicas utilizadas

En esta ecuación, la ley de Lambert-Bier es válida para todas las especies

2.5.3.2 - Métodos de detección electroquímica

2.5.3.3 - Otros métodos de detección

Comercialmente, una enzima puede ser una preparación que, además de la

3.1.1 - Enzimas tisulares

3.1.1.1 - Principales enzimas de origen animal

La tripsina presente en el duodeno inicia la activación de enzimas.

La temperatura se eleva a 40-45 ° C durante 1 h (el pepsinógeno se convierte en pepsina)

El tejido no digerido se filtra y se seca en un secador de vacío a 40 ° C

Filtración y secado a baja temperatura

3.1.1.2 - Enzimas de origen vegetal

3.1.2 - Enzimas microbianas

3.1.2.1 - Etapa aguas arriba

Los procesos de fermentación aguas arriba son pocos en el caso de la

3.1.2.2 - Cinética de producción de metabolitos

Figura 2 - Síntesis de enzimas en función del crecimiento microbiano.

3.1.2.3 - Medios de cultivo