PARTE II: REVISIN DE MTODOS ESPECTROSCPICOS Y

ELABORACIN DE CURVA ESTNDAR DE PROTENA

Objetivos
Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir la concentracin de
una protena.
Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotmetros.
Construir curvas de calibracin y comprender su importancia.
Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estndar.
Comparar el intervalo de sensibilidad de dos mtodos para determinar
protenas
It!o"#$$i%
El espectrofotmetro es un instrumento ampliamente utilizado en el anlisis
cualitativo y cuantitativo de molculas biolgicas. arte de la identificacin de
una molcula se determina por el trazado del es&e$t!o "e 'bso!$i% !A en
funcin de la longitud de onda " en la regin visible y ultravioleta. #ientras $ue
la cuantificacin de la misma se puede realizar de manera "i!e$t' !si la
sustancia absorbe en alguna regin del espectro" o i"i!e$t' !por modificacin
del compuesto mediante una reaccin $umica".
Le(es )#e !i*e +' es&e$t!o,oto-et!.'
Cuando un %az luminoso de intensidad
&
pasa a travs de una solucin' parte
de ste se absorbe' por lo tanto la intensidad de la radiacin emergente es
menor al incidente
&
. (a relacin entre ambos se denomina t!'s-it'$i'' )*

)+ ,
&
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . !-"
(a cantidad de luz absorbida es proporcional al n.mero / de iones o molculas
capaces de absorber energa0 por lo tanto' ) disminuye a medida $ue la
concentracin aumenta.
Le( "e L'-be!t ( Bee!' conocida generalmente como (ey de 1eer' considera
$ue al dividirse la disolucin en pe$ue2as secciones' en cada una de ellas se
absorber una pe$ue2a cantidad de radiacin ' $ue es proporcional a /.
)omando en cuenta $ue / es directamente proporcional a la concentracin y
si la longitud por la $ue pasa el %az de luz !longitud de la celda" es constante'
podemos llegar a la ecuacin general*
3log ,
&
+ abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . !4"
donde:
c es la concentracin
b es la longitud de la celda o paso ptico
a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad
(a 'bso!tivi"'" o $oe,i$iete "e e/ti$i% es una caracterstica propia de
cada especie y depende de la estructura $umica de sta. El valor de la
absortividad para un compuesto vara con la longitud de onda. Definiendo $ue
la relacin 3log

,
&
es la 'bso!b'$i' de la solucin' la ecuacin final $ue
define a la ley de 1eer $ueda de la siguiente manera*
A

+ a

bc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . !5"
Es importante mencionar $ue la constante de proporcionalidad a depende de la
longitud de onda por ello se le coloca el superndice as como tambin a la
absorbancia A !ec. 5". 6i la concentracin se e7presa en molaridad' entonces
se denomina a la constante de proporcionalidad $oe,i$iete "e 'bso!tivi"'"
-o+'! o coeficiente de e7tincin !". Convencionalmente' el paso de la luz es
de - cm' por lo $ue entonces las unidades de son cm
3-
mol
3-
(. 8ay $ue
destacar $ue A es adimensional' ya $ue por definicin es un ndice.
9na grfica de absorbancia de una especie en disolucin' a una longitud de
onda dada' como una funcin de su concentracin molar' se le llama $#!v' "e
$'+ib!'$i% o $#!v' est0"'!. Es una lnea recta y de acuerdo a la ecuacin 5
la pendiente es b. Conociendo y la longitud del paso de la luz b' la
concentracin de la sustancia en cual$uier otra muestra puede ser determinada
usando la (ey de 1eer. (a cuantificacin de la especie debe realizarse a la
longitud de m7ima absorcin.
Dete!-i'$i% "e &!ote.'s
Dos aplicaciones comunes de la determinacin de protenas son* -" para
reportar la actividad especfica de una enzima y 4" para %acer un cargado
%omogneo de protena en geles de poliacrilamida36D6. Dado $ue %ay varios
mtodos para medir protenas totales' :Cmo se escoge entre estos mtodos;
<eneralmente se selecciona de acuerdo a su aplicacin. or ejemplo' para el
clculo de la actividad enzimtica' el principal propsito es tener e7actitud en
los resultados' mientras $ue para colocar cantidades iguales de protena en un
gel de poliacrilamida36D6' la precisin es ms importante.
C#'ti,i$'$i% "e &!ote.'s &o! e+ -1to"o $o+o!i-1t!i$o "e Lo2!(3 El
ensayo de determinacin de protenas por (o=ry es uno de los ms usados en
1io$umica. Cuando a un pptido o protena en disolucin bsica se le %ace
reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por coordinacin entre
los nitrgenos del pptido con el in metlico. En el mtodo de (o=ry el
reactivo de >olin3Ciocalteu !fosfomolibdato.fosfotungstato" se a2ade para
incrementar la cantidad de color desarrollado. El aumento en el color ocurre
cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo
fosfomolibdato, fosfotungstato' reaccin $ue produce una coloracin azul $ue
se lee a ?@& nm. (a reduccin del reactivo de >olin3Ciocalteu ocurre solamente
con los residuos de tirosina y triptfano de la protena.
M'te!i'+ ( e)#i&o
Celdas de metacrilato grado 9A para espectrofotmetro
)ubos de microfuga
- gradilla para tubos de microfuga
- caja con puntas de 4&& ( !amarillas" para micropipeta.
- caja con puntas de -&&& ( !azules" para micropipeta.
- #icropipeta -& (
- #icropipeta 4&34&& (
- #icropipeta 4&&3-&&& (
Arte7
Espectrofotmetro !por grupo"
Re'$tivos
Alb.mina de suero bovino o 16A.
6olucin problema de protenas !los profesores la proporcionarn"
Disolucin de carbonato3tartrato3cobre !C)C". Aer composicin en
apndice.
-&B Dodecilsulfato de sodio !6D6"
&.C / /aD8
8
4
D
Re'$tivo A3 6e prepara inmediatamente antes de usarse con partes
iguales de C)C' -&B 6D6' &.C / /aD8 y 8
4
D.
Re'$tivo B3 Dilucin del reactivo de >olin Ciocalteu. - volumen de >olin
E @ vol.menes de 8
4
D. <uardar en frasco mbar. reparar
preferentemente poco antes de usarse.
Des'!!o++o e/&e!i-et'+
Dete!-i'$i% "e &!ote.'s &o! e+ -1to"o "e Lo2!(3
-. Fotular los tubos de vidrio y adicionar los reactivos en el orden $ue se
indica en la )abla -.4. Fecuerda* debes mezclar con el vrte7 despus
de a2adir cada una de las disoluciones.
2. Encender el espectrofotmetro' seleccionar la de ?@& nm.
5. 9tilizar las celdas de plstico para realizar las mediciones.
G. Ajustar el espectrofotmetro con la disolucin del primer tubo de la tabla
!sin 16A".
@. Fealizar las lecturas.
H. (lenar la tabla con los datos de absorbancia.
7. Construir la grficas de absorbancia vs concentracin de protena !g".
C. Calcular la concentracin de la protena en la muestra
Tabla 1.1. Reactivos y cantidades a aadir para realizar una curva patrn de BSA y la determinacin de la
concentracin de protenas de una muestra problema, utilizando el mtodo de Lory para su
determinacin!
Tubo H
2
O BSA
(1mg/mL)
Muestra
Problema*
Reactio A Reactio B
I

$
#
b
'
!

'

t
e
-
&
e
!
'
t
#
!
'

'
-
b
i
e

t
e

&
o
!

4
5

-
i

#
t
o
s
A
!"#m
Prote$%a*
(g)
- G@&
(
@&& ( 4@& (
4 GG@
(
@ ( @&& ( 4@& (
5 GG&
(
-& ( @&& ( 4@& (
G G5@
(
-@ ( @&& ( 4@& (
@ G5&
(
4& ( @&& ( 4@& (
H G4@
(
4@ ( @&& ( 4@& (
? G4&
(
5& ( @&& ( 4@& (
C G-@
(
5@ ( @&& ( 4@& (
I G4@
(
4@ ( @&& ( 4@& (
-& G&&
(
@& ( @&& ( 4@& (
" La muestra problema la preparar#n y entregar#n los pro$esores!
"" %alcular la cantidad de protena &ue contiene cada tubo de acuerdo a los L &ue se aadieron del
est#ndar de BSA! ' en el caso de la muestra problema utilizando los datos de la regresin de la
curva est#ndar generada!
C#estio'!io
-. E7plica $u tipo de factores contribuyen en la desviacin de la lnea
recta al graficar la absorbancia contra concentracin !desviaciones a la
ley de 1eer".
4. :cules son los principales mtodos colorimtricos usados en la
determinacin de protenas;
5. :Ju sustancias pueden interferir con la determinacin de protenas por
(o=ry;
G. Knvestiga cual de los siguientes mtodos es ms sensible y menos
costoso para determinar la concentracin de protenas de una muestra*
(o=ry' Absorbancias 4C& nm y 1radford.
@. De acuerdo a tus resultados' :cul es el intervalo en el $ue se podra
determinar la concentracin de una protena en una muestra utilizando la
curva estndar de determinacin de protenas por (o=ry; Da una
e7plicacin.
H. :Cules son las aplicaciones en general de una curva de calibracin o
estndar;
Re,e!e$i's
#aniatis )' >ritsc% E>' 6ambrooL M. -IC4. #olecular cloning a laboratory
manual. Cold 6pring 8arbor (aboratory' Cold 6prings 8arbor' /N.
6tosc%ecL C#. Juantitation of rotein. -II&. #et%ods in Enzymology
-C4' @&3HI.
eterson <(. -I??. A simplification of t%e protein assay met%od of (o=ry
et al. =%ic% is more generally applicable. Analytical 1ioc%emistry C5'
5GH35@H.

Oang' N.' et al. 4&&?. Juantitative analyses reveal t%e importance of
regulated 8dm7 degradation for @5 activation. /A6' !-&G". 5&' -45H@3
-45?&.